뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작
Summary
마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.
Abstract
간은 포유류에서 가장 큰 기관입니다. 그것은 포도 당 저장에 중요 한 역할을, 단백질 분 비, 신진 대사 와 해독. 간 기능의 대부분에 대 한 집행자로, 기본 간 세포는 제한 된 증식 용량. 이것은 간 생리및 병리학 연구를 위한 ex vivo 간세포 확장 모형의 설치를 요구합니다. 여기서, 우리는 콜라게나아제 관류의 두 단계로 뮤린 간세포를 분리하고 세포 세포 상호 작용 및 물리적 기능을 재구성하는 ‘미니 간’으로 3D 오르간 배양을 확립했습니다. 오르가노이드는 선조와 성숙한 간세포를 포함하는 이기종 세포 집단으로 구성됩니다. 우리는 2-3 주 이내에 오르가노이드를 형성하기 위해 뮤린 간세포 또는 태아 간구를 분리하고 배양하고 기계적으로 위아래로 피펫을 하여 통과하는 방법을 보여주는 세부적인 과정을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 shRNA / ectopic 건설, siRNA 트랜스페션 및 CRISPR-Cas9 공학의 렌즈 바이러스 감염을 위한 단하나 세포로 오르가노이드를 소화하는 방법을 소개할 것입니다. 오르가노이드는 간 생물학 및 병리학을 모델링하여 약물 화면, 질병 모델링 및 기본 간 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
오르가노이드는 자가 재생 줄기 세포 및 다중 계면 분화 세포를 포함하는 체외 클러스터에서 자체 조직, 3차원 (3D)입니다1,2. 많은 장기의 오르가노이드는 장, 뇌, 결장, 신장, 간, 췌장, 갑상선, 위, 피부 및 폐3,4,5,6,7을 포함하여 잘 정의 된 틈새 요인에 의해 만능 또는 성인 줄기 세포에서 확립되었습니다. . 오르가노이드는 질병 연구 및 치료에서 새로운 길을 열어주는 개발 (배아 또는 유도 된 만능 줄기 세포, PSC에서 유래) 또는 항상성 / 재생 진행 (성인 줄기 세포, ASC에서 유래)을 모방하여 물리적 세포 기능을 재구성8,9.
포유류에서 가장 큰 기관으로, 간은 주로 저장에 대 한 책임, 신진 대사와 해독. 상피 세포 유형의 두 종류, 간세포 및 담고고, 간 소리의 기본 단위를 구성. 간 세포는 간 기능10의 70-80 %에 대한 책임이 있습니다. 간은 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 간세포 기능의 급속한 손실은 소화 조절 세포 편광과 디차별화에 의해 전통적인 단층 배양 하는 동안 발생, 이는 접시에 ‘갭 브리징’간 모델을 구축 하는 연구원과 임상의의 필요성을 증가. 그러나, 최근까지 1차 간세포에서 의 전 생체 확장 모델은 잘 확립되지 않았다11,12,13,14,15. 간 오르가노이드는 배아 /유도 만능 줄기 세포, 섬유 아세포 변환에서 간세포와 같은 세포, 및 조직 유래 세포에서 확립 될 수있다. 간 오르가노이드의 개발은 약물 화면 및 간 독성 에 대한 체외 모델의 적용을 향상16,17.
여기에서, 우리는 뮤린 1 차 간 세포에서 간 오르가노이드를 확립하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 콜라게나아제의 두 번의 관류를 가진 간세포 오르가노이드의 체외 배양 시스템을 설정했습니다. 이 오르가노이드는 몇 달 동안 장기 확장을 위해 통과 될 수 있습니다. 그들의 생리 적 기능은 간세포와 매우 일치합니다. 또한, 우리는 또한 렌티 바이러스 감염, siRNA 트랜스듀션 및 ORGANoids를 사용하여 CRISPR-Cas9 공학과 같은 유전 적 조작을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 간 세포 구가노이드의 전파는 간 생물학을 이해하고 개인화된 및 번역 의학 접근을 개발하기 위하여 오르가노이드를 사용하는 가능성에 빛을 비추었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오랜 기간 동안 성숙한 간세포를 배양하는 능력은 간 기초 과학, 약물 독성학 및 말라리아 및 간염 바이러스와 같은 간 세포 – 미생물학 감염을 연구하는 데 기본적입니다. 잘 정의된 틈새 시장을 통해 이 프로토콜은 간세포에 대한 문화 시스템을 설정합니다. 이 프로토콜은 성숙한 간세포가 세포 세포 상호 작용, 대부분의 간세포 기능 및 유전자 변형을 재구성하는 이질성으로 3D 배양에서 확장하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
한스클레스 교수님이 재조합 R-spondin1을 생성하기 위해 세포주를 친절하게 제공한 것에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 키 R&D 프로그램(2019YFA0111400), 중국 국립자연과학재단(31970779)에서 H.H.H.에 이르는 보조금, 산둥대학교 청소년학혁신연구그룹(2020QNQT003)의 지원으로 지원되었다.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
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