Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini
Summary
Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall’infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.
Abstract
Il fegato è l’organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo importante nella conservazione del glucosio, nella secrezione proteica, nel metabolismo e nella disintossicazione. Come esecutore per la maggior parte delle funzioni epatiche, gli epatociti primari hanno una capacità proliferante limitata. Ciò richiede l’istituzione di modelli di espansione epatocitaria ex vivo per la ricerca fisiologica e patologica epatica. Qui, abbiamo isolato gli epatociti murini mediante due fasi di perfusione di collagenasi e stabilito una coltura organoide 3D come “mini-fegato” per ricapitolare le interazioni cellula-cellula e le funzioni fisiche. Gli organoidi sono costituiti da popolazioni cellulari eterogenee tra cui progenitori ed epatociti maturi. Introduciamo il processo in dettaglio per isolare e coltivare gli epatociti murini o gli epatociti fetali per formare organoidi entro 2-3 settimane e mostriamo come passarli con il pipettaggio meccanico su e giù. Inoltre, introdurremo anche come digerire gli organoidi in singole cellule per l’infezione da lentivirus di costruzione shRNA / ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9. Gli organoidi possono essere utilizzati per schermi farmacologici, modelli di malattie e ricerca epatica di base modellando la biologia epatica e la patobiologia.
Introduction
Gli organoidi sono cluster in vitro auto-organizzati, tridimensionali (3D) che includono cellule staminali auto-rinnovanti e cellule differenziate multi-linea1,2. Gli organoidi di molti organi sono stati stabiliti da cellule staminali pluripotenti o adulte da fattori di nicchia ben definiti tra cui l’intestino, il cervello, il colon, il rene, il fegato, il pancreas, la tiroide, lo stomaco, la pelle e il polmone3,4,5,6,7 . Gli organoidi ricapitolano le funzioni fisiche delle cellule imitando lo sviluppo (originato da cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, PSC) o la progressione dell’omeostasi/rigenerazione (originata da cellule staminali adulte, ASC), che apre nuove strade nella ricerca e nella terapia delle malattie8,9.
Essendo il più grande organo dei mammiferi, il fegato è principalmente responsabile della conservazione, del metabolismo e della disintossicazione. Due tipi di cellule epiteliali, epatociti e colangiociti, costruiscono l’unità di base di un lobulo epatico. Gli epatociti sono responsabili del 70-80% della funzionalità epatica10. Sebbene il fegato abbia una notevole capacità di rigenerazione, la rapida perdita delle caratteristiche degli epatociti si verifica durante la tradizionale coltura monostrato mediante polarizzazione cellulare disregolata e dedifferenziazione, il che aumenta la necessità di ricercatori e medici di costruire modelli epatici “gap-bridging” in un piatto. Tuttavia, fino a poco tempo fa i modelli di espansione ex vivo degli epatociti primari non erano stati ben stabiliti11,12,13,14,15. Gli organoidi epatici possono essere stabiliti da cellule staminali pluripotenti embrionali / indotte, conversione dei fibroblasti in cellule simili agli epatociti e cellule derivate dai tessuti. Lo sviluppo di organoidi epatici stimola l’applicazione di un modello in vitro per screening farmacologici e saggi di tossicità epatica16,17.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per stabilire organoidi epatici da epatociti primari murini. Utilizzando questo protocollo, abbiamo creato un sistema di coltura in vitro di organoidi epatocitari con due perfusioni di collagenasi. Questi organoidi possono essere passati per un’espansione a lungo termine per mesi. La loro funzione fisiologica è altamente coerente con gli epatociti. Inoltre, forniamo anche una descrizione dettagliata di come eseguire la manipolazione genetica, come l’infezione da lentivirus, la trasduzione del siRNA e l’ingegneria CRISPR-Cas9 utilizzando organoidi. La propagazione degli organoidi epatocitari fa luce sulla possibilità di utilizzare gli organoidi per comprendere la biologia epatica e sviluppare approcci di medicina personalizzati e traslazionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di coltivare epatociti maturi per lunghi periodi è fondamentale nello studio della scienza di base del fegato, della tossicologia dei farmaci e delle infezioni epatotropiche di microbiologia dell’ospite come la malaria e i virus dell’epatite. Con una nicchia ben definita, il protocollo qui imposta un sistema di coltura per gli epatociti. Questo protocollo spinge gli epatociti maturi ad espandersi in coltura 3D con un’eterogeneità che ricapitola l’interazione cellula-cellula, la maggior parte delle funzioni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il professor Hans Clevers per aver gentilmente fornito le linee cellulari per produrre R-spondin1 ricombinante. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), della National Natural Science Foundation of China (31970779) a H.H. e del Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group della Shandong University (2020QNQT003) a H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
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