Etablering og genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider

Summary

Et langsiktig ex vitro 3D organoid kultursystem ble etablert fra musen hepatocytter. Disse organoidene kan passeres og genetisk manipuleres ved lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid.

Abstract

Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller en viktig rolle i glukoselagring, proteinsekresjon, metabolisme og avgiftning. Som eksekutor for de fleste leverfunksjonene har primære hepatocytter begrenset spredningskapasitet. Dette krever etablering av ex vivo hepatocyte ekspansjonsmodeller for leverfysiologisk og patologisk forskning. Her isolerte vi murine hepatocytter med to trinn collagenase perfusjon og etablerte en 3D organoid kultur som “mini-leveren” for å rekapitulere cellecelleinteraksjoner og fysiske funksjoner. Organoidene består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert forfedre og modne hepatocytter. Vi introduserer prosessen i detalj for å isolere og kultur murine hepatocytter eller føtal hepatocytt for å danne organoider innen 2-3 uker og vise hvordan du passerer dem ved mekanisk pipettering opp og ned. I tillegg vil vi også introdusere hvordan du fordøyer organoidene i enkeltceller for lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid. Organoidene kan brukes til legemiddelskjermer, sykdomsmodellering og grunnleggende leverforskning ved modellering av leverbiologi og patobiologi.

Introduction

Organoider er selvorganiserte, tredimensjonale (3D) in vitro-klynger som inkluderer selvfornyende stamceller og flerlinjede differensierte ^celler1,2. Organoidene i mange organer har blitt etablert enten fra pluripotente eller voksne stamceller av veldefinerte nisjefaktorer, inkludert tarmen, hjernen, tykktarmen, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, skjoldbruskkjertelen, magen, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoidene rekapitulerer fysiske cellefunksjoner ved å etterligne enten utvikling (stammer fra embryonale eller induserte pluripotente stamceller, PSCer) eller homeostase/regenereringsprogresjon (stammer fra voksne stamceller, ASC), som åpner nye veier i sykdomsforskning og ^terapi8,9.

Som det største organet i pattedyr er leveren hovedsakelig ansvarlig for lagring, metabolisme og avgiftning. To typer epitelceller, hepatocytter og cholangiocytter, konstruerer den grunnleggende enheten av en leverlobul. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% ^{leverfunksjon10}. Selv om leveren har bemerkelsesverdig regenereringskapasitet, skjer raskt tap av hepatocyttfunksjoner under tradisjonell monolayerkultur ved dysregulert cellepolarisering og dedifferentiasjon, noe som øker behovet for forskere og klinikere for å bygge “gap-brobygging” levermodeller i en tallerken. Inntil nylig hadde imidlertid ex vivo-utvidelsesmodellene fra primære hepatocytter ikke blitt godt ^{etablert11,12,13,14,15}. Leverorganoider kan etableres fra embryonale/induserte pluripotente stamceller, fibroblastkonvertering til hepatocyttlignende celler og vevsavledede celler. Utviklingen av leverorganoider øker anvendelsen av en in vitro-modell for legemiddelskjermer og levertoksisitetsanalyser16,17.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for etablering av leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved å bruke denne protokollen setter vi opp et in vitro kultursystem av hepatocytt organoider med to perfusjoner av kollagenalus. Disse organoidene kan passeres for langsiktig ekspansjon i flere måneder. Deres fysiologiske funksjon er svært konsistent med hepatocytter. Videre gir vi også en detaljert beskrivelse av hvordan man utfører genetisk manipulasjon, for eksempel lentivirusinfeksjon, siRNA-transduksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid ved hjelp av organoider. Forplantningen av hepatocyttorganoider kaster lys over muligheten for å bruke organoider for å forstå leverbiologi og utvikle personlige og translasjonelle medisintilnærminger.

Protocol

Alle museeksperimenter ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved School of Basic Medical Sciences ved Shandong University og ble utført i henhold til lisensen i henhold til hjemmekontor retningslinjer og forskrifter (Nei. ECSBMSSDU2019-2-079). MERK: Denne protokollen brukes hovedsakelig til å dyrke 3D-organoider fra isolerte primære hepatocytter. 1. Etablering av Murine Hepatocyte Organoid Culture MERK: Ekstracellulær matrise som …

Representative Results

Hepatocytt organoider fra kvinnelige Alb-Cre; Rosa26-GFP-mus (8 uker) ble observert fem dager etter sådd (figur 1A). Organoidene sprer seg med Ki67 positiv farging (figur 1B). Forstyrrende uttrykk for representative gener i hepatocyttorganoider enten ved siRNA-transfeksjon eller lentivirusinfeksjon ble undersøkt av qRT-PCR og vestlig blot. Resultatene er vist i figur 2A og 2B. Figur 2C</strong…

Discussion

Evnen til å dyrke modne hepatocytter over lange perioder er grunnleggende for å studere leverens grunnleggende vitenskap, narkotikatoksikologi og hepatotrope vertsmikrobiologiske infeksjoner som malaria og hepatittvirus. Med en veldefinert nisje setter protokollen her opp et kultursystem for hepatocytter. Denne protokollen driver modne hepatocytter til å ekspandere i 3D-kultur med en heterogenitet som rekapitulerer cellecelleinteraksjon, de fleste hepatocyttfunksjon og genetiske modifikasjoner, slik at utformingen av …

Materials

Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C