في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر
Summary
نحن نصف هنا طريقة تصوير الخلايا الضخمة واللوحات في نخاع عظم الجمجمة للفئران الحية باستخدام المجهر ثنائي فوتون.
Abstract
يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة ، وهي خلايا متخصصة تقع في نخاع العظام. تم وصف إمكانية تصوير الخلايا الضخمة في الوقت الحقيقي وبيئتهم الأصلية منذ أكثر من 10 سنوات وتلقي ضوءا جديدا على عملية تكوين الصفائح الدموية. تمتد الخلايا الضخمة نتوءات ممدودة ، تسمى الصفائح ، من خلال البطانة البطانية للأوعية الجيبية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للصورة المتزامنة في الوقت الحقيقي للخلايا الضخمة المسماة بالفلورسنت في نخاع عظم الجمجمة والأوعية الجيبية. تعتمد هذه التقنية على جراحة بسيطة تحافظ على الجمجمة سليمة للحد من ردود الفعل الالتهابية. يتم شل رأس الماوس مع حلقة لصقها على الجمجمة لمنع الحركات من التنفس.
باستخدام المجهر ثنائي الفوتون ، يمكن تصور الخلايا الضخمة لمدة تصل إلى بضع ساعات ، مما يتيح مراقبة نتوءات الخلايا واللوحات الأولية في عملية الاستطالة داخل الأوعية الجيبية. وهذا يسمح للقياس الكمي لعدة معلمات تتعلق مورفولوجيا نتوءات (العرض والطول ووجود مناطق الانقباض) وسلوك استطالة (السرعة والانتظام ، أو وجود وقفات أو مراحل التراجع). تسمح هذه التقنية أيضا بالتسجيل المتزامن للصفائح الدموية المتداولة في الأوعية الجيبية لتحديد سرعة الصفائح الدموية واتجاه تدفق الدم. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة دور الجينات ذات الاهتمام في تكوين الصفائح الدموية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا وهي أيضا قابلة للاختبار الدوائي (دراسة الآليات وتقييم الأدوية في علاج اضطرابات إنتاج الصفائح الدموية). وقد أصبح أداة لا تقدر بثمن، وخاصة لاستكمال الدراسات المختبرية كما هو معروف الآن أن في الجسم الحي وفي المختبر تشكيل البربليتليت تعتمد على آليات مختلفة. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن هناك حاجة إلى microtubules في المختبر لاستطالة proplatelet في حد ذاتها. ومع ذلك ، في الجسم الحي، فإنها تعمل بدلا من ذلك سقالة ، ويجري تعزيز الاستطالة بشكل رئيسي من قبل قوات تدفق الدم.
Introduction
يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة خلايا متخصصة في الخلايا الضخمة الموجودة في نخاع العظام. ظلت الطريقة الدقيقة لإطلاق الخلايا الضخمة الصفائح الدموية في الدورة الدموية غير واضحة منذ فترة طويلة بسبب التحدي التقني في مراقبة الأحداث في الوقت الحقيقي من خلال العظام. وقد ساعد المجهر ثنائي فوتون في التغلب على هذا التحدي وأدى إلى تقدم كبير في فهم عملية تكوين الصفائح الدموية. أول في الجسم الحي megakaryocyte الملاحظات التي أدلى بها فون أندريان وزملاؤه في عام 2007 ، مع تصور megakaryocytes الفلورسنت من خلال الجمجمة1. وكان ذلك ممكنا لأن طبقة العظام في الجمجمة الأمامية للفئران البالغة الشباب لديها سمك بضع عشرات من الميكرونات وشفافة بما فيه الكفاية للسماح تصور الخلايا الفلورية في نخاع العظام الكامنة2.
الدراسات التي تلت ذلك تطبيق هذا الإجراء لتقييم تشكيل البروبليت في ظل ظروف مختلفة وفك الآليات الأساسية3،4،5،6. قدمت هذه الدراسات دليلا قاطعا على أن الخلايا العملاقة توسع بشكل ديناميكي نتوءات ، تسمى الصفائح ، من خلال الحاجز البطاني للأوعية الجيبية(الشكل 1). ثم يتم تحرير هذه الصفائح الدموية كشظايا طويلة تمثل عدة مئات من الصفائح الدموية في الحجم. سيتم تشكيل الصفائح الدموية بعد إعادة عرض الصفائح في دوران الأوعية الدقيقة لأعضاء المصب ، ولا سيما في الرئتين7. غير أن العملية الدقيقة والآليات الجزيئية لا تزال حتى الآن موضع نقاش. على سبيل المثال ، يختلف الدور المقترح للبروتينات الهيكل الخلوي في استطالة الصفائح الدموية بين المختبر وفي ظروف الجسم الحي 3، وقد أظهرت الاختلافات في تكوين البروبليتليت في ظل الظروف الالتهابية6. ومما يزيد الأمور تعقيدا، أن دراسة حديثة اعترضت على المفهوم القائم على البربليتليت واقترحت أنه في الجسم الحي،تتشكل الصفائح الدموية بشكل أساسي من خلال آلية ناشئة عن الأغشية على مستوى الخلايا العملاقة8.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لمراقبة الخلايا العملاقة واللوحات البربليتية في نخاع العظم من عظم الجمجمة في الفئران الحية ، باستخدام إجراء طفيف التوغل. وقد وصفت نهج مماثلة سابقا لتصور خلايا النخاع الأخرى, لا سيما الجذعية الدموية والخلايا السلف9. ينصب التركيز هنا على مراقبة الخلايا الضخمة والصفائح الدموية لتفصيل بعض المعلمات التي يمكن قياسها ، ولا سيما مورفولوجيا الصفائح الدموية وسرعة الصفائح الدموية. يقدم هذا البروتوكول كيفية إدخال قسطرة في الوريد الوداجي لحقن المقتفيات الفلورية والمخدرات ومراقبة من خلال عظم الجمجمة. يتم الكشف عن عظم الجلجلة باستخدام جراحة بسيطة بحيث يتم لصقها على حلقة إلى العظام. يعمل هذا الخاتم على شل حركة الرأس ومنع الحركات بسبب التنفس وتشكيل كوب مليء بالمحلول الملحي كوسيلة غمر للعدسة. هذه التقنية هي مناسبة تماما ل i) مراقبة في الوقت الحقيقي هندسة الجيوب الأنفية وmegakaryocytes التفاعل مع جدار السفينة. ii) اتبع megakaryocytes في عملية تشكيل البروبليت، استطالة، والإفراج؛ و3) قياس حركات الصفائح الدموية لرصد تدفق الدم الجيوب الأنفية المعقدة. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول تم نشرها مؤخرا3.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد آليات تكوين الصفائح الدموية بشكل كبير على بيئة نخاع العظم. ومن ثم، أصبح الفحص المجهري داخل الفيتية أداة هامة في الميدان لتصور العملية في الوقت الحقيقي. يمكن الحصول على الفئران ذات الخلايا الضخمة الفلورية عن طريق عبور الفئران التي تعبر عن إعادة دمج Cre في الخلايا الضخمة مع أي فئران مرا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا فلوريان غايرتنر (معهد العلوم والتكنولوجيا في النمسا، كلوستيرنيوبورغ، النمسا) على مشورته الخبيرة بشأن تجارب المجهر ثنائي الفوتون في الوقت الذي أنشأنا فيه هذه التقنية في المختبر، وإيف لوتز في مركز التصوير IGBMC/CBI (إيلكيرش، فرنسا) على خبرته ومساعدته في المجهر ذو الفوتونين. كما نشكر جان إيف رينكل على مساعدته التقنية وإينس غينار على رسم المخطط في الشكل 1. ونشكر جمعية منظمة أطباء بلا حدود ومنظمة سانت بوبليك على دعمها في اقتناء المجهر ثنائي الفوتون. وقد تم دعم AB من خلال زمالات ما بعد الدكتوراه من Etablissement Français du Sang (APR2016) ومن وكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
References
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
