In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels
Summary
Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Abstract
Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert, spezialisierten Zellen im Knochenmark. Die Möglichkeit, Megakaryozyten in Echtzeit und ihre native Umgebung abbilden zu können, wurde vor mehr als 10 Jahren beschrieben und wirft ein neues Licht auf den Prozess der Thrombozytenbildung. Megakaryozyten verlängern längliche Vorsprünge, Pro thrombozyten genannt, durch die Endothelauskleidung von Sinusgefäßen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um gleichzeitig in Echtzeit fluoreszierend markierte Megakaryozyten im Schädelknochenmark und in den Sinusgefäßen abbilden zu können. Diese Technik beruht auf einer kleinen Operation, die den Schädel intakt hält, um Entzündungsreaktionen zu begrenzen. Der Mauskopf wird mit einem Ring immobilisiert, der auf den Schädel geklebt ist, um Bewegungen am Atmen zu hindern.
Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie können Megakaryozyten bis zu einigen Stunden visualisiert werden, was die Beobachtung von Zellvorsprüngen und Blutplättchen im Prozess der Dehnung in Sinusgefäßen ermöglicht. Dies ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Parameter, die sich auf die Morphologie der Vorsprünge (Breite, Länge, Vorhandensein von Verengungsbereichen) und deren Dehnungsverhalten (Geschwindigkeit, Regelmäßigkeit oder Vorhandensein von Pausen oder Rückzugsphasen) beziehen. Diese Technik ermöglicht auch die gleichzeitige Aufzeichnung von zirkulierenden Blutplättchen in sinusförmigen Gefäßen, um die Thrombozytengeschwindigkeit und die Blutflussrichtung zu bestimmen. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Rolle von Genen von Interesse bei der Thrombozytenbildung mit genetisch veränderten Mäusen zu untersuchen und ist auch für pharmakologische Tests (Untersuchung der Mechanismen, Bewertung von Medikamenten bei der Behandlung von Thrombozytenproduktionsstörungen) möglich. Es ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, insbesondere zur Ergänzung von In-vitro-Studien, da heute bekannt ist, dass die In-vivo- und In-vitro-Pro thrombozytenbildung auf verschiedenen Mechanismen beruht. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass in vitro Mikrotubuli für die Thrombozytenverlängerung per se benötigt werden. In vivodienen sie jedoch eher als Gerüst, wobei die Dehnung hauptsächlich durch Blutflusskräfte gefördert wird.
Introduction
Blutplättchen werden von Megakaryozyten-spezialisierten Zellen im Knochenmark produziert. Wie genau Megakaryozyten Blutplättchen im Kreislauf freisetzen, blieb aufgrund der technischen Herausforderung bei der Beobachtung von Echtzeitereignissen durch den Knochen lange unklar. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat dazu beigetragen, diese Herausforderung zu meistern und zu großen Fortschritten beim Verständnis des Thrombozytenbildungsprozesses geführt. Die ersten in vivo Megakaryozytenbeobachtungen wurden von Andrian und Kollegen im Jahr 2007 gemacht, mit der Visualisierung von fluoreszierenden Megakaryozyten durch den Schädel1. Dies war möglich, weil die Knochenschicht im frontoparietalen Schädel junger erwachsener Mäuse eine Dicke von einigen zehn Mikrometern aufweist und ausreichend transparent ist, um die Visualisierung fluoreszierender Zellen im darunter liegenden Knochenmark zu ermöglichen2.
Nachfolgende Studien wandten dieses Verfahren an, um die Pro thrombozytenbildung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten und die zugrunde liegenden Mechanismen3,4,5,6zu entschlüsseln . Diese Studien lieferten definitive Beweise dafür, dass Megakaryozyten Protrusionen, sogenannte Pro thrombozyten, dynamisch durch die Endothelbarriere der Sinusgefäße verlängern (Abbildung 1). Diese Proplättchen werden dann als lange Fragmente freigesetzt, die mehrere hundert Blutplättchen im Volumen darstellen. Die Blutplättchen werden nach dem Umbau der Blutplättchen in der Mikrozirkulation der nachgeschalteten Organe, insbesondere in der Lunge, gebildet7. Bis heute sind der genaue Prozess und die molekularen Mechanismen jedoch weiterhin Gegenstand von Diskussionen. Zum Beispiel unterscheidet sich die vorgeschlagene Rolle der Zytoskelettproteine bei der Verlängerung von Blutplättchen zwischen in vitro und in vivo 3, und Unterschiede in der Pro thrombozytenbildung wurden unter entzündlichen Bedingungen nachgewiesen6. Erschwerend kommt hinzu, dass eine kürzlich durchgeführte Studie das prothrombozytengetriebene Konzept in Betracht stellte und vorschlug, dass in vivoBlutplättchen im Wesentlichen durch einen membranbewegenden Mechanismus auf Megakaryozytenebene gebildet werden8.
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark aus dem Schädelknochen bei lebenden Mäusen mit einem minimalinvasiven Verfahren vor. Ähnliche Ansätze wurden bereits beschrieben, um andere Markzellen zu visualisieren, insbesondere hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen9. Der Fokus liegt hier auf der Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen, um einige Parameter zu beschreiben, die gemessen werden können, insbesondere Prothrombozytenmorphologien und Thrombozytengeschwindigkeit. Dieses Protokoll zeigt, wie man einen Katheter in die Jugularvene einführt, um fluoreszierende Tracer und Medikamente zu injizieren und durch den Schädelknochen zu beobachten. Der Calvarialknochen wird durch eine kleinere Operation freigelegt, so dass ein Ring auf den Knochen geklebt wird. Dieser Ring dient dazu, den Kopf zu immobilisieren und Bewegungen durch Atmung zu verhindern und eine mit Kochsalzlösung gefüllte Tasse als Tauchmedium der Linse zu bilden. Diese Technik eignet sich gut, um i) in Echtzeit die Sinusgeometrie und Megakaryozyten zu beobachten, die mit der Gefäßwand interagieren; ii) Megakaryozyten im Prozess der Prothrombozytenbildung, -dehnung und -freisetzung zu verfolgen; und iii) Thrombozytenbewegungen messen, um den komplexen sinusförmigen Blutfluss zu überwachen. Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, wurden kürzlich veröffentlicht3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Mechanismen der Thrombozytenbildung hängen stark von der Knochenmarkumgebung ab. Daher ist die intravitalen Mikroskopie zu einem wichtigen Werkzeug im Feld geworden, um den Prozess in Echtzeit zu visualisieren. Mäuse mit fluoreszierenden Megakaryozyten können durch Kreuzung von Mäusen, die die Cre-Rekombinase in Megakaryozyten exprimieren, mit allen gefloxten Reportermäusen erhalten werden, die eine bedingte fluoreszierende Genexpressionskassette enthalten. Hier wurden mTmG-Reportermäuse (B6.129(Cg)-Gt(ROSA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Österreich) für seine fachkundige Beratung zu Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experimenten zu der Zeit, als wir die Technik im Labor etablierten, und Yves Lutz vom Imaging Center IGBMC /CBI (Illkirch, Frankreich) für seine Expertise und Hilfe beim Zwei-Photonen-Mikroskop. Wir danken auch Jean-Yves Rinkel für seine technische Hilfe und Ines Guinard für die Zeichnung des Schemas in Abbildung 1. Wir danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) für die Unterstützung bei der Anschaffung des Zwei-Photonen-Mikroskops. AB wurde durch Postdoktorandenstipendien des Etablissement Français du Sang (APR2016) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01) unterstützt.
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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