In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg
Summary
We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.
Abstract
Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten, gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De mogelijkheid om megakaryocyten in realtime en hun oorspronkelijke omgeving in beeld te brengen, werd meer dan 10 jaar geleden beschreven en werpt nieuw licht op het proces van bloedplaatjesvorming. Megakaryocyten strekken langwerpige uitsteeksels, proplatelets genoemd, uit door de endotheelbekleding van sinusoïde bloedvaten. Dit artikel presenteert een protocol om gelijktijdig in real time fluorescerend gelabelde megakaryocyten in het beenmerg en sinusvormige bloedvaten van de schedel in beeld te geven. Deze techniek is gebaseerd op een kleine operatie die de schedel intact houdt om ontstekingsreacties te beperken. De muizenkop wordt geïmmobiliseerd met een ring die op de schedel is gelijmd om te voorkomen dat bewegingen ademen.
Met behulp van twee-fotonenmicroscopie kunnen megakaryocyten tot een paar uur worden gevisualiseerd, waardoor celuitsteeksels en proplatelets kunnen worden geobserveerd tijdens het proces van verlenging in sinusoïde vaten. Dit maakt de kwantificering mogelijk van verschillende parameters met betrekking tot de morfologie van de uitsteeksels (breedte, lengte, aanwezigheid van vernauwingsgebieden) en hun rekgedrag (snelheid, regelmaat of aanwezigheid van pauzes of retractiefasen). Deze techniek maakt ook gelijktijdige registratie van circulerende bloedplaatjes in sinusoïde vaten mogelijk om de snelheid van de bloedplaatjes en de richting van de bloedstroom te bepalen. Deze methode is bijzonder nuttig om de rol van genen van belang bij de vorming van bloedplaatjes met behulp van genetisch gemodificeerde muizen te bestuderen en is ook vatbaar voor farmacologische tests (bestudeer de mechanismen, evalueer geneesmiddelen bij de behandeling van bloedplaatjesproductiestoornissen). Het is een waardevol hulpmiddel geworden, vooral als aanvulling op in vitro studies, omdat het nu bekend is dat in vivo en in vitro proplateletvorming afhankelijk zijn van verschillende mechanismen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat in vitro microtubuli nodig zijn voor proplatelet elongatie op zich. In vivodienen ze echter eerder als een steiger, waarbij de verlenging voornamelijk wordt bevorderd door bloedstroomkrachten.
Introduction
Bloedplaatjes worden geproduceerd door megakaryocyten-gespecialiseerde cellen in het beenmerg. De precieze manier waarop megakaryocyten bloedplaatjes in de bloedsomloop afgeven, is lang onduidelijk gebleven vanwege de technische uitdaging bij het observeren van real-time gebeurtenissen door het bot. Twee-fotonenmicroscopie heeft geholpen deze uitdaging te overwinnen en heeft geleid tot grote vooruitgang in het begrijpen van het proces van de vorming van bloedplaatjes. De eerste in vivo megakaryocytenwaarnemingen werden gedaan door von Andrian en collega’s in 2007, met de visualisatie van fluorescerende megakaryocyten door de schedel1. Dit was mogelijk omdat de botlaag in de frontoparietale schedel van jongvolwassen muizen een dikte heeft van enkele tientallen micron en voldoende transparant is om visualisatie van fluorescerende cellen in het onderliggende beenmerg mogelijk te maken2.
De daaropvolgende studies pasten deze procedure toe om de vorming van proplaatjes onder verschillende omstandigheden te evalueren en de onderliggende mechanismen3,4,5,6te ontcijferen. Deze studies leverden definitief bewijs dat megakaryocyten dynamisch uitsteeksels, proplatelets genaamd, verlengen door de endotheelbarrière van de sinusoïde vaten(figuur 1). Deze proplatelets komen vervolgens vrij als lange fragmenten die enkele honderden bloedplaatjes in volume vertegenwoordigen. De bloedplaatjes zullen worden gevormd na de remodellering van de proplatelets in de microcirculatie van stroomafwaartse organen, met name in de longen7. Tot op heden blijven het precieze proces en de moleculaire mechanismen echter onderwerp van discussie. De voorgestelde rol van de cytoskeletale eiwitten in de verlenging van proplatelets verschilt bijvoorbeeld tussen in vitro en in vivo omstandigheden3, en verschillen in proplateletvorming zijn aangetoond onder inflammatoire omstandigheden6. Om de zaken nog ingewikkelder te maken, betwistte een recente studie het proplatelet-gedreven concept en stelde voor dat in vivo, bloedplaatjes in wezen worden gevormd door een membraan-ontluikend mechanisme op het megakaryocytenniveau8.
Dit artikel presenteert een protocol voor de observatie van megakaryocyten en proplatelets in het beenmerg uit het schedelbot bij levende muizen, met behulp van een minimaal invasieve procedure. Soortgelijke benaderingen zijn eerder beschreven om andere mergcellen te visualiseren, met name hematopoëtische stam- en voorlopercellen9. De focus ligt hier op de observatie van megakaryocyten en bloedplaatjes om enkele parameters te beschrijven die kunnen worden gemeten, met name proplatelet morfologieën en bloedplaatjessnelheid. Dit protocol presenteert hoe een katheter in de halsader kan worden ingebracht om fluorescerende tracers en geneesmiddelen te injecteren en door het schedelbot te observeren. Het calvariale bot wordt blootgesteld met behulp van een kleine operatie, zodat een ring aan het bot wordt gelijmd. Deze ring dient om het hoofd te immobiliseren en bewegingen als gevolg van ademhaling te voorkomen en een beker gevuld met zoutoplossing te vormen als het onderdompelingsmedium van de lens. Deze techniek is zeer geschikt om i) in realtime de sinusoïde geometrie en megakaryocyten te observeren die interageren met de vaatwand; ii) volg megakaryocyten in het proces van proplateletvorming, verlenging en afgifte; en iii) meet bloedplaatjesbewegingen om de complexe sinusoïde bloedstroom te controleren. Gegevens verkregen met behulp van dit protocol zijn onlangs gepubliceerd3.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mechanismen van bloedplaatjesvorming zijn sterk afhankelijk van de beenmergomgeving. Vandaar dat intravitale microscopie een belangrijk hulpmiddel in het veld is geworden om het proces in realtime te visualiseren. Muizen met fluorescerende megakaryocyten kunnen worden verkregen door muizen die de Cre-recombinase in megakaryocyten tot expressie brengen, te kruisen met floxed reportermuizen die een voorwaardelijke fluorescerende genexpressiecassette bevatten. Hier werden mTmG reporter muizen gebruikt (B6.129(Cg)-Gt(…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Oostenrijk) bedanken voor zijn deskundige advies over twee-fotonmicroscopie-experimenten op het moment dat we de techniek in het laboratorium vestigden, en Yves Lutz van het Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrijk) voor zijn expertise en hulp met de twee-fotonenmicroscoop. We danken ook Jean-Yves Rinkel voor zijn technische hulp en Ines Guinard voor de tekening van het schema in figuur 1. Wij danken ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) voor haar steun bij de aankoop van de twee-fotonenmicroscoop. AB werd ondersteund door postdoctorale beurzen van Etablissement Français du Sang (APR2016) en van Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
References
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
