In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris
Summary
Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.
Abstract
Les plaquettes sont produites par des mégacaryocytes, des cellules spécialisées situées dans la moelle osseuse. La possibilité d’imager les mégacaryocytes en temps réel et leur environnement natif a été décrite il y a plus de 10 ans et jette un nouvel éclairage sur le processus de formation des plaquettes. Les mégacaryocytes étendent des protubérances allongées, appelées proplaquettaires, à travers la muqueuse endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux. Cet article présente un protocole pour imager simultanément en temps réel des mégacaryocytes marqués par fluorescence dans la moelle osseuse du crâne et les vaisseaux sinusoïdaux. Cette technique repose sur une chirurgie mineure qui maintient le crâne intact pour limiter les réactions inflammatoires. La tête de la souris est immobilisée avec un anneau collé au crâne pour empêcher les mouvements de respirer.
En utilisant la microscopie à deux photons, les mégacaryocytes peuvent être visualisés jusqu’à quelques heures, ce qui permet d’observer les protubérances cellulaires et les proplaquettaires en cours d’allongement à l’intérieur des vaisseaux sinusoïdaux. Cela permet de quantifier plusieurs paramètres liés à la morphologie des saprotsions (largeur, longueur, présence de zones de constriction) et à leur comportement d’allongement (vitesse, régularité, ou présence de pauses ou de phases de rétraction). Cette technique permet également l’enregistrement simultané des plaquettes circulantes dans les vaisseaux sinusoïdaux pour déterminer la vitesse plaquettaire et la direction du flux sanguin. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans la formation des plaquettes à l’aide de souris génétiquement modifiées et se prête également à des tests pharmacologiques (étude des mécanismes, évaluation des médicaments dans le traitement des troubles de la production plaquettaire). Il est devenu un outil inestimable, en particulier pour compléter les études in vitro, car on sait maintenant que la formation de proplaquettaires in vivo et in vitro repose sur des mécanismes différents. Il a été démontré, par exemple, que les microtubules in vitro sont nécessaires pour l’allongement proplaquettaire en soi. Cependant, in vivo,ils servent plutôt d’échafaudage, l’allongement étant principalement favorisé par les forces de circulation sanguine.
Introduction
Les plaquettes sont produites par des cellules spécialisées dans les mégacaryocytes situées dans la moelle osseuse. La façon précise dont les mégacaryocytes libèrent des plaquettes dans la circulation est longtemps restée incertaine en raison du défi technique lié à l’observation d’événements en temps réel à travers l’os. La microscopie à deux photons a aidé à surmonter ce défi et a conduit à des progrès majeurs dans la compréhension du processus de formation des plaquettes. Les premières observations in vivo de mégacaryocytes ont été faites par von Andrian et ses collègues en 2007, avec la visualisation de mégacaryocytes fluorescents à travers le crâne1. Cela a été possible parce que la couche osseuse dans le crâne frontopoyériétal de jeunes souris adultes a une épaisseur de quelques dizaines de microns et est suffisamment transparente pour permettre la visualisation de cellules fluorescentes dans la moelle osseuse sous-jacente2.
Les études qui ont suivi ont appliqué cette procédure pour évaluer la formation de proplaquettaires dans diverses conditions et pour déchiffrer les mécanismes sous-jacents3,4,5,6. Ces études ont fourni des preuves définitives que les mégacaryocytes étendent dynamiquement les protubérances, appelées proplaquettaires, à travers la barrière endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux (Figure 1). Ces proplaquettaires sont ensuite libérées sous forme de longs fragments qui représentent plusieurs centaines de plaquettes en volume. Les plaquettes se formeront après le remodelage des proplaquettaires dans la microcirculation des organes en aval, notamment dans les poumons7. À ce jour, cependant, le processus précis et les mécanismes moléculaires restent sujets à débat. Par exemple, le rôle proposé des protéines du cytosquelette dans l’allongement des proplaquettaires diffère entre les conditions in vitro et in vivo 3, et des différences dans la formation de proplaquettaires ont été démontrées dans des conditions inflammatoires6. Pour compliquer encore les choses, une étude récente a contesté le concept proplaquettaire et a proposé qu’in vivo,les plaquettes sont essentiellement formées par un mécanisme de bourgeonnement membranaire au niveau des mégacaryocytes8.
Cet article présente un protocole pour l’observation des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle osseuse à partir de l’os du crâne chez des souris vivantes, en utilisant une procédure mini-invasive. Des approches similaires ont déjà été décrites pour visualiser d’autres cellules de la moelle, notamment les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitaires9. L’accent est mis ici sur l’observation des mégacaryocytes et des plaquettes pour détailler certains paramètres qui peuvent être mesurés, notamment les morphologies proplaquettaires et la vitesse plaquettaire. Ce protocole présente comment insérer un cathéter dans la veine jugulaire pour injecter des traceurs fluorescents et des médicaments et observer à travers l’os du crâne. L’os calvarial est exposé par chirurgie mineure afin qu’un anneau soit collé à l’os. Cet anneau sert à immobiliser la tête et à prévenir les mouvements dus à la respiration et à former une tasse remplie de solution saline comme milieu d’immersion de la lentille. Cette technique est bien adaptée pour i) observer en temps réel la géométrie sinusoïdale et les mégacaryocytes interagissant avec la paroi des vaisseaux; ii) suivre les mégacaryocytes dans le processus de formation, d’allongement et de libération des proplaquettaires; et iii) mesurer les mouvements plaquettaires pour surveiller le flux sanguin sinusoïdal complexe. Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées récemment3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mécanismes de formation des plaquettes dépendent fortement de l’environnement de la moelle osseuse. Par conséquent, la microscopie intravitale est devenue un outil important sur le terrain pour visualiser le processus en temps réel. Les souris avec des mégacaryocytes fluorescents peuvent être obtenues en croisant des souris exprimant la Cre recombinase dans des mégacaryocytes avec n’importe quelle souris rapporteur floxée contenant une cassette d’expression génique fluorescente conditionnelle. Ici, des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Florian Gaertner (Institut des sciences et de la technologie d’Autriche, Klosterneuburg, Autriche) pour ses conseils d’expert sur les expériences de microscopie à deux photons au moment où nous avons établi la technique en laboratoire, et Yves Lutz du Centre d’imagerie IGBMC / CBI (Illkirch, France) pour son expertise et son aide avec le microscope à deux photons. Nous remercions également Jean-Yves Rinkel pour son aide technique et Ines Guinard pour le dessin du schéma de la figure 1. Nous remercions l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pour son accompagnement dans l’acquisition du microscope à deux photons. AB a été soutenu par des bourses postdoctorales de l’Etablissement Français du Sang (APR2016) et de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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