Summary
מלנומה היא מחלה אגרסיבית מאוד שמתפשטת במהירות לאיברים אחרים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד, יחד עם עיבוד 3D, כדי לפקח על הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות במודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים מהונדסים גנטית (עכברי Braf/Pten) נמצאים בשימוש נרחב כמודל in vivo של מלנומה גרורתית. לאחר גידול ראשוני כבר המושרה על ידי טיפול טמוקסיפן, עלייה בנטל גרורתי הוא ציין בתוך 4-6 שבועות לאחר אינדוקציה. מאמר זה מראה כיצד ניתן לנצל הדמיית UltraSound בתדר גבוה במיוחד (UHFUS) כדי לעקוב אחר העלייה במעורבות גרורתית של בלוטות הלימפה המפשעתיות על ידי מדידת הגידול בנפחן.
מערכת UHFUS משמשת לסריקת עכברים מורדמים באמצעות בדיקה ליניארית UHFUS (22-55 מגה-הרץ, רזולוציה צירית 40 מיקרומטר). תמונות במצב B מבלוטות הלימפה המפשעתיות (הן בצד שמאל והן בצד ימין) נרכשות בתצוגה של ציר קצר, וממקמות את בעלי החיים באיסוף גב. רשומות אולטראסאונד נרכשות באמצעות גודל צעד 44 מיקרומטר על זרוע מכנית ממונעת. לאחר מכן, רכישות דו-ממדיות (2D) במצב B מיובאות לפלטפורמת התוכנה לתמונת אולטרסאונד לאחר עיבוד, ובלוטות לימפה מפשעתיות מזוהות ומפולחות באופן אוטומטי למחצה בתמונות הדו-ממדיות החתך שנרכשו. לבסוף, שחזור כולל של נפח תלת מימדי (3D) מתקבל באופן אוטומטי יחד עם עיבוד של נפח בלוטות הלימפה, אשר בא לידי ביטוי גם כמדידה מוחלטת.
טכניקת vivo לא פולשנית זו נסבלת היטב ומאפשרת תזמון של מפגשי הדמיה מרובים על אותה חיה ניסיונית במשך שבועיים. זה, אם כן, אידיאלי להעריך את ההשפעה של טיפול תרופתי על מחלות גרורתיות.
Introduction
מלנומה היא צורה אגרסיבית של סרטן העור המתפשטת לעתים קרובות לאתרי עור אחרים (גרורות תת עוריות), כמו גם לקשריות לימפה, ריאות, כבד, מוח ועצמות1. בעשור האחרון, תרופות חדשות הוכנסו לפרקטיקה קלינית ותרמו לשיפור תוחלת החיים של חולי מלנומה גרורתית. עם זאת, מגבלות להישאר, כולל זמן משתנה ומידת התגובה, תופעות לוואי חמורות, ואת ההתקוממות של התנגדות שנרכשה1. לכן, חשוב לזהות התפשטות גרורתית בשלביה המוקדמים, כלומר, כאשר היא מגיעה לבלוטות הלימפה המקומיות.
ביופסיה של בלוטות הלימפה המקומיות (בלוטות הלימפה הזקיף) מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את נוכחותם של תאי מלנומה. עם זאת, הדמיית אולטרסאונד תופסת אחיזה כשיטה לא פולשנית של גילוי מעורבות גרורתית, כפי שהוא עולה על הערכה קלינית והוא יכול לעזור למנוע ביופסיה מיותרת2,3,4. יתר על כן, הדמיית אולטרסאונד נראה מתאים למעקב בלוטות הלימפה, במיוחד במקרה של גיל מתקדם ו/או תחלואה5,6. התכונות שזוהו על ידי ניתוח אולטרסאונד ומאפשרות את ההבחנה בין בלוטות לימפה רגילות גרורתיות כוללות גודל מוגבר (נפח), שינוי צורה מהאליפסה לעגול, שוליים לא סדירים, דפוס אקוגני שונה, ושינוי (מוגבר) כלי דם7.
Tyr::CreER +,BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים מהונדסים גנטית (עכברי Braf/Pten) הפכו לאחרונה לזמינים לקהילה המדעית כמודל ספציפי לרקמות ובלתי ניתן למניעה למלנומה גרורתית8. במודל זה של בעלי חיים, גידולים ראשוניים מתפתחים מהר מאוד: הם הופכים גלויים בתוך 2-3 שבועות לאחר אינדוקציה של המעבר מסוג בר (wt) בראף כדי BrafV600E ועל אובדן Pten, בעוד הם מגיעים נפח של 50-100 mm3 בתוך 4 שבועות. בשבועיים שלאחר מכן, הצמיחה של הגידול העיקרי מלווה בעלייה הדרגתית בנטל גרורתי באתרי עור אחרים, בלוטות הלימפה והריאות.
עכברי Braf/Pten שימשו בהרחבה למטרות רבות, כולל ניתוח של מסלולי איתות המעורבים במלנומגנזה9,10, זיהוי תאי מלנומה ממוצא11,12,13, ובדיקת אפשרויות טיפוליות חדשות במונחים של טיפול ממוקד ואימונותרפיה8,14,15,16 . באופן ספציפי, השתמשנו בעכברים Braf / Pten כדי להוכיח כי מונוציטוגנים ליסטריה מוחלשים (Lmat) עובד כחיסון נגד מלנומה. כאשר מנוהל באופן שיטתי בסביבה הטיפולית, Lmat אינו קשור לרעילות הכללית כפי שהוא מצטבר באופן סלקטיבי באתרי גידול. יתר על כן, זה גורם לירידה יוצאת דופן במסת המלנומה העיקרית וירידה בנטל גרורתי בבלוטות הלימפה והריאות. ברמה המולקולרית, Lmat גורם להרג אפופטוטי של תאי מלנומה, אשר נובע, לפחות בחלקו, לפעילויות שאינן אוטונומיות תאים (גיוס באתר של CD4 + ו CD8 + T לימפוציטים)16.
כאשר עכברי Braf / Pten משמשים למידול מלנומה, הצמיחה של גידולים ראשוניים וגרורות תת עוריות ניתן לפקח על ידי מדידות caliper. עם זאת, יש לחקור את המעורבות של בלוטות הלימפה והריאות באמצעות טכניקה חלופית, אולי לא פולשנית המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר אותה חיה לאורך זמן. מאמר זה מתאר את השימוש בהדמיית אולטרסאונד (איור 1), יחד עם ניתוח נפחי תלת-ממדי עוקב של הנתונים המתקבלים, לניטור האורך של הגידול בגודל (נפח) של בלוטות הלימפה המפשעתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (פרוטוקולים בעלי חיים #754/2015-PR ו #684/2018-PR).
1. אינדוקציה מלנומה
הערה: טיר בן שישה שבועות::CreER +,BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] שימשו במחקר זה (ראו טבלת החומרים).
- לטפל בעכברים עם 4-hydroxytamoxifen (4-HT) על ידי החלת 3 μL של 5 mM 4-HT על ~ 1 ס"מ2 של עור מגולח של הגב העליון, כפי שתואר בעבר 11,16,17, במשך 3 ימים ברציפות.
הערה: פעולה זו תפעיל את האנזים Cre ותגרום למעבר מ- wt Braf ל- BrafV600E ולאובדן Pten. שני להיטים אלה מספיקים כדי לגרום להיווצרות מלנומה. - שימו לב כי גידולים ראשוניים מתפתחים באתר של ציור העור תוך 2-3 שבועות ומגיעים לנפח של 50-100 מ"מ3 תוך 4 שבועות. כמו כן, שים לב גרורות לאתרי עור אחרים, בלוטות הלימפה, וריאות בשלב זה (t0).
- השתמש calipers כדי למדוד את נפח הגידול העיקרי ושל גרורות תת עוריות, הדמיית אולטרסאונד כדי למדוד את הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתי. חזור על מדידות אלה לאחר שבוע (t1, 5 שבועות לאחר ציור העור) ולאחר שבועיים (t2, 6 שבועות לאחר ציור העור).
- בנקודת הזמן האחרונה, להרדים את העכברים על ידי מנת יתר עם sevorane גזי.
- לנתח את הגידול העיקרי ואת בלוטות הלימפה על ידי בדיקה חזותית, ולאחר מכן excise אותם למחקרים היסטולוגיים, כפי שדווח ב16.
2. הליך הדמיה
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה להרדמה בגז ומספקים 3% איזופלוריין בחמצן טהור עד שהחיה מורדמת לחלוטין. ודא את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת כף הרגל.
- העבר את החיה ללוח מחומם - חלק מכונן של תחנת ההדמיה UHFUS - מחזיק את החיה בתנוחה עלובה. השתמש בדיקה רקטלית משומן עם ג'לי נפט כדי למדוד את טמפרטורת הגוף. התאם את טמפרטורת הלוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר בטווח הפיזיולוגי (36 ± 1 °C).
- להרטיב את העיניים של העכבר עם משחה וטרינרית כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. אספקת גז נרקוטי (1.5% איזופלוראן בחמצן טהור) באמצעות מסכת האף של העכבר. התאם את אחוז האיזופלוראן כדי לשמור על העומק הנכון של הרדמה.
- מצופים את כפות הרגליים הקדמיות והאחוריות בדבק מוליך ומדביקים אותן לאלקטרודות צלחת האק"ג המוטמעות בלוח. ודא כי הפרמטרים הפיזיולוגיים (קצב לב, אות נשימה וטמפרטורת גוף הליבה) נרכשים ומוצגים כראוי.
- הסר את השיער משני האזורים מפשעתיים על ידי החלת סוכן depilatory וציפוי אותם עם מדיום צימוד אקוסטי.
- הידקו את הגשושית הליניארית UHFUS (תדר מרכז של 40 מגה-הרץ) למנוע תלת-ממדי מיוחד המוטמע בתחנת ההדמיה UHFUS, ומאפשר תנועה אוטומטית וצעדית של הגשושית.
- לכוון כראוי ולהתאים את המיקום של הבדיקה אולטרסאונד כדי לקבל תמונות ציר קצר של בלוטות הלימפה מפשעתית (שמאל / ימין), ולמקם את אזור העניין באזור המוקד.
- סרוק את כל הנפח של בלוטות הלימפה המפשעתיות כרצף של תמונות במצב B דו-ממדי, כפי שתואר בעבר18. לרכוש תמונות ברמות מרובות של בלוטות הלימפה על ידי תנועה ליניארית של המתמר עם גדלי צעדים בסולם מיקרומטר, כדי ליצור נתונים 3D במונחים של נשימה אוטומטית - לולאות cine מגודרות לב.
- הגדר את הקלטת התמונה עם הפרמטרים הבאים: מרחק סריקה הנע בין 2 ל -5 מ"מ (בהתאם לגודל בלוטות הלימפה); גודל שלב 44 מיקרומטר, עם תוצאה של 46-114 שלבי סריקה / פרוסות בלוטות הלימפה וזמן רכישה של 1-3 דקות לכל בעל חיים. אחסן באופן דיגיטלי את התמונות שנרכשו בתבנית גולמית (DICOM) לניתוחים לא מקוונים נוספים.
- בסוף מפגש ההדמיה, להפסיק את הרדמה הגז ולאפשר לבעל החיים להתאושש על לוח החימום ב recumbency עצם החזה. שמור על החיה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על המיקום נוטה.
3. לאחר עיבוד של תמונות אולטרסאונד
- פתח את ערכת הנתונים של DICOM 3D תמונות של בלוטות הלימפה מפשעתי שמאל / ימין בפלטפורמת התוכנה עבור תמונת אולטרסאונד לאחר עיבוד.
- פילוח:
- בחרו 'שיטת ריבוי פרוסות' כדי להציג באופן חזותי הן את המסגרות הנוכחיות והן את התמונות הממוזערות של כל המסגרות המתאימות לכל תמונה שנלכדה במהלך הרכישה התלת-ממדית.
- בחר את התמונה הממוזערת של המסגרת הראשונה כדי לטעון אותה לתצוגת קווי המתאר. בתצוגת המתאר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד נקודות לאורך גבול בלוטות הלימפה. לאחר הגדרת מספר הנקודות הרצוי (טווח 10-15), לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להשלים את קווי המתאר.
- לאחר השלמת קווי המתאר הראשונים, השתמשו בתצוגת התמונות הממוזערות כדי לבחור את התמונה הבאה לקווי מתאר. במידת הצורך, דלג/י על מספר תמונות (ממוצע של 3 מסגרות) בין קווי מתאר כדי להפחית את מספר המעקבים הידניים הדרושים לכל אמצעי אחסון תלת-ממדי.
הערה: פלטפורמת התוכנה עבור תמונת אולטרסאונד לאחר עיבוד תיצור באופן אוטומטי קווי מתאר בין עקבות ידניים, ובכך להפחית את זמן הניתוח. - חזור על תהליך זה עד לחלוקה לרמות של אמצעי האחסון כולו. לאחר השלמת, לחץ על סיום.
- יצירת מסגרת התיל התלת-ממדית ומדידת עוצמת הקול:
- בסביבת העבודה של חלון מצב תלת-ממד , לחצו על סמל מדידת עוצמת הקול מתחת לאזור תצוגת התמונה כדי להפעיל את תצוגת פני השטח.
הערה: תצוגת פני השטח יוצרת תצוגת הידור הממפה את אמצעי האחסון שנוצר על-ידי המשתמש לתמונה שנרכשה. ניתן לסובב את תצוגת פני השטח לכל תנוחה רצויה. - שים לב למדידת עוצמת הקול המפורטת בפינה השמאלית התחתונה של תצוגת הקוביה.
הערה: ניתן להשיג פילוח וייצור אמצעי אחסון תלת-ממדיים גם באמצעות תוכנה שפותחה בהתאמה אישית ו/או תוכנה זמינה/מסחרית באופן חופשי לעיבוד תמונה כללי. החל מפילוח ידני, התוכנה צריכה לספק תיאור מתמטי ו / או ברמת פיקסל של קווי המתאר של בלוטות הלימפה. קווי מתאר אלה ישולבו בחלל תלת-ממדי כדי להפוך את פני השטח החיצוניים של בלוטות הלימפה. כל השלבים המתוארים בהליך ההדמיה ולאחר העיבוד של תמונות אולטרסאונד מסוכמים באיור 2.
- בסביבת העבודה של חלון מצב תלת-ממד , לחצו על סמל מדידת עוצמת הקול מתחת לאזור תצוגת התמונה כדי להפעיל את תצוגת פני השטח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר ציור העור של Tyr::CreER +,BrafCA/+,Ptenlox/lox עכברים עם 4-HT, פעילות Cre מושרה, שבגללה יש מתג ברמה הגנומית מ wt Braf ל BrafV600E , בעוד Pten הולך לאיבוד (איור 3A). בתוך 2-3 שבועות, עכברים לפתח גידולים ראשוניים באתר עם 100% חרטה. לאחר ארבעה שבועות מטיפול 4-HT (t0), גידולים ראשוניים מגיעים לנפח של 50-100 מ"מ3, ואת הצמיחה שלהם ניתן למדוד על ידי calipers במשך שבועיים נוספים ((t1 ו- t2; איור 3B, לוחות עליונים). לא ניתן להגיע לנקודות זמן מאוחרות יותר מכיוון שהגידול הופך להיות כה גדול שהעכברים זקוקים להמתת חסד.
בכל הנוגע לנטל גרורתי, נצפתה עלייה הדרגתית בפיגמנטציה בבלוטות הלימפה המפשעתיות בתוך 4-6 שבועות מטיפול 4-HT (איור 3B, לוחות נמוכים יותר). עלייה כזו בפיגמנטציה נובעת מנוכחות של מרבצי מלנין, כפי שניתן לאשר על ידי המטוקסילין וכתמי אאוזין המבוצעים מבלי להסיר את המלנין. בתורו, מרבצי המלנין הם תמיד בשל נוכחותם של תאי מלנומה גרורתיים, כפי שאושר על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיים (IHC) של מלנומה אנטיגן MLANA ו BRAFV600E (איור 3C).
הצטברות תאי מלנומה פיגמנטיים בתוך בלוטות הלימפה המפשעתיות מלווה בעלייה הדרגתית בנפחן, כפי שניתן לראות בבדיקה חזותית (איור 3B, לוחות נמוכים יותר). הדמיית אולטרסאונד מציעה את ההזדמנות הייחודית לכמת עלייה כזו לאורך, בכל עכבר ניסיוני, כפי שתואר בעבר16. מדידות נפחיות, תוצאות פילוח ועיבוד תלת-ממדי, כולם מתייחסים למקרה מייצג, מוצגים באיור 4. הנפח של כל בלוטות הלימפה מתקבל על ידי פילוח ידני של החלקים הציריים שנרכשו במהלך סריקה תלת-ממדית.
בסוף שלב הפילוח, כל החלקים מציגים את שכבת העל של קווי המתאר החיצוניים של בלוטות הלימפה (איור 4A). קווי מתאר אלה מחוברים פריים אחר פריים בשלב העיבוד, והמשטח החיצוני של כל בלוטות הלימפה מוקרן במרחב התלת-ממדי. כדוגמה מייצגת, העיבוד התלת-ממדי של בלוטות לימפה ממשכתיות ימניות המנותחות ב- t0, t1 ו- t2 מוצג באיור 4B, איור 4C ואיור 4D, בהתאמה. הגרף באיור 4E מכמת את העלייה בנפח המוצגת על ידי בלוטות הלימפה המפשעתיות השמאלית והימנית של אותה חיה לאורך זמן.
איור 1: מערכת הדמיית האולטרסאונד המשמשת לניטור הגידול בנפח בלוטות הלימפה המפשעתיות במודל העכבר המהונדס גנטית Braf/Pten של מלנומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סיכום שלב אחר שלב של הליך ההדמיה ולאחר עיבוד תמונות אולטרסאונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בדיקה חזותית וניתוחים היסטולוגיים של בלוטות לימפה מפשעתיות במודל המלנומה גרורתית של Braf/Pten ספציפי לרקמות בעכבר. (A) אנזים Cre גורם למעבר של wt Braf ל- BrafV600E ולאובדן Pten (כריתת אקסונים 4 ו -5). מערכת זו היא מלנוציט ספציפית כי הביטוי של האנזים Cre נמצא תחת שליטתו של מקדם טירוזינאז, אנזים המעורב בסינתזת מלנין. לכן, שני הלהיטים האונקוגניים מוגבלים לשושלת המלנוציטית. מערכת זו היא גם בלתי ניתנת לערעור כי Cre מתבטא כחלבון היתוך עם קולטן האסטרוגן ודורש ציור עור עם 4-HT להיות translocated לתוך הגרעין, שבו הוא יכול להפעיל את תפקידו. (B) הופעת גידולי מלנומה ראשוניים (תמונות עליונות) ובלוטות לימפה מפשעתיות (תמונות נמוכות יותר) לאחר 4, 5 ו -6 שבועות לאחר טיפול 4-HT (t0, t1, ו- t2, בהתאמה). בבלוטות הלימפה, הגידול הצטברות מלנין וגודל מזוהה על ידי בדיקה חזותית. סרגלי קנה מידה = 0.5 ס"מ (תמונות עליונות); 0.2 ס"מ (תמונות נמוכות יותר). (ג) ניתוחים היסטולוגיים של בלוטות לימפה מפשעתיות, 6 שבועות לאחר טיפול 4-HT. (משמאל למעלה) כתמי H&E: מרבצי מלנין מוסרים על ידי פרוסות דגירה עם 1% KOH ו 3% H2O2. (בפינה הימנית העליונה) זיהוי מלנין המבוצע על ידי כתמי H&E ללא 1% KOH וטיפול H2O2 של 3%. (משמאל למטה) זיהוי MLANA על ידי כתמי אימונופרוקסידאז (מצע כרומוגן DAB ונגד המטוקסילין). (מימין למטה) זיהוי BRAFV600E על ידי כתמי אימונופרוקסידאז (מצע כרומוגן DAB ונגד המטוקסילין). לכל החלוניות, הגדלה מקורית: 40x; סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: wks = שבועות; wt = סוג פראי; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen; H&E = המטוקסילין ואאוזין; DAB = 3,3'-diaminobenzidine. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידות, פילוח ועיבוד תלת-ממדי של נפח בלוטות הלימפה המפשעתיות במודל המלנומה גרורתית Braf/Pten הספציפי לרקמות ובלתי ניתנות למניעה בעכבר. (A) כיסוי של קווי המתאר החיצוניים של בלוטות הלימפה הממשכתיות הימניות בארבעה חלקים סרוקים מייצגים המתקבלים על ידי פילוח ידני. (B-D) עיבוד נפח 3D של בלוטות הלימפה הממשכתיות הימניות, כפי שנמדד ב 4, 5, ו 6 שבועות לאחר טיפול 4-HT (t0, t1, ו t2 נקודות זמן, בהתאמה). הערך המספרי של אמצעי האחסון מדווח גם (ב- mm3). (ה) הנפח של השמאל (עיגול שחור) וימין (עיגול לבן) קשר לימפה מפשעתי של אותה חיה בנקודות זמן t0, t1 ו- t2. קיצורים: 3D = תלת מימדי; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנתונים המתקבלים במחקר זה מעידים על היכולת של הדמיית אולטרסאונד כדי לפקח על המעורבות גרורתית של בלוטות הלימפה מפשעתיות של מודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית. כפי שמוצג בעבר16, טכניקה זו שימושית במיוחד כדי להעריך את היעילות של טיפול תרופתי. הסיבה לכך היא כי זה מאפשר ניטור של השינוי בנפח בלוטות הלימפה באותו בעל חיים לאורך זמן, על ידי השוואת המדידות שנאספו ב t1 וt2 עם אלה שנאספו ב t0. זה, בתורו, תורם לעלייה בחוסן של התוצאות שהושגו, כי שונות בין עכברים וגורמים אחרים שעשויים להשפיע על גודל בלוטות הלימפה הבסיסיות כולם נלקחים בחשבון. בנוסף, הדמיית אולטרסאונד מאפשרת עמידה בעקרון 3R על ידי הפחתת מספר בעלי החיים לכל קבוצת ניסוי.
בעכברים Braf /Pten, לא רק מפשעתי, אלא גם בלוטות לימפה brachial ו axillary הם אתרים של התפשטות גרורתית. עם זאת, מומלץ להתמקד בלוטות הלימפה מפשעתיות כי האחרים קרובים מדי לאתר הגידול העיקרי, אשר בדרך כלל משנה את הלוקליזציה שלהם מורפולוגיה במהלך התפתחות הגידול העיקרי עצמו. לחלופין, בלוטות הלימפה הזרוע והגרסיבי עשויות להתאים להדמיית אולטרסאונד אם נבחר אתר אחר של אינדוקציה של גידול, כגון אוזניים או כפות8. בכל הנוגע לאתרים גרורתיים אחרים, לא ניתן ללמוד ריאות באמצעות הדמיית אולטרסאונד, בגלל נוכחות של אוויר ברקמה. תיאורטית, ניתן היה לדמיין רק גרורות ריאתיות שטחיות המגיעות לממשק הפלורל עם טכניקה זו. למרות טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת / טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (CT / PET) ניתן להשתמש במקום, גישה זו יש כמה חסרונות, כולל עלויות גבוהות וזמינות מוגבלת. יתר על כן, בהתבסס על קרינה מייננת, מיקרו CT / PET אינו תואם למדידות אורך בנקודות זמן מרובות. לעומת זאת, הדמיית אולטרסאונד ניתן ליישם בקלות לחקר גרורות תת עוריות ומאפשר את המדידה של נפח וכלי דם16.
אם מסגרת זמן של שבועיים קצרה מכדי להעריך את ההשפעות של התרופה הנחקרת, אתר אינדוקציה היקפי יותר (למשל, קצה הזנב9,11) או גנוטיפ פחות נוטה לגידול (Tyr::CreER +,BrafCA/+,Ptenlox/+ עכברים במקום Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox עכברים) ניתן היה לבחור9 . בשני המקרים, הצמיחה של הגידול העיקרי צפוי להיות הרבה יותר איטי, המאפשר ניטור גרורות במשך הרבה יותר מ 6 שבועות לאחר אינדוקציה עם 4-HT.
מנקודת מבט טכנית יותר, חשוב לציין כי פילוח דו-ממדי של תמונות אולטרסאונד הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה, כי זה עשוי להשפיע על המדידה של נפח 3D. למרבה המזל, במודל החייתי Braf / Pten, הניגוד בין בלוטות הלימפה והרקמות שמסביב מסומן למדי, כך שתיאור בלוטות הלימפה גובל על ידי פילוח ידני הוא פשוט יחסית. עם זאת, תהליך הפילוח צריך להיות הקל על ידי האיכות הגבוהה של תמונות אולטרסאונד שנרכשו על ידי הסונוגרף, אשר, בתורו, צריך להיות מנוסה מאוד וממוקד על רכישת אותה הקרנת אולטרסאונד של בלוטות הלימפה, אפילו בפגישות סריקה שבוצעו בנקודות זמן שונות.
הדמיית אולטרסאונד במצב B לא יכול להדגיש תאים סרטניים ישירות; במקום זאת, זה מאפשר את המסקנה של נוכחותם מן הגידול בנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות. לאור מידע זה, מומלץ כי הדמיית אולטרסאונד להיות בשילוב עם כתמים IHC מתאים של בלוטות הלימפה, כך נוכחות של תאים סרטניים ניתן לאשר ברמה המולקולרית. עם זאת, הגדלת בלוטות הלימפה שנצפו בעכבר Braf / Pten המושרה בדרך כלל מיוחסת לסרטן מתפשט ולא למטרה אחרת , למשל, זיהום מתמשך. הסיבה לכך היא ככל הנראה כי עכברים ניסיוניים המשמשים להדמיית אולטרסאונד גדלים בתנאים מבוקרים והם כפופים באופן שגרתי להקרנה סניטרית, כך מחלה זו מזוהה מיד ומטופלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לס. בורצ'יאלי (FTGM, פיזה) על עזרתה בהליכים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutional Funding to LP; MFAG #17095 הוענק על ידי AIRC-Associazione Italiana Ricerca סול קנקרו ל- LP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
