Summary
インビボでは 膵臓の高解像度イメージングが膵臓のインビタルイメージングウィンドウで容易であった。
Abstract
生きた小動物モデルにおける膵臓の直接 生体細胞 分解能イメージングは技術的に困難であった。最近の生体内イメージング研究は、腹部イメージングウィンドウを用いて、生体内の腹部器官における細胞ダイナミクスの可視化を可能 にした。しかし、生理学的な動き(例えば、蠕動や呼吸)の影響を受けやすいマウス膵臓の柔らかいシート状のアーキテクチャにより、マウス膵 臓 の膵臓で膵島または癌細胞を同定、追跡、定量するために、細胞レベルで数週間にわたって細胞内で安定した縦方向のイメージングを行うことは困難であった。本明細書において、膵臓微細構造の経縦経時間経過インビトバイタルイメージングのために膵臓を腸から空間的に分離することができる新規支持基剤、統合された膵臓内脳イメージングウィンドウを移植する方法について説明する。画像化窓を用いた縦方向 インビボ イメージングは安定した可視化を可能にし、3週間にわたって膵島の追跡と微細構造の高解像度3次元画像化を可能にする、正形膵臓癌モデルでここに証明されるように。我々の方法により、さらに、細胞レベルで膵臓を含む様々な疾患の病態生理を解明することができる生体内イメージング研究。
Introduction
膵臓は、消化管の外分泌機能と血流中にホルモンを分泌する内分泌機能を有する腹部器官である。膵臓の高解像細胞イメージングは、膵炎、膵臓癌、および糖尿病を含む膵臓を含む様々な疾患の病態生理を明らかにすることができる1。コンピュータ断層撮影、磁気分解能画像、および超音波検査などの従来の画像診断ツールは、臨床分野1,2で広く利用可能である。しかし、これらのイメージングモダリティは構造的または解剖学的変化のみを視覚化することに制限されているが、細胞レベルまたは分子レベルでの変化は決定できない。ヒトにおける糖尿病や膵臓癌の分子変化が診断3、4の10年以上前に開始できることを考えると、潜伏期間中の分子転移から膵臓疾患を検出することは、早期診断とタイムリーな介入を提供する可能性を秘めている。したがって、分解能の限界を克服し、機能に関する貴重な洞察を提供するイメージングは、膵臓癌の早期診断または、糖尿病の進行期における膵島の改変の高度な同定を提供することによって顕著に注目を集める5。
特に島と共に、核イメージング、生物発光イメージング、および光コメレンストモグラフィーは、非侵襲的な島頭撮影技術6として示唆されている。しかし、これらの方法の分解能は、数十~数百マイクロメートルの典型的な値で、小島の細胞レベルでの変化を検出する限られた機能を提供する、実質的に低い。一方、以前の高解像研究では、ex vivo7,8(例えば、 膵臓のスライスまたは消化、非生理学的9(例えば、膵臓の外在化)および異所性状態10、11、12(例えば、腎臓カプセルの下、肝臓内、および眼の前房に移植)、解釈および臨床的意味を制限する。もし、高解像イメージングのin vivo、生理学、および異形性体モデルを確立できれば、膵島の調査に不可欠なプラットフォームとなるでしょう。
生体動物の微視的分解能レベルで病態生理を明らかにする生体内イメージングは、最近、大きな注目を集めています13.in vivo イメージング法のうち、マウスの腹部に窓を埋め込む腹部イメージングウィンドウ14の開発により、新しい知見(すなわち、早期肝転移15 の前微小転移段階および腸上皮16における幹細胞維持のメカニズム)の発見が可能になった。腹部イメージングウィンドウは貴重な結果をもたらすが、膵臓に対するこの窓の用途および膵臓を含む疾患に基づく結果として生じる生体内イメージング研究は、広範囲に調査されていない。
ヒト膵臓の固形器官特性とは異なり、マウスの膵臓は、拡散分散した軟組織様構造17である。したがって、蠕動や呼吸などの生理学的な動きによって絶え間なく影響を受けます。膵臓の腹部イメージングウィンドウの適用に関する以前の研究は、腸の動きによって誘発された動きアーティファクトのためにさまようことを実証した18.結果として得られた平均画像では重度のぼかしが観察され、マイクロスケール構造の視覚化と同定が妨げられていた。
ここでは、膵臓を含む疾患における縦方向細胞レベル事象を調べるため、生体内顕微鏡19,20と組み合わせた新規支持基盤統合膵臓生体内イメージングウィンドウの使用について説明する。前の研究18の方法論の詳細な説明に加えて、膵臓を含む様々な疾患に対する膵画像化窓の拡張応用について本論文で説明する。このプロトコルでは、カスタム構築されたビデオレートレーザースキャン共焦点顕微鏡システムを、生体内顕微鏡システムとして利用した。4つのレーザーモジュール(405、488、561、および640 nmの波長)が励起源として利用され、4つの発光信号がバンドパスフィルタ(BPF1:FF01-442/46)を介して光増倍管(PMT)によって検出されました。BPF2: FF02-525/50;BPF3: FF01-600/37;BPF4: FF01-685/40)。レーザースキャンは、回転する多角形ミラー(X軸)と、ビデオレートスキャン(30フレーム/秒)を可能にするガルバノの走査ミラー(Y軸)で構成されていました。生体内顕微鏡に関する詳細は、前の研究10、18、19、20、21、22、23に記載されている。
以前の島の調査18では、遺伝子導入マウスモデル(MIP-GFP)24を用いて、生きたマウスの中の小島をGFPでタグ付けした状態で安定した画像を作成することに成功しました。この方法により、1週間の間に小島の変化を高解像度で可視化することができました。また、最大3週間の同じ膵島のイメージングを促進し、これは、糖尿病の病因の病因の間に機能的追跡またはモニタリングのための膵島の長期研究の実現可能性を示唆する。さらに、蛍光膵臓癌細胞(PANC-1 NucLightRed)25をマウスの膵臓に直接移植する、正腸膵臓癌モデルを開発した。膵臓内イメージングウィンドウの適用により、このモデルは、膵臓癌の腫瘍微小環境における細胞および分子病態生理学を調査し、新しい薬剤候補の治療的モニタリングのためのプラットフォームとして利用することができる。
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Protocol
本論文に記載されている手順はすべて、実験動物のケアと使用のためのガイド(2011)26に従って行われ、韓国科学技術院(KAIST)とソウル国立大学バンダン病院(SNUBH)の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 窓等の材料の準備
- 腹腔18内の腸から膵臓を隔離するために膵臓のインビタルイメージングウィンドウをカスタム設計する(図1A、B)。ウィンドウの詳細な青写真は、前の研究18の補足図に記載されています。
- C57BL/6Nマウス、8-12週齢の男性を、膵臓内イメージングに使用する。Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体を、イメージングの2時間前に、血管標識18の目的で注入する。
- 小島の研究では、小島が蛍光レポータータンパク質でタグ付けされたトランスジェニックマウスモデルを準備します。ここで、マウスインシュリン1遺伝子プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現させたMIP-GFPを利用し、マウス24内のすべての島のβ細胞において活性である。
- 膵臓癌研究のために、蛍光レポータータンパク質とBALB / Cヌードマウスでタグ付けされたトランスジェニック癌細胞を調製する。本研究では、PANC-1 NucLight赤細胞を使用した。PANC-1癌細胞25 は、NucLight赤色蛍光プローブで標識した。
- すべての外科用ツールを殺菌し、ガラスをカバー(PEGか、ないか)、およびオートクレーブを使用して窓をイメージする。
- PEGコーティングをカバーガラスに塗布して炎症反応を防ぎ、生体適合性を高め、長期イメージングに適しています。
2. 手術
- 無菌の外科用プラットフォームを準備し、70%エタノールで表面を殺菌する。
注: 縦手方向のイメージング セッションでは、無菌技術が不可欠です。 - タイルアミン/ゾラゼパム(30 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の混合物でマウスを麻酔します。
注: 高血糖の悪影響のため、ケタミンの代わりにタイルタミン/ゾラゼパムの使用をお勧めします。最適な麻酔は、実験9、27の目的のために選択されるべきです。 - 家庭温用の制御加熱パッドを備えた直腸プローブを使用して体温を監視します。
- マウスの左脇腹を剃り、交互のアルコールとヨウ素ベースのスクラブの3ラウンドを適用します。
注:脱毛剤を使用する場合は、化学的な火傷を避けるために1分以上放置しないでください。 - マウスの左脇腹に1.5cmの切開を行い、皮膚と筋肉を解剖します。
- 切開マージンに黒またはナイロン4-0縫合を使用して、財布ストリング縫合を行います。
- 切開部にマイクロリトラクタを使用し、脾臓を静かに露出させる。
- 慎重にリング鉗子で脾臓をプールし、膵臓を識別します。
- マウスの脇腹に窓を置き、窓の空きスペースを通して脾臓と膵臓を渡します。膵臓の操作は、出血や膵炎を引き起こす可能性がありますので、非常に異邦性でなければなりません
- イメージングウィンドウのプレートに膵臓をそっと置きます。脾臓はウィンドウの空きスペースに配置されます。
- がん細胞の研究のために、膵臓にPANC-1 NucLightレッド(1.0 x 106 細胞)を直接注入します。
注:異種ヒト膵臓がんの異種移植片の異所性ヒトと同位体を画像化するために、PANC-1または他のヒト膵臓癌細胞などの癌細胞の直接移植を28に促進することができる。生体内蛍光顕微鏡法で可視化するために、PANC-1細胞を、核29に標識するNucLightレッドレンチウイルス試薬を用いて赤色蛍光タンパク質でトランステーションした。最大射出量は不明であるが、膵臓の圧力効果を避けるために、可能な限り体積を減少させる。 - イメージングウィンドウの余白にN-ブチルシアノアクリル酸接着剤の滴を塗布します。
- 塗布された接着剤の量を最小限に抑えるには、31Gカテーテル針を使用して塗布します。ドロップの量が大きい場合、組織は意図せずに窓やカバーガラスに付着します。
- 12mmの丸いカバーガラスを撮像窓の余白にそっと塗布します。
- 縫合ループを引っ張って窓の側面溝に収まり、3回結びます。
- これらのマウスが目を覚ましているときにタイトなステッチの中断を防ぐために結び目の最大近位部位をカットします。
- マウスは麻酔から回復させ(2〜3時間)、ケトプロフェン(5mg /kg、首の基部または動物の股関節の緩い皮膚に皮下)を注入して痛みを軽減させます。12時間ごとに痛みの徴候を再評価し、ケトプロフェンは1〜3日間24時間ごとに考慮する必要があります。
注:鎮痛はグルコース9に応答してインスリン分泌に影響を与える。鎮痛の選択とタイミングは、実験目的のために個別化されなければならない。 - ケージにマウスを付着し、十分な寝具で、窓がケージに接触するのを避ける。窓の手術なしでマウスで家を収容しないでください。
3. 生体内イメージング
- レーザーパワーを含む生体内顕微鏡をオンにします。
- 加熱パッドをオンにし、家庭温の調節を37°Cに設定します。
注:または、ホーム熱調節がない場合は、頻繁に制御するパッシブ加熱パッドまたはランプを使用してください。 - タイルアミン/ゾラゼパム(30 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の混合物で筋肉内麻酔を行います。
注: 高血糖の悪影響のため、ケタミンの代わりにタイルタミン/ゾラゼパムの使用をお勧めします。最適な麻酔は、実験9、27の目的のために選択されるべきです。 - 注射のために血管カテーテルを挿入します。
- 止血帯アプリケーションの代替として、人差し指と3本目の指で尾の近位側に圧力をかけます。必要に応じて、ランプで尾部を熱します。
- 70%エタノールスプレーで尾静脈を殺菌する。
- 30Gカテーテルを横尾静脈に挿入します。血液の逆流は、PE10チューブで可視化されます。
- カテーテルに絹のテープを貼って安定させる。
- FITC/TMRデキストランまたは他の蛍光プローブ(25μgの抗CD31をAlexa 647と共役)を適宜注入し、蛍光プローブ18の組み合わせに従って注入する。
注:蛍光共役抗体プローブの場合は、イメージングセッションの前に2時間注入します。
- 手術用プラットフォームからイメージング段階にマウスを移します。
- 直腸プローブを挿入して、家庭温熱パッドシステムで体温を自動的に制御します。
- 膵臓イメージングウィンドウを、生体内顕微鏡のセットアップ中に準備したウィンドウホルダーに挿入します(図2)。逆顕微鏡の場合、窓ホルダーは必要ない場合があります。
- インビタルイメージングを行います。
- 膵臓のイメージングの場合、膵臓イメージングウィンドウ(推奨視野:2500 x 2500 μm)で膵臓の全視をスキャンするための低倍率対物レンズ(例えば、4x)から始めます。
- 対象領域を決定した後、より高い拡大倍率の対物レンズ(20xまたは40x)に切り替えて、細胞レベルイメージング(推奨視野:500 x 500 μmまたは250 x 250 μm)を実行します。この実験では、横方向と軸方向の分解能はそれぞれ約0.5μmと3μmであった。
- Zスタックまたはタイムラプスイメージングを実行して、細胞移動などの3D構造または細胞レベルのダイナミクスを観察します。
注:トランスジェニック動物(MIP-GFP)の蛍光タンパク質発現細胞をイメージングするため、0.43mWまでの電力での間欠的な488 nmレーザー露光の30秒は、目立つ光の切り落としや組織損傷なしに許容可能であった。Alexa 647で標識された蛍光タンパク質をイメージングするために、640 nmレーザーパワーは0.17mWまで、目立つ光漂白や組織損傷を伴わずに許容可能でした。この設定を上回るパワーで長時間の励起レーザー露光は、光毒性による光の漂白または組織の損傷につながる可能性があります。適切なゲインと電力を調整して、対象領域を適切に画像化します。インビタル顕微鏡検査におけるパラメータの詳細設定は、研究所で作成された各インビタル顕微鏡検査に個別化する必要があります。
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Representative Results
生体内顕微鏡検査と統合された膵臓内イメージングウィンドウを組み合わせることで、マウス内の膵臓の縦方向の細胞レベルのイメージングが可能になります。膵臓のイントビタルイメージングウィンドウを備えたこのプロトコルは、高解像イメージングの取得を可能にする長期組織安定性を提供し、個々の膵島を最大3週間追跡します。その結果、視野の拡大、zスタックイメージングの3次元(3D)再構成、および同じ位置の縦方向追跡のためのモザイク画像化が達成できる。さらに、当社の生体内顕微鏡は4つのチャネル(405、488、561、647 nm)の取得を提供し、同時に複数の細胞を可視化し、相互作用を伴います。
予備イメージングのために、窓を、Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体を静脈内注射してC57BL/6Nマウスに移植した。広域イメージング(図3A)および拡大3D撮像(図3B-D、補助ビデオ1)の膵臓をこのシステムで容易にした。膵組織を自己蛍光で可視化し、抗CD31抗体で標識された隣接血管構造を同定した。蠕動または呼吸による振動は特定されず、信号対雑音比の高い平均画像化を行った(図4)。膵臓の微小解像度で視覚化を必要とするAcinar細胞は、平均画像で明確に視覚化された。
小島のイメージングには、MIP-GFPマウスを利用した。モザイクイメージング法を用いて、高解像度画像を用いた広視野ビューにより、隣接する血管系を有する小島の可視化が可能になった(図5)。広視野図では約40~50個の島が確認された。この安定したイメージング法は、前の研究(図6)18に示すように、最大3週間の小島の追跡をさらに容易にする可能性がある。
癌細胞イメージングの場合、PANC-1 NucLight赤細胞は手術中にマウス膵臓に直接移植された(図7)。PANC-1 NucLight赤細胞と、Alexa 647と共役した反CD31で染色された近くの血管からなるデュアルラベリング戦略が使用されました。我々のプロトコルにより、腫瘍のマージンを示す膵臓癌(図7A)の広視野イメージング、および単細胞レベルでの高解像度3Dイメージングが達成された(図7B-D、補足ビデオ2)。
図1:膵臓内イメージングウィンドウの設計と写真(A)膵臓内イメージングウィンドウの3次元および断面図。サイズと直径の詳細な青写真は、前の論文18に記載されています。(B)膵臓イメージングウィンドウの前写真と後方写真。糖尿病の糖尿病の2020韓国糖尿病協会 2020 44:1:193-198.韓国糖尿病学会の許可を得て転載。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:膵臓内イメージングウィンドウの実施の写真 膵臓のインビタルイメージングウィンドウは、XYZの翻訳段階でマウスに埋め込まれ、傾斜台に取り付けられた画像チャンバーホルダーは、膵臓イメージングウィンドウに接続されています。糖尿病の糖尿病の2020韓国糖尿病協会 2020 44:1:193-198.韓国糖尿病学会の許可を得て転載。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:C57BL/6Nマウスにおける代表的な膵臓内イメージング(A)広域画像及び(B)C57BL/6Nマウスにおける膵臓(緑色)とその微小血管(赤)の3D画像を拡大した。血管は、Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体で標識されています。(C)3D再構成画像とマウス膵臓の表面レンダリング画像(スケールバー:200 μm(A)および50 μm(B-D)補足ビデオ 1も参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アシナル細胞と隣接血管系の生体内イメージング C57BL/6Nマウスのアシナル細胞(緑色)および隣接血管構造(赤)。血管は、Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体で標識されています。膵臓イメージングウィンドウで達成された組織の安定性は、高い信号対雑音比画像を提供します。スケールバー:50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MIP-GFPマウスにおける膵島の生体内イメージングの代表 MIP-GFPマウスの膵臓で最大強度投影法で処理された広域モザイクおよび小島(緑色)および隣接する脈管(赤)の拡大画像。血管は、Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体で標識されています。スケールバー:500 μm(広域)および50 μm(拡大)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:MIP-GFPマウス膵臓中の膵島の縦方向のインビタルイメージング MIP-GFPマウスの膵臓で最大3週間の膵島の縦画像。色が異なる矢印は、それぞれ同じ島を示します。スケールバー:100 μm。糖尿病の糖尿病の2020韓国糖尿病協会 2020 44:1:193-198.韓国糖尿病学会の許可を得て転載。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:膵臓癌モデルの代表的な生体内画像化(A)広域画像及び(B)BALB/cヌードマウスに埋め込まれたPANC-1 NucLight赤細胞(赤)の拡大3D画像。血管(青)は、Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体で標識されています。(C)3D再構成画像と(D)マウスモデルにおける膵臓癌の表面レンダリング画像。スケールバー:500 μm(A)および50 μm(B-D)補足ビデオ 2も参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:C57BL/6Nマウスにおけるインビボ3D膵臓イメージング。 インビボ3Dイメージングの膵臓(緑色)のC57BL/6Nマウスのアレクサ647フルオロフォア(赤色)と共役した抗CD31抗体を静脈内に注入した。スケールバーはビデオに描かれています。このビデオは図3C,Dに対応しています。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足ビデオ 2: IN vivo 3D 膵臓癌 (PANC-1 NucLight レッド) BALB/C ヌード マウスでのイメージング.BALB/Cヌードマウスに移植された膵臓癌(赤)のインビボ3Dイメージングは、Alexa 647フルオロフォア(青)と共役した抗CD31抗体を静脈内に注入した。スケールバーはビデオに描かれています。このビデオは図7C,Dに対応しています。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、腹部イメージングウィンドウから修飾された新しい支持基盤統合膵臓イントコールイメージングウィンドウを用いた膵臓の生体内画像化から構成される。上記のプロトコルの中で、第1の重要なステップは、マウスにおける膵臓内イメージングウィンドウの移植である。窓の接着剤の塗布のためには、窓の余白とカバーガラスの間に接着剤を塗布することが重要ですが、膵臓組織には接着剤を塗布しないことが重要です。ガラスと組織の間の接着剤自体だけでなく、接着が直接組織に塗布された場合、補助的な塵粒子がイメージング中に光散乱を誘発する可能性があります。また、接着剤の適用は、膵臓に毒性および非生理学的な影響を有し得る。
第2のステップは、金属支持基板に配置された膵臓組織の量である。膵臓組織はシート状の構造であるため、プレート上の膵臓組織の体積を制御する必要があります。大きなボリュームがプレートに置かれると、リングの余白に塗布された接着剤が組織に付着し、質量効果が膵臓の灌流を妨げる可能性があります。一方、小さすぎるボリュームが置かれると、視覚化できる視野が限られる場合があります。窓の外科のこの議定書は一貫した標準を満たすためにいくつかの試験を必要とするかもしれない。
3週間の期間にわたる長期イメージングの場合、最も懸念される問題は膵臓イメージングウィンドウへの潜在的な損傷であった。膵臓イメージングウィンドウ内のカバーガラスの意図しない破壊は、長期観察期間中に発生する可能性があります。これを防ぐには、ウィンドウを持つマウスを別々に収納し、鋭いエッジを持つハードオブジェクトをケージから取り除く必要があります。マウスの安楽死は、窓の近くに炎症の重篤な徴候がある場合、または動物が苦しんでいるように見える場合は、カバーガラスが割れる場合に考慮されるべきです。私たちの経験では、膵臓イメージングウィンドウを持つマウスは、手術後の回復が適切であり、他の合併症が発症しなかったときに、正常に食事と運動をすることができました。
腹部イメージングウィンドウでの以前の経験では、我々は、高品質の細胞レベルのイメージングだけでなく、複数の日にわたって同じスポットの縦方向の追跡を取得することができませんでした。様々な腹部器官に多様なプラットフォームを提供する腹部イメージングウィンドウと比較して、膵臓イメージングウィンドウは、膵臓だけでなく、軟らかく、腸、脾臓、小腸などの動きによって影響を受けやすい他の器官を画像化するためにさらに指定されています。しかし、肝臓と腎臓は、限られたスペースのために膵臓イメージングウィンドウでは実現不可能である可能性があります。
蛍光マウス、細胞、および抗体プローブの組み合わせは、内皮細胞と小島または癌細胞との間の動的相互作用の可視化を可能にする一方で、ここで説明するプロトコルは、それぞれの条件に適した蛍光標識細胞または分子プローブの他の組成物と共に再現することができる。さらに、インスリン分泌を有するCpepSfGFPレポーターマウス(9、30、AAV8媒介遺伝子送達)31、または同局の腫瘍が腫瘍の微細環境を完全に刺激できる異形性腫瘍モデル32、33、34など、我々の方法と統合された広範な応用が期待される。さらに、患者由来の異種移植片モデルも、当社のプラットフォーム36を用いて研究することができる。
この研究で取り上げられるいくつかの制限があります。まず、金属ベースを安定化に利用しても、ベースガラスやカバーガラスによって組織に引き起こされる機械的ストレスを判断できず、血流に影響を与える可能性がありました。しかし、上記の図に示すように、蛍光結合抗体(CD31)またはデキストランの静脈内注射は、血管に対して区別可能な非透過領域を十分に標識し、膵臓組織内の正常な血流に対する機械的ストレスの影響を最小限に抑ことを示唆している。第二に、接着剤による有害反応は、膵臓組織において評価することができなかった。それにもかかわらず、追加の効果を避けるために、できるだけ慎重に接着剤で膵臓に触れないようにしました。第三に、上で議論したように、麻酔薬の意図しない影響は、インスリン感受性および分泌に影響を及ぼす可能性がある、前の研究9,27に記載されている。我々の経験では、ケタミンとキシラジンの混合物は、タイルタミン、ゾラゼパム、およびキシラジンの混合物と比較して高血糖を誘発した。インスリン分泌に対する麻酔の効果を調査するさらなる研究を行う必要があり、各実験に従って、最小限の副作用で適切な麻酔を選択する必要があります。.第4に、膵臓の画像化は尾部に焦点を当てており、膵臓の頭部部分のイメージングは、我々の窓と共に制限され得る。
要約すると、膵臓の安定化縦断イメージングを数週間程度の細胞レベルで行い、イン ビボ 膵臓イメージング用に最適化された膵臓内イメージングウィンドウと統合したイメージングシステムによって促進されました。生体内イメージングは細胞生物学、免疫学、腫瘍生物学に関する動的な洞察を提供するため、このプロトコルは膵臓を含む様々な疾患の病態生理学を調べるための有用な方法となり得る。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
本研究は、SNUBH研究基金からの助成金第14-2020-002、韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)助成金(NRF-2020R1F1F1A1058381、NRF-2020R1A2C3005694)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
