I denne protokollen er AAV2 vektor produsert av co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med baculovirus (BV)-AAV2-grønn fluorescerende protein (GFP) eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap infiserte Sf9 celler i suspensjon kultur. AAV-partikler frigjøres fra cellene ved hjelp av vaskemiddel, avklares, renses av affinitetskolonnekromatografi og konsentreres av tangentiell strømningsfiltrering.
Adeno-assosierte virus (AAV) er lovende vektorer for genterapiapplikasjoner. Her produseres AAV2-vektoren av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9-celler infisert med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspensjonskultur. Celler dyrkes i en kolbe i en orbital shaker eller Wave bioreactor. For å frigjøre AAV-partiklene lyser produsentceller i buffer som inneholder vaskemiddel, som deretter avklares ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra cellelysatet ved hjelp av AVB Sepharose kolonnekromatografi, som binder AAV-partikler. Bundne partikler vaskes med PBS for å fjerne forurensninger og unngås fra harpiksen ved hjelp av natriumsitratbuffer ved pH 3.0. Den sure eluate er nøytralisert med alkalisk Tris-HCl buffer (pH 8.0), fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS), og videre konsentrert med tangentiell strømningsfiltrering (TFF). Protokollen beskriver småskala preklinisk vektorproduksjon som er kompatibel med oppskalering til storskala klinisk AAV-produksjon for humane genterapiapplikasjoner.
Adeno-assosierte virus (AAV) er ikke-innhyllede menneskelige parvovirus som inneholder et enkeltstrenget DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flere fordeler i forhold til andre virusvektorer for genterapiapplikasjoner1,2,3,4. AAVer er naturlig replikeringsinkompetente, og krever dermed et hjelpervirus og vertsmaskiner for replikering. AAVer forårsaker ingen sykdom og har lav immunogenisitet hos den infiserte verten3,5. AAV kan infisere både passiviserende og aktivt dele celler og kan vedvare som episome uten å integrere seg i genomet til vertscellene (AAV integreres sjelden i vertsgenomet)1,3. Disse funksjonene har gjort AAV til et ønskelig verktøy for genterapiapplikasjoner.
For å generere en AAV-genoverføringsvektor klones transgene kassetten, inkludert det terapeutiske genet, mellom to interne terminalrepriser (ITR), som vanligvis er avledet fra AAV-serotypen 2. Maksimal størrelse fra 5′ ITR til 3′ ITR, inkludert transgenesekvensen, er 4,6 kb6. Ulike capsids kan ha en annen celle eller vev tropisme. Derfor bør capsids velges basert på vevet eller celletypen som er ment å være målrettet med AAV-vektoren7.
Rekombinante AAV-vektorer produseres ofte i pattedyrcellelinjer som humane embryonale nyreceller, HEK293 ved forbigående transfeksjon av AAV-genoverføringsvektoren, AAV rep-cap og hjelpervirusplasmider2,3. Det er imidlertid flere begrensninger for storskala AAV-produksjon ved forbigående transfeksjon av tilhenger HEK293-celler. For det første er det nødvendig med et stort antall cellebunker eller rulleflasker. For det andre er det nødvendig med plasmid DNA og transfeksjonsreagenser av høy kvalitet, noe som øker produksjonskostnadene. Til slutt, når du bruker tilhenger HEK293-celler, er serumet ofte nødvendig for optimal produksjon, noe som kompliserer nedstrøms prosessering1,2,3. En alternativ metode for AAV-produksjon innebærer å bruke insektcellelinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler, og et insektvirus kalt rekombinant Autographa californica multicapsid kjernefysisk polyhedrosevirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler dyrkes i serumfri suspensjonskultur som er lett å skalere opp og er kompatibel med dagens god produksjonspraksis (cGMP) produksjon i stor skala, noe som ikke krever plasmid- eller transfeksjonsreagenser. Videre er kostnaden for AAV-produksjonen ved hjelp av Sf9-baculovirus-systemet lavere enn kostnaden ved å bruke forbigående transfeksjon av plasmider i HEK293-celler11.
Det opprinnelige rAAV-produksjonssystemet ved hjelp av baculovirus-Sf9-celler brukte tre baculovirus: ett baculovirus som inneholder genoverføringskassett, det andre baculoviruset som inneholder rep-gen, og det tredje baculoviruset som inneholder serotype-spesifikt kapsidgen12,13. Imidlertid var baculoviruset som inneholder repkonstruksjon genetisk ustabilt ved flere runder med passasjer, noe som forhindret forsterkning av baculoviruset for den store AAV-produksjonen. For å løse dette problemet ble det utviklet et nytt rAAV-vektorsystem, som inneholdt to baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som inneholder AAV-genoverføringskassett og et annet baculovirus som inneholder AAV rep-cap-genene sammen som er genetisk mer stabile enn det opprinnelige systemet og mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av TwoBac i stedet for tre14, 15. OneBac-systemet bruker AAV-genoverføringskassett og rep-cap-genene i et enkelt baculovirus som er mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av ett baculovirus i stedet for å bruke TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie ble TwoBac-systemet brukt til optimalisering.
Baculovirussystemet for AAV-produksjon har også begrensninger: baculoviruspartikler er ustabile for langvarig lagring i serumfritt medium11, og hvis baculovirustitren er lav, er det nødvendig med et stort volum baculovirus supernatant, som kan bli giftig for veksten av Sf9-celler under AAV-produksjon (personlig observasjon). Bruk av titerfrie infiserte celler og oppskaleringsceller (TIPS) eller baculovirusinfiserte insektceller (BIIC), gir et godt alternativ for AAV-produksjon der baculovirusinfiserte Sf9-celler fremstilles, kryopreservert og deretter brukes til infeksjon av friske Sf9-celler. En annen fordel er økt stabilitet av baculovirus (BV) i Sf9 celler etter kryopreservering10,11.
To typer TIPS-celler genereres for å muliggjøre AAV-produksjon: den første ved infeksjon av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, og den andre ved infeksjon av Sf9-celle med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler er kryopreservert i små og bruksklare aliquots. AAV-vektorer produseres i serumfri fjæringskultur i en kolbe plassert i en orbital shaker eller Wave bioreactor ved å kokulturere TIPS-celler som produserer baculovirus og friske Sf9-celler. Sf9 celler er infisert av baculovirus som bærer AAV2-GFP vektoren og rep-cap sekvenser for å generere AAV. Fire til fem dager senere, når AAV-utbyttet er det høyeste, lyser produsentcellene med vaskemiddel for å frigjøre AAV-partiklene. Cellelyset avklares deretter ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra lysatet ved AVB Sepharose kolonnekromatografi. Til slutt er AAV-vektorer konsentrert ved hjelp av TFF. Protokollen beskriver produksjonen av AAV i liten skala, nyttig for forskning og prekliniske studier. Metodene er imidlertid skalerbare og kompatible med produksjon av AAV-vektorer av klinisk kvalitet for genterapiapplikasjoner.
Parametrene som brukes i denne protokollen for prosessutvikling av produksjon, rensing og konsentrasjon av AAV-vektorer, kan brukes på både liten og storskala produksjon av AAV-vektorer for genterapiapplikasjoner. Hele oppstrøms- og nedstrømsprosessen kan utføres i et lukket system som er kompatibelt med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP). De viktigste fordelene med Sf9-baculovirus-systemet er skalerbarhet for storskala GMP-klasse AAV-produksjon til en overkommelig pris. Systemet trenger ikke dyre plasmid…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) for sjenerøst å gi oss AAV-plasmidene og Danielle Steele og Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet støttes av oppstartsfondet fra Cincinnati Children’s Research Foundation til M.N.
1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |