Summary
Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje vereist een geschikt softwarepakket en een gebruiksvriendelijke pijplijn voor automatische data-acquisitie met hoge doorvoer. Hier presenteren we de toepassing van een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie, Latitude-S, en een praktische pijplijn voor het verzamelen van gegevens van verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.
Abstract
In de afgelopen jaren hebben technologische en methodologische ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) een nieuwe weg vrijgemaakt voor de hoge-resolutie structuurbepaling van biologische macromoleculen. Ondanks de opmerkelijke vooruitgang in cryo-EM, is er nog steeds ruimte voor verbetering in verschillende aspecten van de single-particle analyse workflow. Single-particle analyse vereist een geschikt softwarepakket voor high-throughput automatische data-acquisitie. In de afgelopen acht jaar zijn verschillende softwarepakketten voor automatische data-acquisitie ontwikkeld voor automatische beeldvorming voor cryo-EM met één deeltje. Dit artikel presenteert een toepassing van een volledig geautomatiseerde beeldacquisitiepijplijn voor verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.
Het demonstreert een softwarepakket, dat cryo-EM-gegevens volledig, automatisch en nauwkeurig kan verzamelen. Bovendien worden verschillende microscopische parameters eenvoudig geregeld door dit softwarepakket. Dit protocol demonstreert het potentieel van dit softwarepakket in geautomatiseerde beeldvorming van het spike-eiwit severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) met een 200 keV cryo-elektronenmicroscoop uitgerust met een directe elektronendetector (DED). Ongeveer 3.000 cryo-EM-filmbeelden werden verkregen in een enkele sessie (48 uur) van gegevensverzameling, wat een atomaire resolutiestructuur van het spike-eiwit van SARS-CoV-2 opleverde. Bovendien geeft deze structurele studie aan dat het spike-eiwit twee belangrijke conformaties aanneemt, 1-RBD (receptor-bindend domein) open en alle RBD-down gesloten conformaties.
Introduction
Cryo-EM met één deeltje is een mainstream structurele biologietechniek geworden voor structuurbepaling met hoge resolutie van biologische macromoleculen1. Reconstructie van één deeltje is afhankelijk van het verkrijgen van een groot aantal microfoto's van verglaasde monsters om tweedimensionale (2D) deeltjesbeelden te extraheren, die vervolgens worden gebruikt om een driedimensionale (3D) structuur van een biologisch macromolecuul te reconstrueren2,3. Vóór de ontwikkeling van DED's varieerde de resolutie die werd bereikt met een reconstructie van één deeltje tussen 4 en 30 Å4,5. Onlangs is de haalbare resolutie van cryo-EM met één deeltje verder gegaan dan 1,8 Å6. DED en geautomatiseerde software voor gegevensverzameling hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan deze resolutierevolutie7, waarbij menselijke tussenkomst voor gegevensverzameling minimaal is. Over het algemeen wordt cryo-EM-beeldvorming uitgevoerd met lage elektronendosissnelheden (20-100 e / Å2) om door elektronenbundels geïnduceerde stralingsschade van biologische monsters te minimaliseren, wat bijdraagt aan de lage signaal-ruisverhouding (SNR) in het beeld. Deze lage SNR belemmert de karakterisering van de hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen met behulp van single-particle analyse.
De nieuwe generatie elektronendetectoren zijn CMOS-gebaseerde detectoren (complementary metal-oxide-semiconductor), die deze lage SNR-gerelateerde obstakels kunnen overwinnen. Deze CMOS-camera's met directe detectie maken een snelle uitlezing van het signaal mogelijk, waardoor de camera bijdraagt aan een betere puntspreidingsfunctie, geschikte SNR en uitstekende detective quantum efficiency (DQE) voor biologische macromoleculen. Directe detectiecamera's bieden een hoge SNR8 en weinig ruis in de opgenomen beelden, wat resulteert in een kwantitatieve toename van de detective quantum efficiency (DQE) - een maat voor hoeveel ruis een detector aan een afbeelding toevoegt. Deze camera's nemen ook films op met een snelheid van honderden frames per seconde, wat snelle gegevensverzameling mogelijk maakt9,10. Al deze eigenschappen maken snelle directe detectiecamera's geschikt voor toepassingen met een lage dosis.
Bewegingsgecorrigeerde stapelafbeeldingen worden gebruikt voor gegevensverwerking om 2D-classificatie te berekenen en een 3D-dichtheidskaart van macromoleculen te reconstrueren met behulp van verschillende softwarepakketten zoals RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 en EMAN215. Voor analyse van één deeltje is echter een enorme dataset nodig om een structuur met hoge resolutie te bereiken. Daarom zijn automatische tolheffingen voor gegevensverzameling zeer essentieel voor het verzamelen van gegevens. Om grote cryo-EM datasets vast te leggen, zijn de afgelopen tien jaar verschillende softwarepakketten gebruikt. Speciale softwarepakketten, zoals AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS en EPU, zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde gegevensverzameling.
Deze softwarepakketten gebruiken routinetaken om automatisch gatposities te vinden door de afbeeldingen met lage vergroting te correleren met afbeeldingen met een hoge vergroting, wat helpt bij het identificeren van gaten met glasachtig ijs van geschikte ijsdikte voor beeldacquisitie onder omstandigheden met een lage dosis. Deze softwarepakketten hebben het aantal repetitieve taken verminderd en de doorvoer van de cryo-EM-gegevensverzameling verhoogd door gedurende meerdere dagen continu een enorme hoeveelheid gegevens van goede kwaliteit te verzamelen, zonder enige onderbreking en de fysieke aanwezigheid van de operator. Latitude-S is een vergelijkbaar softwarepakket, dat wordt gebruikt voor automatische gegevensverzameling voor analyse van één deeltje. Dit softwarepakket is echter alleen geschikt voor K2/K3 DED's en wordt bij deze detectoren geleverd.
Dit protocol demonstreert het potentieel van Latitude-S in de geautomatiseerde beeldacquisitie van SARS-CoV-2 spike-eiwit met een directe elektronendetector uitgerust met een 200 keV cryo-EM (zie de tabel met materialen). Met behulp van deze tool voor gegevensverzameling worden automatisch 3.000 filmbestanden van SARS-CoV-2 spike-eiwit verkregen en wordt verdere gegevensverwerking uitgevoerd om een spike-eiwitstructuur met een resolutie van 3,9-4,4 Å te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Er zijn drie belangrijke stappen nodig voor cryo-EM-gegevensverzameling: 1. cryo-EM-rastervoorbereiding, 2. kalibratie en uitlijning van de microscoop, 3. automatische gegevensverzameling (figuur 1). Verder is geautomatiseerde gegevensverzameling onderverdeeld in a. geschikte gebiedsselectie, b. optimalisatie van Latitude-S, c. automatische gatselectie starten en d. automatische gegevensverzameling starten (figuur 1).
1. Cryo-EM-rastervoorbereiding en monsterbelasting voor automatische gegevensverzameling
- Reinig de roosters met een gloethesser en varieer de gloeie-ontladingsparameters op basis van experimentele vereisten (hier 60 s bij 20 mA).
- Voeg een vers bereid eiwitmonster (3 μL) toe aan het gloeiende rooster en incubeer gedurende 10 s.
- Dep de roosters voor 3-5 s bij 100% vochtigheid en dompel ze snel in vloeibaar ethaan met behulp van een cryo-plunjer.
- Klem de roosters handmatig in een clipring om de cartridge te vormen met behulp van een flexibele C-clip ring.
- Plaats de bevroren cartridge-gemonteerde roosters in de autoloader-cassette en breng de cassette via de nanodop over naar de voorgekoelde autoloader van de microscoop voor gegevensverzameling.
2. Microscoopafstemming en basisuitlijning vóór automatische gegevensverzameling
- Bundelverschuiving
- Klik op Beam shift op het tabblad Direct Alignment .
- Verklein de vergroting en centreer de bundel op de optische as met behulp van de multifunctionele X- en Y-knop .
- Uitlijning van draaipunt
- Klik op de optie Beam tilt in Direct Alignment pp X op het tabblad Direct Alignment .
- Condenseer de straal tot een plek en minimaliseer de beweging met behulp van de multifunctionele X- en Y-knop .
- C2 diafragma centreren
- Selecteer de condensoropening op het tabblad Uitlijning .
- Condenseer de bundel tot een plek, centreer de bundel naar de optische as en breid de bundel vervolgens uit om de cirkel gelijkmatig te bedekken.
- Herhaal deze stappen totdat het diafragma van Condenser 2 is aangepast.
- Coma-vrije uitlijning
- Klik op Coma-free Alignment X op het tabblad Direct Alignment om de bundel uit te lijnen met de optische as.
- Gebruik de multifunctionele knop om de vorm en de beweging van de FFT te minimaliseren (zorg ervoor dat deze stabiel is).
- Herhaal dezelfde procedure voor Coma - vrije uitlijning Y.
- Stel parallelle verlichting in vóór gegevensverzameling in de cryo-EM vanwege de C-dubbele lens.
- Plaats het objectiefopening (70 μm) in de diffractiemodus.
- Stel het objectiefopening scherp op het voorste brandpuntsvlak van de diffractielens door de defocus-intensiteitsknop (objectieflens en C2-lensstroom) te regelen.
- Zorg ervoor dat de scherpe rand van het objectiefopening zichtbaar is na de juiste onscherpte.
- Plaats de bundelstopper en verdeel de intensiteit totdat de goudpoederdiffractieringen tot een minimum zijn beperkt.
OPMERKING: Als de bundel goed is verspreid, is een duidelijke diffractiering van het goudpoeder zichtbaar op het scherm, wat aangeeft dat de straal evenwijdig is. - Trek de bundelstopper terug na het instellen van de parallelle verlichting en verander de microscoopmodus in Nano-sonde.
OPMERKING: Controleer de microscoopafstemming voordat u begint met het verzamelen van gegevens om de optimale prestaties van de microscoop te garanderen. Al deze instellingen zouden worden uitgevoerd in de microscoop Direct Alignment GUI Tab. Alle microscoopafstemming wordt uitgevoerd met behulp van een testraster voordat gegevens worden verzameld.
3. Gegevensverzameling met Latitude-S
- Start de geautomatiseerde software voor gegevensverzameling van Latitude-S.
OPMERKING: Voor de installatie van Latitude-S is ook microscoopkalibratie vereist, die wordt uitgevoerd voordat de gegevens worden verzameld, en de instellingen worden permanent opgeslagen. Vijf verschillende toestanden voor gegevensverzameling zijn gekalibreerd met vier verschillende vergrotingen (figuur 1 en figuur 2). Atlasstatus en rasterstatus bevinden zich in twee verschillende vergrotingen in LM-modus (lage vergrotingsbereiken). De gatstatus bevindt zich in de SA-modus (hoge vergrotingsbereiken), maar met een matige vergroting. Focus en gegevensstatus gebruiken de SA-modus met hoge vergroting.- Klik op DigitalMicrograph in het menu Start of dubbelklik op het DigitalMicrograph-pictogram op het bureaublad.
- Selecteer het pictogram Techniekbeheer van DigitalMicrograph.
OPMERKING: Dit systeem toont TEM - en Latitude-S-pictogrammen (figuur 2 en aanvullende figuur S1). - Selecteer het Latitude-S-pictogram voor geautomatiseerde gegevensverzameling met één deeltje.
OPMERKING: De K2-camera werkt in drie modi: lineair/geïntegreerd, geteld en superresolutie. De gebruiker kan elke modus selecteren in de interface van DigitalMicrograph. Gegevensafbeeldingen kunnen worden opgeslagen als dosisgefractioneerde afbeeldingsstapels of als opgetelde afbeeldingen in MRC-, TIF- of .dm4-bestanden met verschillende bitdiepten. Bovendien konden gegevens worden opgeslagen als bewegingsgecorrigeerde beelden voor de K3-camera. Op een K2-camera kan een onbewerkte afbeeldingsstapel worden opgeslagen als 4-bits MRC-, 8-bits TIF- of 8-bits DM4-bestanden.
- Maak een nieuwe sessie op basis van de instellingen van een vorige sessie.
- Schakel het selectievakje Op basis van eerdere sessie in het palet in.
- Selecteer de knop Nieuw .
- Kies de map met de sessie waarop de instellingen van de nieuwe sessie zijn gebaseerd. Ga naar de vorige sessiemap om de nieuwe sessie te maken. Kies de map waarin u de nieuwe sessie en de bijbehorende gegevens wilt opslaan.
- Selecteer en kies de map waarin de nieuwe sessie en de bijbehorende gegevens worden opgeslagen.
OPMERKING: Elke status en de onderliggende instellingen (vergroting, verlichtingsomstandigheden, afbeelding of projector) en beam shift- en cameraparameters (totale belichting, belichting met één frame en binning) worden geëxporteerd van de bestaande sessie naar de nieuwe sessie. Het pad van de map wordt weergegeven als een tekenreeks onder aan het palet. Elk van de toestanden en configuratiepaletten heeft een sterretje (*) toegevoegd aan de titel om aan te geven dat het al is ingesteld en klaar is voor gebruik.
- Een bestaande sessie voortzetten.
- Druk op de knop Doorgaan in het palet om door te gaan met een bestaande sessie.
OPMERKING: De atlasmontage kan niet worden gewijzigd. - Kies en navigeer naar de map met de sessie die moet worden voortgezet.
- Druk op de knop Doorgaan in het palet om door te gaan met een bestaande sessie.
- Start een geheel nieuwe sessie.
- Klik op Nieuw tabblad in het palet. Kies de map met de sessie die moet worden voortgezet. Selecteer een map om de gegevens op te slaan.
OPMERKING: De standaardmapnaam wordt gemaakt met behulp van de datum en tijd. - Klik op het pictogram Instelling . Voeg in het vak Status verkennen beheren dat wordt weergegeven de status toe, stel de TEM-voorwaarde, de cameravoorwaarde en de afbeelding/stapel in en geef de status een naam.
OPMERKING: De geautomatiseerde workflow voor gegevensverzameling gebruikt 5 verschillende statussen voor geautomatiseerde gegevensverzameling. Deze toestanden worden geconfigureerd en opgeslagen in hun respectieve statuspaletten. De samenvatting van de toestand is weergegeven in tabel 1.
- Klik op Nieuw tabblad in het palet. Kies de map met de sessie die moet worden voortgezet. Selecteer een map om de gegevens op te slaan.
- Configureer de atlasstatus.
- Klik op Atlas-statuspalet.
- Configureer de atlasstatus met de volgende parameters: vergroting 115x LM-modus in nanosonde, verlichtingsomstandigheden-spotgrootte 8 en helderheid 934400, binning: 1 en camerabelichtingstijd: 1,0 s voor beeldvorming bij lage vergroting. Raadpleeg de samenvatting van de toestand in tabel 1.
- Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
OPMERKING: Atlastoestand is de laagste vergrotingstoestand, die het overzicht van het hele raster biedt (aanvullende figuur S2). Over het algemeen helpt deze toestand ons om de hele rasters bij lage vergroting te visualiseren en de ijsdikte, vlakheid en gebroken vierkant van de rasters te beoordelen. Het wordt aanbevolen om de atlas op verschillende gebieden van het raster te genereren om de optimale ijsdikte en suboptimale ijsdikte van de rasters te observeren (aanvullende figuur S3). De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
- Configureer de rasterstatus.
- Klik op het palet Rasterstatus.
- Configureer de rasterstatus met de volgende microscoopbeeldvormingsoptiek (vergroting 380x LM-modus in Nano-sonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 626.200), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1,0 s.
- Zie het overzicht van de Latitude-S-status in tabel 1.
- Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
OPMERKING: De rasterstatus is ingesteld op een vergroting die hoger is dan de atlastoestand, zodat het gezichtsveld één rastervierkant is (figuur 2). Bij deze specifieke vergroting wordt één rastervierkant waargenomen. Daarom worden gaten correct waargenomen in deze vergroting, wat helpt bij het controleren van de ijsdikte van de gaten (aanvullende figuur S4). Een eenvoudig bandpassfilter wordt gebruikt in de rasterstatus om de gaten in het patentraster te lokaliseren. De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
- Configureer de gatstatus.
- Klik op het gatenpalet.
- Configureer de hole-status met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptica (vergroting 4500x SM-modus in Nano-sonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 7 en beamdiameter 8,81 μm), binning: 1 en camerabelichtingstijd: 1,0 s.
- Wijzig de parameters indien nodig op basis van het rastertype. Zie de samenvatting van de staat in tabel 1.
- Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
OPMERKING: De SA-modus geeft een hoog vergrotingsbereik aan in de elektronenmicroscoop. De gattoestand bevindt zich in het SA-vergrotingsbereik met een gezichtsveld van enkele micrometers (10-20 μm) (figuur 2 en aanvullende figuur S4). Dit vergrotingsbereik is hoger dan de status Atlas of Grid, maar veel kleiner dan de status Focus/Data. In deze vergroting zullen individuele gaten zichtbaar zijn. De gatgrootte is geschikt om hoge mate van verontreinigingen, lege gaten en de juiste ijsdikte van de gaten te observeren. De gaten voor beeldvorming worden geselecteerd op basis van deze aannames. In de gattoestand worden twee filters gebruikt: een voor het kruiscorreleren van een gatreferentiebeeld met een nieuw gatbeeld en een andere voor het aanpassen van de podiumhoogte aan de eucentrische hoogte.
- Configureer de focusstatus.
- Klik op Focus palette.
- Configureer de focusstatus met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptiek (vergroting 45.000x SA-modus in nanosonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 934400), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1,0 s.
- Focus op het amorfe koolstofgebied in de buurt van het gat. Raadpleeg het overzicht van de Latitude-S-status in tabel 1.
- Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
OPMERKING: De SA-modus geeft een hoog vergrotingsbereik aan in de elektronenmicroscoop. De focusstatus is de hogere SA-bereikvergroting. In de focusmodus wordt de bundel verplaatst naar een nabijgelegen koolstofgebied van het doelgat en wordt automatisch scherpgesteld om de gegevens in de gegevensstatus te verzamelen. Een bandpassfilter in combinatie met een schuin of zacht rechthoekig filter wordt in de focusstatus gebruikt om de offset tussen twee focusstatusafbeeldingen van hetzelfde gebied te meten (afbeelding 2). De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
- Configureer de gegevensstatus.
- Klik op Het palet Gegevens.
- Configureer de gegevensstatus met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptiek (bijv. vergroting 28.000x, 45.000x, 54.000x in SA-modus in nanosonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 934400), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1.0 s.
- Raadpleeg de samenvatting van de Latitude-S-status in tabel 1.
- Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
OPMERKING: De gegevensstatus is de hoogste vergroting die is geselecteerd op basis van de vereisten voor pixelgrootte en doelresolutie (afbeelding 2). Over het algemeen wordt de bundel na het scherpstellen automatisch naar het doelgebied verplaatst om de gegevens te verzamelen. De bovengenoemde parameters kunnen worden gewijzigd op basis van de vereisten van de gebruiker.
4. Focus configuratie
- Klik op Focus configuratiepalet. Geef het bereik van onscherpwaarden en de stapgrootte op het gegeven tabblad op.
- Druk op de knop Volgende om naar de volgende stap te gaan.
OPMERKING: Lagere onscherptewaarden kunnen worden gebruikt voor gegevensverzameling met hoge resolutie. Over het algemeen worden -0,5 tot -3,0 μm onscherptewaarden met 0,25 of 0,5 onscherpe stapgrootten gebruikt voor beeldacquisitie. Gebruikers kunnen de focusinstellingsstap overslaan als ze alleen het voorbeeld willen screenen. Druk gewoon op de knop Volgende op het palet om de focusconfiguratiestap over te slaan.
5. Fijne uitlijning
- Focus op enkele functies op het raster (bijv. ijsverontreiniging zeshoekig ijs); zie figuur 3.
OPMERKING: Functies mogen niet te groot of te klein zijn. Ze moeten zichtbaar zijn bij zowel Atlas-toestandsvergroting 115x (LA-modus) als gegevensvergroting. - Klik op de knop Vastleggen . Plaats het rode kruisteken op dezelfde functie op elke afbeelding van verschillende toestanden.
- Begin met focus-, data- en gattoestanden omdat hun gezichtsveld veel groter is dan de atlas- en rastertoestanden. Zoom in op atlas- en rasterstatussen om het rode kruisteken op hetzelfde kenmerk in de atlas- en rastertoestanden te plaatsen.
- Klik op de knop Berekenen om de posities van vijf verschillende toestanden te berekenen, die de verschuivingen tussen elk van de toestanden berekenen en deze weergeven in het uitvoervenster.
OPMERKING: De offsetwaarden zijn geïntegreerd in de toestanden voor verder gebruik (figuur 3). Fijne uitlijning wordt uitgevoerd om een hoge nauwkeurigheid van de positie van elke toestand te bieden (figuur 3). Deze fijne uitlijning helpt bij het bepalen van de exacte positie in alle vijf de toestanden. Fijnuitlijning is van cruciaal belang voor de acquisitie van gegevens met één deeltje. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om Fine Alignment uit te voeren voordat u een afbeelding maakt.
6. Procedure voor gegevensverzameling met Latitude-S
- Klik op het palet Vastleggen.
OPMERKING: Over het algemeen worden atlasgegevens verzameld bij lage vergroting (115x) om de meeste rastervierkanten te visualiseren. - Kies de grootte van de atlas om het volledige raster of een deel van het raster te bedekken op basis van de vereiste (bijvoorbeeld 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 of 8 x 12).
OPMERKING: 16 bij 16 atlasformaat beslaat het hele raster. - Klik op de knop Vastleggen om de atlas vast te leggen.
OPMERKING: Het hoofdnavigatievenster van Latitude-S wordt geopend en vult de beschikbare ruimte in DigitalMicrograph (aanvullende figuur S5). Drie afbeeldingsvensters in het hoofdnavigatievenster tonen afbeeldingen van de systeemstatussen met drie verschillende vergrotingen. De algemene atlas wordt momenteel in zijn huidige staat van verwerving weergegeven in het meest linkse deelvenster. Tegels in de atlas zullen vol raken als elke opname plaatsvindt. - Selecteer het rastervierkant op basis van de ijsdikte door op de atlas te navigeren (aanvullende figuur S5). Zodra de gewenste rastervierkanten zijn geselecteerd, klikt u op de knop Plannen en ziet u hoe de tegels in het rasterplein vollopen terwijl elk rastervierkant wordt vastgelegd.
- Klik op de knop Plannen zodra de rastervakken zijn geselecteerd.
- Selecteer een representatief gat in het rastervierkant door de positie toe te voegen. Zodra een gatafbeelding is verkregen, definieert u de gegevens en focusposities en slaat u de lay-out op als een sjabloon (aanvullende figuur S6).
- Klik op Automatisch zoeken, geef de gatgrootte op (bijv. R1.2 / 1.3) en klik op de knop Zoeken in het programma, waardoor het programma Zoeken automatisch de gaten vindt op basis van de gatdiameter. Klik vervolgens op de knop Markeren om de sjabloon toe te voegen (figuur 4) en voeg rode cirkelmarkeringen toe in alle gaten in één raster of gedeeltelijk rastervierkant.
- Stel de intensiteit in om de gaten uit het rastervierkant en de ijsverontreiniging te verwijderen (figuur 4).
OPMERKING: Ten slotte worden de geselecteerde gaten geel gemarkeerd voor het plannen van de gegevensverzameling. - Klik op de knop Plannen in Latitude-taken nadat u de gaten hebt toegevoegd via Automatisch zoeken.
OPMERKING: Voordat u de geautomatiseerde gegevensverzameling plant, moet u ervoor zorgen dat het tankniveau van de vloeibare stikstof voldoende is, dat de autoloader turbopomp is uitgeschakeld en dat de RAID-schijfruimte vrij is. Latitude-S taakbeheer toont het aantal atlas-, rastervierkant-, gat- en gegevensstatussen dat is gepland voor gegevensverzameling (afbeelding 5). In de Gui Latitude-S zijn verschillende kleurenschema's zichtbaar en wordt de betekenis van de verschillende kleurenschema's weergegeven: 1. Geel geeft ongepland aan; 2. Groen geeft gepland aan; 3. Blauw geeft verworven aan; 4. Rood geeft aan dat het niet is gelukt.
7. Cryo-EM gegevensverwerking
OPMERKING: Cryo-EM beeldverwerking van spike-eiwit wordt in detail beschreven in recente literatuur25.
- Voer beeldverwerking uit van spike-eiwit van SARS-CoV2 met RELION 3.011.
- Scherm de filmbeelden die met Latitude-S zijn verzameld handmatig af en voer door de bundel geïnduceerde bewegingscorrectie van de afzonderlijke films uit met de MotionCor2-software9. Voer de eerste screening van de bewegingsgecorrigeerde micrografieën handmatig uit met behulp van cisTEM-softwarepakket14.
OPMERKING: Bijna 85% van de automatisch verkregen microfoto's waren van goede kwaliteit en de gegevens hadden een signaal binnen 3,7-5,2 Å, dat wordt berekend met behulp van cisTEM-software14 (aanvullende figuur S7A, B). - Verwerk de gegevens met behulp van het RELION 3.0 softwarepakket11.
- Kies spikedeeltjes handmatig en onderwerp ze aan 2D-klasseclassificatie (aanvullende figuur S7C). Gebruik de beste 2D-klasse als referentie voor het automatisch selecteren van 3.99.842 deeltjes met één spike uit de micrografieken met behulp van de RELION autopick tool11.
OPMERKING: Er werden drie rondes van 2D-classificatie uitgevoerd voordat de deeltjes aan 3D-classificatie werden onderworpen (aanvullende figuur S8). Ongeveer 2.55.982 afzonderlijke deeltjes werden geselecteerd voor 3D-classificatie en de dataset werd ingedeeld in zes klassen. De uiteindelijke 3D auto-verfijning werd uitgevoerd met de beste klasse; 85.227 spikedeeltjes werden verkregen uit de 3D-classificatie. - Voer na automatische verfijning per deeltje onscherp verfijning uit met de juiste straalkantelingsparameters voor resolutieverbetering. Onderwerp de deeltjes vervolgens aan Bayesiaanse polijsten met behulp van het RELION 3.0-softwarepakket11. Gebruik ten slotte de gepolijste deeltjesset voor nog een ronde van 3D-automatische verfijning met RELION 3.011.
- Kies spikedeeltjes handmatig en onderwerp ze aan 2D-klasseclassificatie (aanvullende figuur S7C). Gebruik de beste 2D-klasse als referentie voor het automatisch selecteren van 3.99.842 deeltjes met één spike uit de micrografieken met behulp van de RELION autopick tool11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de huidige pandemische situatie speelt cryo-EM een sleutelrol bij het karakteriseren van de structuren van verschillende eiwitten uit SARS-CoV-226,27,28,29, die kunnen helpen bij de ontwikkeling van vaccins en medicijnen tegen het virus. Er is dringend behoefte aan snelle onderzoeksinspanningen met beperkte personele middelen om de coronavirusziekte van 2019 te bestrijden. Data-acquisitie in cryo-EM met één deeltje is een tijdrovende maar cruciale stap in de structuurbepaling van macromoleculen. Recente ontwikkelingen in cryo-EM automatische data-acquisitie hebben beperkte menselijke inmenging in het verzamelen van gegevens mogelijk gemaakt. De Latitude-S-software is een belangrijk softwarepakket voor automatische gegevensverzameling dat hier wordt gebruikt voor de geautomatiseerde gegevensverzameling van gezuiverd SARS-CoV2-spike-eiwit.
Cryo-EM data acquisitie van SARS-CoV-2 spike eiwit werd uitgevoerd met een 200 keV cryo-EM uitgerust met een K2 Summit DED. De locaties voor data-acquisitie op het rooster met gewenste ijsdikte en deeltjesverdeling werden handmatig gemarkeerd. De posities werden parallel gemarkeerd tijdens data-acquisitie op de achtergrond. Op de gemarkeerde posities voerde Latitude-S-software geautomatiseerde gegevensverzameling uit met een nominale vergroting van 42.200x bij de pixelgrootte van 1,17 Å op monsterniveau. De configuratie voor gegevensverzameling bij 42.200x vergroting was vooraf ingesteld en al getest. In totaal werden 40 frames geregistreerd voor 8 s met de elektronendosis van 2 e−/Å2 per frame; daarom werd een totale dosis van 80 e−/Å2 gebruikt voor het verzamelen van gegevens (aanvullende figuur S9). De gegevens werden verkregen met een onscherp bereik van −0,75 μm en −2,25 μm, met 3.000 filmbestanden verzameld in twee dagen. Elke 4 uur werden periodieke controles en aanpassingen uitgevoerd door de software om ervoor te zorgen dat alle filmbestanden die gedurende 48 uur werden verzameld van goede kwaliteit waren en er geen bundelverschuiving of uitlijnverschuiving was. De gegevens werden onafhankelijk verzameld zonder menselijke tussenkomst. Bovendien stopt de Latitude-S automatisch met het weergeven van beelden op het moment dat de vloeibare stikstof wordt gevuld, waardoor onnodige trillingen of mechanische afwijkingen in de beelden worden verminderd.
Zoals vermeld in de protocolsectie, werd de eerste screening van bewegingsgecorrigeerde micrografieën handmatig uitgevoerd met behulp van cisTEM-software14. Op basis van de screening bleken de meeste gegevens binnen het signaalbereik van 3,7-5,2 Å (aanvullende figuur S7A) te liggen. Dit suggereert dat de automatische gegevensverzameling met Latitude-S goed is en dat de meeste gegevens geschikt zijn voor 3D-reconstructie met hoge resolutie. Daarnaast werden beelden verzameld met een onscherptebereik (-0,75 tot -2,25 μm) en werden verschillende onscherptebereiken handmatig gecontroleerd door cisTEM14. De verkregen gegevens lagen zeer dicht bij het instelbereik in Latitude-S (aanvullende figuur S7A,B).
De gegevensverwerking werd uitgevoerd met behulp van het RELION 3.0-softwarepakket11. Spike-deeltjes werden handmatig geplukt om de gemiddelden van de 2D-klasse te berekenen. Verschillende structurele details (helix en β-sheet) zijn zichtbaar in de 2D-klassegemiddelden (aanvullende figuur S7C), wat sterk suggereert dat structurele karakterisering met hoge resolutie mogelijk is met behulp van deze dataset. 3D-classificatie geeft echter ook aan dat spike-eiwit 1-receptor-bindend domein (RBD) heeft dat open is en alle RBD naar beneden in de vorm (aanvullende figuur S8). De 3D-classificatie geeft aan dat klasse-1 het maximale aantal deeltjes heeft, die verschijnen als een 1-RBD-up open conformatie. Bovendien hebben klasse-3 en klasse-4 een vergelijkbaar aantal deeltjes, en beide modellen leken alle RBD-down close conformatie te hebben. Klasse-5 toont echter een tussenliggende conformatie, waarbij 1-RBD zich in een tussenpositie bevindt. De 1-RBD-up open conformaties van het spike-eiwit werden echter gereconstrueerd met behulp van C1-symmetrie en de totale resolutie is 4,4 Å (figuur 6 en aanvullende figuur S10). Evenzo werden alle RBD-down close conformatie (klasse-3 en klasse-4) verfijnd samen met C3-symmetrie, en de totale resolutie bij 0,143 FSC is ~ 3,9 Å (figuur 7).
De algemene beeldverwerking geeft aan dat het spike-eiwit alle RBD's van dichtbij en 1-RBD-up open conformatie aanneemt. Bovendien werd een tussenliggende conformatie van het spike-eiwit geïdentificeerd. De hoge resolutie cryo-EM structuur van het S2 subdomein van het spike eiwit geeft de zijketens van individuele aminozuurresiduen aan (Figuur 6B en Figuur 7C). Alle 3D-reconstructies en cryo-EM-resultaten lijken sterk op bevindingen in recent gepubliceerde literatuur25. De hoge resolutie cryo-EM-structuur van het spike-eiwit werd echter binnen 15 dagen gekarakteriseerd, wat alleen mogelijk is vanwege automatische cryo-EM-data-acquisitieprotocollen en automatische deeltjeskiessoftware. Daarom kunnen softwarepakketten voor automatische gegevensverzameling, waaronder Latitude-S, aanzienlijk bijdragen aan de karakterisering van verschillende cryo-EM-structuren met hoge resolutie van biologische macromoleculen.
Afbeelding 1: Workflow van geautomatiseerde gegevensverzameling met Latitude-S: Algemene stappen die moeten worden gevolgd voordat gegevens worden verzameld (rastervoorbereiding, monsterbelasting en microscoopafstemming). Data-acquisitie is het belangrijkste onderdeel van dit manuscript en de pijplijn die moet worden gevolgd tijdens data-acquisitie wordt benadrukt. Afkortingen: cryo-EM = cryo-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Instellen van verschillende toestanden voor gegevensverzameling met één deeltje met behulp van de Latitude-S GUI. (A) Latitude-S-softwarepakket voor gegevensverzameling in DM3-softwarepak. (B) Workflow van de procedure voor het verzamelen van gegevens. (C) Uitbreiding van elk paneel. Afkorting: GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fijne uitlijning om een hoge nauwkeurigheid in te stellen voor scherpstellen en beeldacquisitie. Fijne uitlijning wordt uitgevoerd op vijf toestanden a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Focus elke status door de rode markering op dezelfde positie te plaatsen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om Fine Alignment uit te voeren voordat u een nieuwe sessie start, wat zal helpen bij het uitvoeren van beeldvorming in een bepaalde positie. Beeldacquisitie in een bepaalde positie (zonder grote verschuiving) is volledig afhankelijk van de nauwkeurigheid van de fijne uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Automatische gatselectie met Latitude-S. Automatische vondst van gaten voor gegevensverzameling wordt automatisch uitgevoerd op basis van de grootte van het gat. (A) Toont de positie van de gatzoekvector voor het automatisch vinden van de gaten. Schaalbalk = 20 μm. (B) Toont de markering van gaten met behulp van de gatzoekvector en het aanpassen van de intensiteit om de marker uit het grensgebied en ijsverontreiniging te verwijderen. Schaalbalken = 20 μm (links) en 10 μm (midden). (C) Toont het automatisch toevoegen van de gaten voor beeldvorming (geel). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Live weergave van gegevensverzameling. (A) De posities zijn gemarkeerd in geel, groen, blauw en rood op basis van de status van gegevensverzameling in elke positie. (B) Kleurcode voor het bewaken van de status van gegevensverzameling. Groen: Gepland, Geel: Ongepland, Blauw: Verwerven, Rood: Mislukt. Het linkerpaneel toont verschillende gaten die groen gekleurd zijn (gepland) en een paar gaten gemarkeerd met blauw (verworven); schaalbalk = 10 μm. Het middelste paneel toont 4.300x vergroting van een individueel gat. In deze afbeelding van een gat (middelste paneel) toont het blauwe vierkante vak het scherpstelgebied en het groene vierkante vak het beeldgebied; schaalbalk = 1000 nm. Het rechterdeelvenster toont de verkregen afbeelding. Het uiterst rechtse deelvenster toont de geplande afbeeldingsnummers, de totale tijd die nodig is voor beeldvorming en het aantal afbeeldingen dat is gepland voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Spike 3D-modus met 1RBD geopend. (A) Auto-geraffineerde en geslepen spike-eiwitkaart van 1-RBD omhoog open wordt weergegeven in zij-, boven- en onderweergaven. (B) EM-kaart is uitgerust met kristalstructuur voor een betere visualisatie van de zijketens. De gemarkeerde gebieden in de kaart hebben dichtheden voor zijketens. Afkortingen: 3D = driedimensionaal; RBD = receptor-bindend domein; EM = elektronenmicroscopie; NTD = N- terminal domein; S1 = subeenheid 1; S2 = subeenheid 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Alle RBD naar beneden nauwe conformatie van spike-eiwit. (A) Auto-geraffineerde en geslepen spike-eiwitkaart van alle RBD naar beneden nauwe conformatie weergegeven in zij- en bovenaanzichten. (B) EM-kaart is uitgerust met kristalstructuur voor een betere visualisatie van de zijketens. De pijlen geven aan dat de gebieden in de kaart dichtheden hebben voor zijketens (C). Afkortingen: RBD = receptor-binding domain; EM = elektronenmicroscopie; NTD = N- terminal domein; S1 = subeenheid 1; S2 = subeenheid 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende afbeelding S1: Gui voor het verwerven van Latitude-S-afbeeldingen: Verschillende microscoopcontrollers (bijv. kolomklep openen/sluiten, scherminbrengen/intrekken) worden bestuurd door de Latitude-S GUI. Kolomklep, camera, schermstatus en vloeibare stikstofvulling konden in het linkerdeelvenster worden geregeld. Aan de onderkant van dit paneel worden verschillende kalibratieparameters groen weergegeven (bijv. Vergroting, bundelkanteling, objectieve focus). Als een parameter zwart wordt weergegeven, geeft dit aan dat de parameter niet correct is geoptimaliseerd. Daarom moeten alle parameters worden geoptimaliseerd voordat een nieuwe sessie wordt gestart. Afkorting: GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Weergave van atlastoestand. Verschillende Atlastoestanden tonen rastervierkanten en het type ijs dat is gevormd. (A-F) Ook worden diverse Atlasmaten uitgelicht. (A, B, D, F) Een dik ijspatroon wordt uitgelicht. (C, D) Gebroken vierkanten worden gemarkeerd. Dik ijs en gebroken gebieden (gemarkeerd in de figuur) zijn niet geschikt voor beeldvorming. (E, F) Goede rastervierkanten voor beeldvorming; A, B, C, D en F tonen de rastervierkanten die geschikt zijn voor beeldvorming met hoge resolutie. Dikke ijsrastervierkanten en gebroken rastervierkanten moeten echter worden uitgesloten. Schaalstaven = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) en 25 μm (F). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Weergave van rasterstatus en gatstatus. Rasterstatus en bijbehorende gatstatus worden weergegeven in de afbeelding. (A, E) Leeg gat, (F, G) dik ijs, (E) ijsverontreiniging en (A, B, C, D, E en G) geschikte ijsdikte wordt in de afbeelding gemarkeerd. Geschikte gaten met ijsdikte worden geselecteerd voor de beeldacquisitie (A, B, C, D, E en G). Schaalstaven = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Gatreferentie voor automatische beeldvorming. Gatbeeld (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) wordt vastgelegd en opgeslagen voor toekomstig gebruik. De grootte van de gatreferentie kan worden gevarieerd op basis van de verschillende soorten roosters. Het wordt aanbevolen om altijd de gatreferentie vast te leggen voordat u een nieuwe sessie start. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S5: deelvenster voor het vastleggen van afbeeldingen bij verschillende vergrotingen en gatselectie. (A) Het opnamepaneel toont de instellingen voor gegevensverzameling. (B) In het hoofdnavigatievenster van Latitude-S worden drie opeenvolgende vergrotingen weergegeven. In Atlas-toestand (150x) worden de rastervierkanten geselecteerd voor gegevensverzameling (linkerpaneel, schaalbalk = 50 μm). Bij hogere vergroting (380x) is een enkel vierkant gefocusseerd (middenpaneel, schaalbalk = 20 μm). Verder hogere vergroting (4.300x), gaten in elk vierkant zijn gefocusseerd (rechterpaneel, schaalbalk = 5 μm). Deze vergrotingen zouden echter veranderen afhankelijk van de grootte en vorm van de rasters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S6: Een sjabloon maken voor het selecteren en afbeelden van gaten. Het genereren van sjablonen wordt uitgevoerd door een positie op het gat toe te voegen voor gegevens en de focus wordt naast het gat op het koolstofoppervlak geplaatst. De focus moet op het koolstofgebied worden geplaatst, zodat de straaldiameter geen aangrenzend gat raakt. Schaalbalken = 20 μm (linkerpaneel), 10 μm (middenpaneel), 1000 nm (rechterpaneel). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S7: Cryo-EM-beeldvorming van SARS-CoV2 met behulp van Latitude-S en beeldscreening. (A) Screening van verkregen microfoto's: 1D CTF fit, 2D CTF fit en CTF parameters; schatting van de SARS-CoV2 spike eiwitgegevens met behulp van cisTEM. 1D CTF fit en Thon ring laat zien dat het totale signaal 4,8 Å. (B) Micrografieën bij twee verschillende onscherptewaarden van het spike-eiwit worden verkregen met behulp van Latitude-S. Schaalbalken = 50 nm. (C) Laatste 2D-klassegemiddelde. 2D-klassegemiddelde toont boven-, onder- en zijaanzichten van het spike-eiwit. Alle details met hoge resolutie zijn zichtbaar in 2D-klassegemiddelden. Afkortingen: cryo-EM = cryo-elektronenmicroscopie; 1D = eendimensionaal; 2D = tweedimensionaal; CTF = contrastoverdrachtfunctie; SARS-CoV2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S8: Gegevensverwerking van SARS-CoV2 spike-eiwitgegevens die zijn verkregen met Latitude-S-software. De afbeelding toont de workflow die wordt gevolgd voor het verwerken van de cryo-EM-gegevens van spike-eiwit. 3D-classificatie van spike-eiwit wordt uitgevoerd met Relion 3.0. Klasse-1 toont de 1-RBD up open conformatie. Klasse-3 en Klasse-4 tonen alle RBD naar beneden nauwe conformatie van spike-eiwit. Klasse-5 toont de tussentijdse conformatie van het spike-eiwit. Afkortingen: cryo-EM = cryo-elektronenmicroscopie; 3D = driedimensionaal; RBD = receptor-bindend domein; SARS-CoV2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S9: Dosisgefractioneerd beeld vastgelegd als referentie voor de uiteindelijke beeldacquisitie. Dosisfractioneringsbeelden worden vastgelegd met een belichting van 8,0 s en een belichting van 0,2 s/frame. Klik op de knop Automatisch opslaan in de buurt van de camera om de filmbestanden automatisch op te slaan. Klik na het verkrijgen van de afbeelding op de afbeelding en sla de dosisgefractioneerde beeldparameters op met behulp van de knop Afbeelding bijgewerkt in de status van gegevensverzameling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S10: Hoekverdeling en Fourier shell correlatie van de gegenereerde SARS-CoV-2 1 RBD up open conformatie spike eiwitkaart. (A) Hoekverdeling van het uiteindelijke 3D-model van 1-RBD-up open conformatie van het spike-eiwit. Blauw vertegenwoordigt lagere waarden en rood vertegenwoordigt hogere waarden van de genormaliseerde deeltjesverdeling. (B) Fourier shell correlatiecurve met 4,4 Å resolutie van de 1-RBD up open conformatie van spike eiwit, geschat op de cut-off. Afkortingen: 3D = driedimensionaal; RBD = receptor-bindend domein; SARS-CoV2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; FSC = Fourier shell correlatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Atlas-afbeeldingsstatus | Atlas 115 |
| Vergroting | 115, Pixel grootte 34.7 nm |
| Aangegeven onscherpte | 4,38 mm |
| Spot grootte | 8 |
| Helderheid | 934400 |
| Wijze | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Belichtingstijd | 1,0 s |
| Status van rasterenquête | Rooster 380 |
| Vergroting | 380, Pixel grootte 11.2 nm |
| Aangegeven onscherpte | 2,37 mm |
| Spot grootte | 8 |
| Helderheid | 626200 |
| Wijze | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Belichtingstijd | 1,0 s |
| Hole Survey Staat | Gat 3400 |
| Vergroting | 3.400, Pixel grootte 1.20 nm |
| Aangegeven onscherpte | -0,75 μm |
| Spot grootte | 7 |
| Balk Diameter | 8,81 μm |
| Wijze | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Belichtingstijd | 1,0 s |
| Focusstatus | Focus 45k |
| Vergroting | 45.000, Pixel grootte 0.0924 nm |
| Aangegeven onscherpte | 4,51 μm |
| Spot grootte | 6 |
| Balk Diameter | 0,716 μm |
| Wijze | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Belichtingstijd | 1,0 s |
| Acqisition Staat | Gegevens 45k |
| Vergroting | 45.000, Pixel grootte 0.0924 nm |
| Onscherpe instellen | Min: -4.500 nm, Max: -1.500 nm, Stappen: 250 nm |
| Spot grootte | 6 |
| Balk Diameter | 0,752 μm |
| Wijze | IMAGINGILM, SA, MH |
| Binning | 1 |
| Belichtingstijd | Totaal 8 s belichting voor 20 frames |
| Camera instellen | Geteld, winst genormaliseerd, defect gecorrigeerd |
| Gegevens opslaan instellingen | MRC |
Tabel 1: Overzicht van de statusinstellingen van Latitude-S.
| Specificatie | K2 Basis | K2-top |
| TEM bedrijfsspanning | 200-400 kV | |
| Actief gebied van de sensor | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Sensorgrootte in pixels | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Resolutie |
| Physic al pixel grootte | 5 μm | |
| Binning | 1-8x | |
| Sensoruitlezing | Elk willekeurig gebied | |
| Vergroting ten opzichte van film | 1,3-1,5x | |
| Uitleessnelheid van de sensor | 50 volledige fps | 400 volledige fps |
| Overdrachtssnelheid naar computer | 8 volledige fps | 40 volledige fps |
| Beeldweergave | 8 volledige fps | 10 volledige fps |
| DQE-prestaties (300 kV) | >0.30 (piek) >0.25 op 0.5 van fysieke Nyquist | >0,7 (piek) >0,50 bij 0,5 fysieke Nyquist >0,06 bij 1,25 fysieke Nyquist |
| Software | Gatan Microscopy Suite inclusief DigitalMicrograph |
Tabel 2: Camera specificaties.
| Configuratie optie | Waarde |
| Microscoop Type | Talos Arctica G2 |
| Hoogspanning | 200 KbV |
| Bron | XFEG |
| Lens | Cryo Tweeling |
| Vacuüm systeem | Talos TMP IGP |
| Voorbeeldlader | Autoloader |
Tabel 3: Microscoopconfiguratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Latitude-S is een intuïtieve gebruikersinterface die een omgeving biedt om in twee dagen tijd automatisch duizenden microfoto's of filmbestanden met hoge resolutie in te stellen en te verzamelen. Het biedt eenvoudige navigatie over de rasters en handhaaft de positie van de microscooptrap terwijl deze van lage vergroting naar hoge vergroting gaat. Elke stap van gegevensverzameling met Latitude-S is tijdbesparend, met functies zoals een eenvoudige gebruikersinterface, snelle streaming van gegevens met een snelheid tot 4,5 GB/s en gelijktijdige weergave van gegevens tijdens acquisitie. Bovendien werden vooraf gekalibreerde dosisfractionerings-, dosistempo-, focus- en vergrotingsparameters eenvoudig opnieuw geladen om een nieuwe sessie van automatische gegevensverzameling te starten en tijd te besparen.
Het automatisch verkrijgen van gegevens bij afwezigheid van constante monitoring en zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de dataset is een uitdagende en tijdrovende taak. Geautomatiseerde gegevensverzameling met Behulp van Latitude-S-software is handig wanneer tijd en middelen grote beperkingen zijn, vooral tijdens deze pandemie. In de afgelopen maanden zijn echter verschillende cryo-EM-structuren van verschillende eiwitten van SARS-CoV-2 opgelost, wat farmaceutische bedrijven zal helpen bij het ontwikkelen van vaccins. Verschillende laboratoria gebruiken verschillende soorten softwarepakketten voor automatische gegevensverzameling om gegevens te verzamelen. We gebruikten Latitude-S met een K2 Summit DED voor cryo-EM automatische gegevensverzameling op holey carbon grids of zelfgemaakte GO-gecoate grids30.
Die studie werd uitgevoerd met behulp van de bovengenoemde parameters in de protocolsectie, wat sterk bewijs levert dat Latitude-S een geschikt en ideaal softwarepakket is voor automatische gegevensverzameling voor cryo-EM met één deeltje. Het wordt echter ten zeerste aanbevolen om bepaalde protocollen te volgen voordat u de beeldvorming start met behulp van een K2-camera. De K2-camera met directe detectie vereist basisonderhoudsroutines om de hoogste prestaties te bereiken. Regelmatig gloeien van de camera tot 50° gedurende 24 uur helpt de sensor optimaal te presteren door het achtergrondgeluid en de vervuiling op oppervlakteniveau te verminderen. Na het gloeien van de camera is het bijwerken van de versterking en donkere verwijzingen van de camera echter een verplichte stap (duurt ~ 45 minuten) voordat een beeldacquisitie wordt uitgevoerd.
Hoewel Latitude-S een stabiel en gebruiksvriendelijk softwarepakket is voor cryo-EM automatische gegevensverzameling, is het essentieel om verschillende parameters (vergrotingen, spotgrootte, helderheid en dosissnelheid) in het begin in 5 verschillende toestanden van Latitude-S te optimaliseren. De vergroting van gaten of rastertoestanden is afhankelijk van de gatgroottes van de holey grids of holey grid types (bijv. R2/2 of R1.2/1.3 of R 0.6/1). De grootte van het rastergat van het type R0.6/1 is bijvoorbeeld 0,6 μm en de gatgrootte van het R2/2-raster is 2 μm. Er zijn dus twee verschillende soorten vergroting nodig om de gaten goed te visualiseren voor rastertypen R0.6/1 en R2/2 in de raster- en gattoestanden in Latitude-S.
Daarom zijn de vergrotingsinstellingen voor verschillende soorten rasters in 5 verschillende toestanden variabel. De spotgrootte en de helderheid zijn sterk afhankelijk van de vergroting. Daarom kunnen deze waarden veranderen bij verschillende vergrotingswaarden. Daarom wordt aanbevolen om de verschillende parameters van de 5 verschillende toestanden van Latitude-S te optimaliseren met behulp van verschillende soorten cryo-EM-rasters voordat u begint met automatische gegevensverzameling. Zodra echter alle parameters zijn geoptimaliseerd en opgeslagen, is het eenvoudig om alle parameters opnieuw te laden op basis van de behoefte van de gebruiker en Latitude-S te gebruiken bij verschillende vergrotingen of rastertypen.
Een belangrijk voordeel van het gebruik van K2 met Latitude-S is dat gebruikers eenvoudig de klep voor het openen/sluiten van de bundel kunnen regelen, de camera kunnen plaatsen/intrekken, het fosforscherm van de microscoop kunnen plaatsen/intrekken en de vulling van vloeibare stikstof kunnen regelen met behulp van de GUI van Latitude-S. Andere opties (zoals pistoolkanteling, pistoolverschuiving, balkverschuiving, draaipunten, C2-diafragma centrering, rotatiecentrum, coma-vrije uitlijning) zijn echter niet toegankelijk via het GUI-tabblad K2 Latitude-S (aanvullende figuur S1 en figuur 2). Tijdens de lange uren van gegevensverzameling kan de positie van de bundel verschuiven.
Latitude-S kan geautomatiseerde periodieke controles en correcties uitvoeren om de stabiliteit van het systeem gedurende de periode van gegevensverzameling bij te houden. De stabiliteit van het systeem wordt gehandhaafd door de balk te centreren en de donkere referenties bij te werken. De constante controle zorgt voor de hoge kwaliteit van de verkregen gegevens. In Latitude-S wordt de eucentrische hoogte (Z-hoogte) slechts eenmaal gecorrigeerd voordat gegevens worden verzameld en wordt de eucentrische hoogte automatisch berekend door Latitude-S wanneer het rastervierkant wordt gewijzigd. De scherpstelling wordt automatisch gemeten en aangepast op basis van het door de gebruiker gedefinieerde scherpstelbereik. Het programma zal de fase Z-positie resetten als deze de opgegeven drempelwaarde overschrijdt. Deze stabiliteit wordt geregeld via het palet Systeemstabiliteit. Net als andere pakketten voor automatische gegevensverzameling heeft Latitude-S echter ook enkele beperkingen.
Latitude-S kan de eucentrische hoogte (Z-hoogte) niet berekenen als het raster ongelijk is. In dit scenario kunnen geen gegevens worden verzameld of zijn de onscherpwaarden volledig buiten bereik. Daarom moeten gebruikers uiterst voorzichtig zijn om hun rasters voor te bereiden zonder enige buiging en alleen platte rasters in beeld te brengen met Latitude-S. Bovendien is Latitude-S, in tegenstelling tot Leginon, SerialEM en UCSF-Image, geen vrij beschikbaar softwarepakket. Latitude-S is compatibel met Gatan-camera's, waaronder gefilterde of zelfstandige K2-, K3- en K3-basiscamera's met directe detectie, evenals Rio- en OneView-camera's. Een ander belangrijk nadeel voor gebruikers is dat het niet compatibel is met andere populaire DED's zoals Falcon DED. Dit geldt echter ook voor EPU, een ander softwarepakket voor automatische gegevensverzameling, dat beschikbaar is met cryomicroscopen en alleen compatibel is met de Falcon-camera. EPU is echter ook functioneel met K2/K3 met een energiefilter (BioQuantum K3 Imaging Filter) maar niet met een standalone K2/K3 camera.
Latitude-S lijkt sterk op EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation en Leginon, softwarepakketten die worden gebruikt voor automatische gegevensverzameling voor cryo-EM met één deeltje. Latitude-S is echter alleen compatibel met K2 DED, K3 DED of BioQuantum K3 Imaging Filter. Daarnaast biedt het bedrijf continue technische ondersteuning voor Latitude-S-gebruikers. Deze technische ondersteuning is gunstig voor kleine gebruikersgroepen, die de K2 DED-, K3 DED- of BioQuantum K3 Imaging Filter-apparaten moeten gebruiken voor gegevensverzameling en geen voorkennis hebben over het instellen of gebruiken van vrije softwarepakketten zoals SerialEM en Leginon.
Er zijn veel andere functies, zoals microkristal-elektronendiffractie (microED), tomografie en energiedispersieve röntgenspectrometrie (EDS), die beschikbaar zijn in verschillende andere versies van Latitude. Daarom kunnen gebruikers hetzelfde softwarepakket gebruiken voor gegevensverzameling in andere modi. Voor zover wij weten, is gegevensverzameling voor microED, tomografie en EDS niet beschikbaar in EPU of andere softwarepakketten. Daarom kan dit Latitude-softwarepakket nuttig zijn voor verschillende doeleinden, naast automatische gegevensverzameling in cryoEM met één deeltje. SerialEM en Leginon, beide gratis softwarepakketten, zijn echter geschikt voor Falcon- of K2/K3-camera's en zijn uiterst nuttig voor nieuwe gebruikers. Latitude-S is echter niet vrij beschikbaar, wat een nadeel kan zijn van dit softwarepakket.
Kortom, de Latitude-S tool voor automatische gegevensverzameling is net zo goed als andere softwarepakketten voor automatische gegevensverzameling (bijv. EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S is een uiterst stabiel en gebruiksvriendelijk softwarepakket voor gegevensverzameling, dat verkrijgbaar is met gefilterde of standalone K2-, K3- en K3-basiscamera's met directe detectie, evenals Rio- en OneView-camera's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende of financiële belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
We erkennen het Department of Biotechnology, het Department of Science and Technology (DST) and Science en het Ministry of Human Resource Development (MHRD), India, voor financiering en de cryo-EM-faciliteit in IISc-Bangalore. We erkennen het DBT-BUILDER-programma (BT / INF / 22 / SP22844 / 2017) en DST-FIST (SR / FST / LSII-039 / 2015) voor de nationale Cryo-EM-faciliteit in IISc, Bangalore. We erkennen financiële steun van de Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 en SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). We bedanken mevrouw Ishika Pramanick voor het voorbereiden van cryo-EM-rasters, cryo-EM-gegevensverzameling en het voorbereiden van de tabel met materialen. We bedanken ook de heer Suman Mishra voor cryo-EM beeldverwerking en voor het helpen bij het voorbereiden van de cijfers. We bedanken Prof. Raghavan Varadarajan voor het helpen verkrijgen van het gezuiverde spike-eiwitmonster voor deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
