Summary
Одночастичная криоэлектронная микроскопия требует подходящего программного пакета и удобного для пользователя конвейера для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. Здесь мы представляем применение полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений Latitude-S и практического конвейера для сбора данных остекленных биомолекул в условиях низких доз.
Abstract
За последние несколько лет технологические и методологические достижения в области криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) проложили новый путь для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением. Несмотря на значительные достижения в области крио-ЭМ, все еще есть возможности для улучшения различных аспектов рабочего процесса анализа одной частицы. Для анализа одной частиц требуется подходящий программный пакет для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. За последние восемь лет было разработано несколько пакетов программного обеспечения для автоматического сбора данных для автоматической визуализации крио-ЭМ с одной частицей. В данной статье представлено применение полностью автоматизированного конвейера сбора изображений для остеклованных биомолекул в условиях низких доз.
Он демонстрирует программный пакет, который может собирать крио-EM данные полностью, автоматически и точно. Кроме того, различные микроскопические параметры легко контролируются этим программным пакетом. Этот протокол демонстрирует потенциал этого программного пакета в автоматизированной визуализации спайкового белка тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) с помощью криоэлектронного микроскопа 200 кэВ, оснащенного прямым электронным детектором (DED). За один сеанс (48 ч) сбора данных было получено около 3000 крио-ЭМ-изображений фильмов, что дало структуру с атомным разрешением спайкового белка SARS-CoV-2. Кроме того, это структурное исследование показывает, что спайковый белок принимает две основные конформации: 1-RBD (рецептор-связывающий домен) вверх открытым и все RBD вниз закрытые конформации.
Introduction
Крио-ЭМ с одной частицей стал основным методом структурной биологии для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением1. Реконструкция одной частицы зависит от получения огромного количества микроснимков остеклованных образцов для извлечения двумерных (2D) изображений частиц, которые затем используются для реконструкции трехмерной (3D) структуры биологической макромолекулы2,3. До разработки DED разрешение, достигнутое при реконструкции одной частицы, варьировалось от 4 до 30 Å4,5. В последнее время достижимое разрешение от крио-ЭМ с одной частицей превысило 1,8 Å6. DED и автоматизированное программное обеспечение для сбора данных внесли основной вклад в эту революцию резолюции7, где вмешательство человека в сбор данных минимально. Как правило, крио-ЭМ-визуализация выполняется при низких мощностях дозы электронов (20-100 e/Å2) для минимизации электронно-лучевого радиационного повреждения биологических образцов, что способствует низкому соотношению сигнал/шум (SNR) на изображении. Этот низкий SNR препятствует характеристике структур с высоким разрешением биологических макромолекул с использованием анализа одиночных частиц.
Электронное детекторы нового поколения представляют собой кмОП-детекторы на основе КМОП (комплементарные металл-оксид-полупроводники), которые могут преодолевать эти препятствия, связанные с низким SNR. Эти КМОП-камеры с прямым обнаружением обеспечивают быстрое считывание сигнала, благодаря чему камера обеспечивает лучшую функцию точечного распространения, подходящую SNR и отличную детективную квантовую эффективность (DQE) для биологических макромолекул. Камеры прямого обнаружения обеспечивают высокий SNR8 и низкий уровень шума в записанных изображениях, что приводит к количественному увеличению квантовой эффективности детектива (DQE) - меры того, сколько шума детектор добавляет к изображению. Эти камеры также записывают фильмы со скоростью сотни кадров в секунду, что позволяет быстро собирать данные9,10. Все эти характеристики делают камеры быстрого прямого обнаружения пригодными для применения в низких дозах.
Стековые изображения с коррекцией движения используются для обработки данных для расчета 2D-классификации и реконструкции 3D-карты плотности макромолекул с помощью различных программных пакетов, таких как RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 и EMAN215. Однако для анализа одной частицы требуется огромный набор данных для достижения структуры с высоким разрешением. Поэтому плата за автоматический сбор данных имеет большое значение для сбора данных. Для записи больших наборов крио-ЭМ данных за последнее десятилетие было использовано несколько программных пакетов. Для автоматизированного сбора данных были разработаны специальные программные пакеты, такие как AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS и EPU.
Эти программные пакеты используют рутинные задачи для автоматического поиска положений отверстий путем корреляции изображений с низким увеличением с изображениями с высоким увеличением, что помогает идентифицировать отверстия со стекловидным льдом соответствующей толщины льда для получения изображений в условиях низкой дозы. Эти программные пакеты сократили количество повторяющихся задач и увеличили пропускную способность сбора крио-ЭМ данных за счет получения огромного количества высококачественных данных в течение нескольких дней непрерывно, без каких-либо перерывов и физического присутствия оператора. Latitude-S - это аналогичный программный пакет, который используется для автоматического сбора данных для анализа одиночных частиц. Однако этот программный пакет подходит только для DED K2/K3 и поставляется с этими детекторами.
Этот протокол демонстрирует потенциал Latitude-S в автоматизированном получении изображений спайкового белка SARS-CoV-2 с помощью прямого электронного детектора, оснащенного крио-ЭМ 200 кэВ (см. Таблицу материалов). С помощью этого инструмента сбора данных автоматически получают 3000 файлов фильмов спайкового белка SARS-CoV-2, и проводится дальнейшая обработка данных для получения структуры спайкового белка с разрешением 3,9-4,4 Å.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора крио-ЭМ данных необходимы три важных этапа: 1. подготовка крио-ЭМ сетки, 2. калибровка и выравнивание микроскопа, 3. автоматический сбор данных (рисунок 1). Кроме того, автоматизированный сбор данных подразделяется на a. выбор подходящей области, b. оптимизация Latitude-S, c. запуск автоматического выбора отверстий и d. запуск автоматического сбора данных (рисунок 1).
1. Подготовка крио-ЭМ сетки и загрузка образцов для автоматического сбора данных
- Очистите решетки с помощью тлеющего разряда и измените параметры тлеющего разряда на основе экспериментальных требований (здесь 60 с при 20 мА).
- Добавьте свежеприготовленный образец белка (3 мкл) в светящуюся сетку и инкубируйте в течение 10 с.
- Промокните сетки на 3-5 с при 100% влажности и быстро погрузите их в жидкий этан с помощью криомпенжера.
- Зажмите сетки вручную в кольцо зажима, чтобы сформировать картридж с помощью гибкого кольца C-clip.
- Загрузите замороженные решетки, установленные на картридже, в кассету автозарядчика и передайте кассету с помощью наноколпачка в предварительно охлажденный автозарядчик микроскопа для сбора данных.
2. Настройка микроскопа и базовое выравнивание перед автоматическим сбором данных
- Смещение луча
- Нажмите « Смещение луча » на вкладке «Прямое выравнивание ».
- Уменьшите увеличение и направьте луч на оптическую ось с помощью многофункциональной ручки X и Y .
- Выравнивание точек разворота
- Нажмите на опцию Наклон луча в прямом выравнивании pp X на вкладке Прямое выравнивание .
- Конденсируйте луч в точку и сведите к минимуму движение с помощью многофункциональной ручки X и Y .
- Центрирование диафрагмы C2
- Выберите диафрагму конденсатора на вкладке Выравнивание .
- Конденсируйте луч до точки, центрируйте луч на оптической оси, а затем расширьте луч, чтобы равномерно покрыть круг.
- Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет отрегулирована диафрагма конденсатора 2.
- Выравнивание без комы
- Щелкните Выравнивание X без комы на вкладке Прямое выравнивание , чтобы выровнять луч по оптической оси.
- Используйте многофункциональную ручку, чтобы свести к минимуму форму и движение БПФ (убедитесь, что он стабилен).
- Повторите ту же процедуру для Coma - свободное выравнивание Y.
- Установите параллельное освещение перед сбором данных в крио-ЭМ из-за двойного объектива C.
- Вставьте объективную диафрагму (70 мкм) в дифракционном режиме.
- Сфокусируйте диафрагму объектива на передней фокальной плоскости дифракционного объектива, управляя регулятором интенсивности расфокусировки (объектив и ток объектива C2).
- Убедитесь, что четкий край объектива виден после правильной расфокусировки.
- Вставьте пробку балки и распределите интенсивность до тех пор, пока дифракционные кольца золотого порошка не будут сведены к минимуму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если луч распределен правильно, на экране видно прозрачное дифракционное кольцо золотого порошка, что указывает на то, что луч параллельен. - Уберите пробку луча после установки параллельного освещения и измените режим микроскопа на нанозонд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте настройку микроскопа перед началом сбора данных, чтобы обеспечить оптимальную производительность микроскопа. Все эти настройки будут выполняться в микроскопе Direct Alignment GUI Tab. Вся настройка микроскопа выполняется с использованием тестовой сетки перед сбором данных.
3. Сбор данных с помощью Latitude-S
- Запустите программное обеспечение для автоматического сбора данных Latitude-S.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка Latitude-S также требует калибровки микроскопа, которая будет выполнена перед сбором данных, и настройки будут сохранены постоянно. Пять различных состояний для сбора данных калибруются с четырьмя различными увеличениями (рисунок 1 и рисунок 2). Состояние атласа и состояние сетки находятся в двух разных увеличениях в режиме LM (диапазоны низкого увеличения). Состояние дыры находится в режиме SA (диапазоны высокого увеличения), но с умеренным увеличением. Фокусировка и состояние данных используют режим SA с высоким увеличением.- Щелкните DigitalMicrograph в меню Пуск или дважды щелкните значок DigitalMicrograph на рабочем столе.
- Выберите значок Менеджера техники в DigitalMicrograph.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе будут отображаться значки TEM и Latitude-S (рисунок 2 и дополнительный рисунок S1). - Щелкните значок Latitude-S для автоматического сбора данных по одной частице.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера K2 работает в трех режимах: линейный/интегрированный, счетный и сверхвысокий. Пользователь мог выбрать любой режим в интерфейсе DigitalMicrograph. Изображения данных могут быть сохранены либо как стеки изображений с дозой фракционирования, либо как суммированные изображения в файлах MRC, TIF или .dm4 с различной битовой глубиной. Кроме того, данные могут быть сохранены в виде изображений с коррекцией движения для камеры K3. На камере K2 необработанный стек изображений может быть сохранен в виде 4-разрядных файлов MRC, 8-разрядных TIF или 8-разрядных файлов .dm4.
- Создайте новый сеанс на основе настроек предыдущего сеанса.
- Установите флажок На основе предыдущего сеанса в палитре.
- Нажмите кнопку Создать .
- Выберите папку, содержащую сеанс, на котором основаны настройки нового сеанса. Перейдите в каталог предыдущего сеанса, чтобы создать новый сеанс. Выберите папку для сохранения нового сеанса и связанных с ним данных.
- Выберите папку, в которую будет сохранен новый сеанс и связанные с ним данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое состояние и его базовые настройки (увеличение, условия освещения, изображение или проектор), а также смещение луча и параметры камеры (общая экспозиция, однокадровая экспозиция и биннинг) будут экспортированы из существующего сеанса в новый сеанс. Путь к папке отображается в виде текстовой строки в нижней части палитры. Каждая из палитр состояний и конфигурации имеет звездочку (*), добавленную к заголовку, чтобы показать, что она уже настроена и готова к использованию.
- Продолжите существующий сеанс.
- Нажмите кнопку Продолжить в палитре, чтобы продолжить существующий сеанс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монтаж атласа не может быть изменен. - Выберите и перейдите к папке, содержащей сеанс, который необходимо продолжить.
- Нажмите кнопку Продолжить в палитре, чтобы продолжить существующий сеанс.
- Начните совершенно новый сеанс.
- Нажмите на вкладку «Создать » в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс для продолжения. Выберите папку для сохранения данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имя папки по умолчанию строится с использованием даты и времени. - Нажмите на значок Настройка . В появившемся окне Управление состоянием добавьте состояние, задайте условие TEM, условие камеры и изображение/стек, а затем присвойте этому состоянию имя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный рабочий процесс сбора данных использует 5 различных состояний для автоматического сбора данных. Эти состояния настраиваются и хранятся в соответствующих палитрах состояний. Сводка по состоянию приведена в таблице 1.
- Нажмите на вкладку «Создать » в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс для продолжения. Выберите папку для сохранения данных.
- Настройте состояние атласа.
- Нажмите на палитру состояния Атласа.
- Настройте состояние атласа со следующими параметрами: режим увеличения 115x LM в нанозонде, условия освещения - размер пятна 8 и яркость 934400, биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с для изображения при низком увеличении. Обратитесь к сводке по штатам, приведенной в таблице 1.
- Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние атласа является самым низким состоянием увеличения, которое обеспечивает обзор всей сетки (дополнительный рисунок S2). Как правило, это состояние помогает нам визуализировать все сетки при небольшом увеличении и судить о толщине льда, плоскостности и разбитом квадрате сеток. Рекомендуется формировать атлас на разных участках сетки для наблюдения за оптимальной толщиной льда и субоптимальной толщиной льда решеток (дополнительный рисунок S3). Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
- Настройте состояние сетки.
- Щелкните палитру состояния сетки.
- Настройте состояние Grid с помощью следующей оптики визуализации микроскопа (режим увеличения 380x LM в нанозонде), условий освещения (размер пятна: 8 и яркость 626 200), биннинга: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
- См. сводку состояния Latitude-S, приведенную в таблице 1.
- Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние сетки устанавливается с увеличением выше, чем состояние атласа, так что поле зрения представляет собой один квадрат сетки (рисунок 2). В этом конкретном увеличении наблюдается один квадрат сетки. Поэтому в этом увеличении правильно наблюдаются отверстия, что помогает проверить толщину отверстий на льду (дополнительный рисунок S4). Простой полосовой фильтр используется в состоянии сетки для поиска отверстий в патентной сетке. Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
- Настройте состояние отверстий.
- Нажмите на палитру отверстий.
- Настройте состояние отверстия со следующими параметрами микроскопа: оптика визуализации (режим увеличения 4500x SM в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 7 и диаметр луча 8,81 мкм), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
- При необходимости измените параметры в зависимости от типа сетки. См. сводку состояния, приведенную в таблице 1.
- Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режим SA указывает на диапазон высокого увеличения в электронном микроскопе. Состояние дыры находится в диапазоне увеличения SA с полем зрения в несколько микрометров (10-20 мкм) (рисунок 2 и дополнительный рисунок S4). Этот диапазон увеличения выше, чем в состоянии Atlas или Grid, но намного меньше, чем в состоянии Focus/Data. В этом увеличении будут видны отдельные отверстия. Размер отверстия подходит для наблюдения за высокой степенью загрязнения, пустыми отверстиями и правильной толщиной льда отверстий. Отверстия для визуализации выбираются на основе этих предположений. В состоянии отверстия используются два фильтра: один для перекрестной корреляции эталонного изображения отверстия с новым изображением отверстия, а другой для регулировки высоты ступени до эйцентрической высоты.
- Настройте состояние фокусировки.
- Нажмите на палитру фокусировки.
- Настройте состояние фокусировки со следующими параметрами микроскопа: оптика визуализации (увеличение 45 000x РЕЖИМ SA в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 8 и яркость 934400), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
- Сосредоточьтесь на аморфной углеродной области вблизи отверстия. Обратитесь к сводке состояния Latitude-S, приведенной в таблице 1.
- Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режим SA указывает на диапазон высокого увеличения в электронном микроскопе. Состояние фокусировки — это увеличение более высокого диапазона SA. В режиме фокусировки луч смещается в ближайшую углеродную область целевого отверстия и автоматически выполняет фокусировку для сбора данных в состоянии данных. Полосовой фильтр в сочетании с лазерным или мягким прямоугольным фильтром используется в состоянии фокусировки для измерения смещения между двумя изображениями состояния фокусировки одной и той же области (рисунок 2). Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
- Настройте состояние данных.
- Нажмите на палитру данных.
- Настройте состояние данных с помощью следующих параметров микроскопа: оптика визуализации (например, увеличение 28 000x, 45 000x, 54 000x в режиме SA в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 8 и яркость 934400), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
- Обратитесь к сводке состояния Latitude-S, приведенной в таблице 1.
- Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние данных - это наибольшее увеличение, выбранное на основе требований к размеру пикселя и целевому разрешению (рисунок 2). Как правило, после фокусировки луч автоматически смещается в целевую область для сбора данных. Вышеуказанные параметры могут быть изменены в зависимости от требований пользователя.
4. Настройка фокусировки
- Нажмите на палитру конфигурации фокусировки. Укажите диапазон значений расфокусировки и размер шага на данной вкладке.
- Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкие значения расфокусировки могут использоваться для сбора данных с высоким разрешением. Как правило, для получения изображения используются значения расфокусировки от -0,5 до -3,0 мкм с размерами шага расфокусировки 0,25 или 0,5 мкм. Пользователи могут пропустить этап настройки фокуса, если они хотят только отобразить образец. Просто нажмите кнопку Далее на палитре, чтобы пропустить шаг настройки фокуса.
5. Точное выравнивание
- Сосредоточьтесь на некоторых особенностях сетки (например, загрязнение льдом шестиугольным льдом); см. рисунок 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функции не должны быть слишком большими или слишком маленькими. Они должны быть видны как при увеличении состояния Atlas 115x (режим LA), так и при увеличении данных. - Нажмите на кнопку Захват . Расположите знак красного креста на одном и том же объекте на каждом изображении разных состояний.
- Начните с фокусировки, данных и состояний дыр, потому что их поле зрения намного больше, чем в атласе и сетке. Увеличьте масштаб состояния атласа и сетки, чтобы расположить знак красного креста на одном и том же объекте в атласе и состояниях сетки.
- Нажмите кнопку «Рассчитать », чтобы рассчитать позиции пяти различных состояний, которые будут вычислять смещения между каждым из состояний и отражать их в окне вывода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения смещения интегрированы в состояния для дальнейшего использования (рисунок 3). Тонкое выравнивание выполняется для обеспечения высокой точности положения каждого состояния (рисунок 3). Это точное выравнивание помогает точно определить точное положение во всех пяти состояниях. Точное выравнивание имеет решающее значение для сбора данных по одной частице. Поэтому настоятельно рекомендуется выполнить точное выравнивание перед визуализацией.
6. Процедура сбора данных с помощью Latitude-S
- Нажмите на палитру Захвата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, атласные данные собираются с небольшим увеличением (115x) для визуализации большинства квадратов сетки. - Выберите размер атласа, чтобы охватить всю сетку или часть сетки в зависимости от требования (например, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 или 8 x 12).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер атласа 16 на 16 охватывает всю сетку. - Нажмите на кнопку Захват , чтобы захватить атлас.
ПРИМЕЧАНИЕ: Главное окно навигации Latitude-S открывается и заполняет доступное пространство в DigitalMicrograph (дополнительный рисунок S5). Три панели изображений в главном окне навигации показывают изображения состояний системы при трех различных увеличениях. Общий атлас в настоящее время отображается в текущем состоянии приобретения на крайней левой панели. Плитки в атласе будут заполняться по мере каждого захвата. - Выберите квадрат сетки в зависимости от толщины льда, перейдя по атласу (дополнительный рисунок S5). После того, как нужные квадраты сетки выбраны, нажмите кнопку «Расписание» и наблюдайте, как плитки в квадрате сетки заполняются по мере захвата каждого квадрата сетки.
- Нажмите кнопку «Расписание», как только будут выбраны квадраты сетки.
- Выберите репрезентативное отверстие в квадрате сетки, добавив его положение. После получения изображения отверстия определите данные и позиции фокусировки и сохраните макет в виде шаблона (дополнительный рисунок S6).
- Нажмите « Автоматический поиск», укажите размер отверстия (например, R1.2/1.3) и нажмите кнопку «Найти» в программе, что приведет к тому, что программа «Найти» автоматически найдет отверстия на основе диаметра отверстия. Затем нажмите на кнопку Mark , чтобы добавить шаблон (рисунок 4) и добавить знаки красного круга во всех отверстиях в одной сетке или частичном квадрате сетки.
- Установите интенсивность для удаления отверстий из квадрата сетки и загрязнения льдом (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, выбранные отверстия будут отмечены желтым цветом для планирования сбора данных. - Нажмите кнопку «Расписание» в задачах Latitude после добавления отверстий через автоматический поиск.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем планировать автоматический сбор данных, убедитесь, что уровень жидкого азота в баке достаточен, турбонасос автозагрузчика выключен, а дисковое пространство RAID свободно. Диспетчер задач Latitude-S показывает количество состояний атласа, квадрата сетки, отверстий и данных, запланированных для сбора данных (рисунок 5). В графическом интерфейсе Latitude-S будут видны различные цветовые схемы, а также будет отображаться значение различных цветовых схем: 1. Желтый цвет указывает на незапланированное; 2. Зеленым цветом обозначено расписание; 3. Синим цветом обозначено Приобретенное; 4. Красным цветом обозначен сбой.
7. Обработка данных Cryo-EM
ПРИМЕЧАНИЕ: Крио-ЭМ обработка изображений спайкового белка подробно описана в новейшей литературе25.
- Выполнить обработку изображений спайкового белка SARS-CoV2 с помощью RELION 3.011.
- Вручную просматривайте изображения фильмов, собранные с помощью Latitude-S, и выполняйте коррекцию движения отдельных фильмов, вызванную лучом, с помощью программного обеспечения MotionCor29. Выполните первичный скрининг микрофотографий с коррекцией движения вручную с помощью программного пакета cisTEM14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Почти 85% автоматически полученных микроснимков были хорошего качества, а данные имели сигнал в пределах 3,7-5,2 Å, который рассчитывается с помощью программного обеспечения cisTEM14 (дополнительный рисунок S7A, B). - Обработка данных с помощью программного пакета RELION 3.011.
- Подбирайте частицы шипов вручную и подвергайте их классификации 2D-классов (дополнительный рисунок S7C). Используйте лучший 2D-класс в качестве ссылки на автоотбор 3 99 842 односкоростных частиц с микроснимков с помощью инструмента автоподбора RELION11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три раунда 2D-классификации были проведены перед тем, как подвергнуть частицы 3D-классификации (дополнительный рисунок S8). Приблизительно 2 55 982 одиночные частицы были отобраны для 3D-классификации, и набор данных был классифицирован на шесть классов. Финальная 3D автофинировка была выполнена с лучшим классом; 85 227 частиц шипов были получены из 3D-классификации. - После автоматической очистки выполните очистку расфокусировки на частицу с правильными параметрами наклона луча для улучшения разрешения. Затем подвергаем частицы байесовской полировке с помощью программного пакета RELION 3.011. Наконец, используйте набор отполированных частиц для еще одного раунда 3D-автоочистки с помощью RELION 3.011.
- Подбирайте частицы шипов вручную и подвергайте их классификации 2D-классов (дополнительный рисунок S7C). Используйте лучший 2D-класс в качестве ссылки на автоотбор 3 99 842 односкоростных частиц с микроснимков с помощью инструмента автоподбора RELION11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нынешней пандемической ситуации крио-ЭМ играет ключевую роль в характеристике структур различных белков из SARS-CoV-226,27,28,29, которые могут помочь в разработке вакцин и лекарств против вируса. Существует острая необходимость в быстрых исследовательских усилиях с ограниченными человеческими ресурсами для борьбы с коронавирусной болезнью 2019 года. Сбор данных в крио-ЭМ с одной частицей является трудоемким, но важным шагом в определении структуры макромолекул. Последние разработки в области автоматического сбора крио-ЭМ позволили ограничить вмешательство человека в сбор данных. Программное обеспечение Latitude-S является важным программным пакетом для автоматического сбора данных, используемым здесь для автоматизированного сбора данных очищенного спайкового белка SARS-CoV2.
Сбор крио-ЭМ данных спайкового белка SARS-CoV-2 был выполнен с помощью крио-ЭМ 200 кэВ, оснащенного K2 Summit DED. Места сбора данных на сетке с желательной толщиной льда и распределением частиц были обозначены вручную. Позиции были отмечены параллельно во время сбора данных, происходящих в фоновом режиме. На отмеченных позициях программное обеспечение Latitude-S осуществляло автоматизированный сбор данных с номинальным увеличением 42 200x при размере пикселя 1,17 Å на уровне образца. Конфигурация для сбора данных при 42 200-кратном увеличении уже была предварительно установлена и опробована. Всего было записано 40 кадров в течение 8 с с электронной дозой 2 e−/Å2 на кадр; таким образом, для сбора данных использовалась общая доза 80 e−/Å2 (дополнительный рисунок S9). Данные были получены в диапазоне расфокусировки −0,75 мкм и −2,25 мкм, при этом за два дня было собрано 3000 кинофайлов. Каждые 4 часа программное обеспечение выполняло периодические проверки и корректировки, чтобы гарантировать, что все файлы фильма, собранные в течение 48 часов, были хорошего качества и не было смещения луча или смещения выравнивания. Данные были собраны независимо без какого-либо вмешательства человека. Кроме того, Latitude-S автоматически прекращает визуализацию во время заполнения жидким азотом, что уменьшает ненужную вибрацию или механический дрейф на изображениях.
Как упоминалось в разделе протокола, первоначальный скрининг микроснимков с коррекцией движения выполнялся вручную с использованием программного обеспечения cisTEM14. На основе скрининга было обнаружено, что большинство данных находится в диапазоне сигналов 3,7-5,2 Å (дополнительный рисунок S7A). Это говорит о том, что автоматический сбор данных с помощью Latitude-S хорош, и большая часть данных подходит для 3D-реконструкции с высоким разрешением. Кроме того, изображения были собраны в диапазоне расфокусировки (от -0,75 до -2,25 мкм), а различные диапазоны расфокусировки были вручную проверены cisTEM14. Полученные данные были очень близки к диапазону расфокусировки установки в Latitude-S (дополнительный рисунок S7A,B).
Обработка данных осуществлялась с использованием программного пакета RELION 3.011. Частицы спайков были выбраны вручную для расчета средних значений 2D-класса. Различные структурные детали (спираль и β лист) видны в средних значениях 2D-класса (дополнительный рисунок S7C), что убедительно свидетельствует о том, что структурная характеристика высокого разрешения возможна с использованием этого набора данных. Тем не менее, 3D-классификация также указывает на то, что спайковый белок имеет 1-рецептор-связывающий домен (RBD) вверх открытым и весь RBD вниз близко конформирован (дополнительный рисунок S8). 3D-классификация показывает, что класс-1 имеет максимальное количество частиц, которые выглядят как открытая конформация 1-RBD. Кроме того, класс-3 и класс-4 имеют одинаковое количество частиц, и обе модели, по-видимому, имеют все RBD близкой конформации. Однако класс-5 показывает промежуточную конформацию, где 1-RBD находится в промежуточном положении. Однако открытые конформации спайкового белка 1-RBD были реконструированы с использованием симметрии C1, а общее разрешение составляет 4,4 Å (рисунок 6 и дополнительный рисунок S10). Аналогичным образом, все близкие конформации RBD (класс-3 и класс-4) были уточнены вместе с симметрией C3, а общее разрешение при 0,143 FSC составляет ~ 3,9 Å (рисунок 7).
Общая обработка изображения показывает, что спайковый белок принимает все RBD вниз близко и 1-RBD вверх открытую конформацию. Кроме того, была идентифицирована промежуточная конформация спайкового белка. Крио-ЭМ-структура высокого разрешения поддомена S2 спайкового белка указывает на боковые цепи отдельных аминокислотных остатков (рисунок 6B и рисунок 7C). Все 3D-реконструкции и результаты крио-ЭМ очень похожи на результаты в недавно опубликованной литературе25. Тем не менее, крио-ЭМ-структура шипового белка с высоким разрешением была охарактеризована в течение 15 дней, что возможно только благодаря автоматическим протоколам сбора крио-ЭМ данных и автоматическому программному обеспечению для сбора частиц. Таким образом, пакеты программного обеспечения для автоматического сбора данных, включая Latitude-S, могут в значительной степени способствовать характеристике нескольких крио-ЭМ-структур высокого разрешения биологических макромолекул.
Рисунок 1: Рабочий процесс автоматизированного сбора данных с помощью Latitude-S: Общие шаги, которые необходимо выполнить перед сбором данных (подготовка сетки, загрузка образца и настройка микроскопа). Сбор данных является основной частью этой рукописи, и выделен конвейер, которому необходимо следовать во время сбора данных. Сокращения: крио-ЭМ = криоэлектронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка различных состояний для сбора данных по одной частице с помощью графического интерфейса Latitude-S. (A) Программный пакет Latitude-S для сбора данных в программном костюме DM3. (B) Рабочий процесс процедуры сбора данных. (C) Расширение каждой группы. Аббревиатура: GUI = графический интерфейс пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Точное выравнивание для настройки высокой точности фокусировки и получения изображения. Точное выравнивание выполняется по пяти состояниям a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Сфокусируйте каждое состояние, поставив красную метку на одном и том же положении. Настоятельно рекомендуется выполнить точное выравнивание перед началом любого нового сеанса, что поможет выполнить визуализацию в определенном положении. Получение изображения в определенном положении (без какого-либо значительного сдвига) полностью зависит от точности точного выравнивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Автоматический выбор отверстий с помощью Latitude-S. Автоматический поиск отверстий для сбора данных осуществляется автоматически в зависимости от размера отверстий. (A) Показывает положение вектора обнаружения отверстий для автоматического нахождения отверстий. Шкала bar = 20 мкм. (B) Показывает маркировку отверстий с помощью вектора поиска отверстий и регулировки интенсивности для удаления маркера из пограничной зоны и загрязнения льдом. Шкала стержней = 20 мкм (слева) и 10 мкм (посередине). (C) Показывает автоматическое добавление отверстий для визуализации (желтый). Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Интерактивное представление сбора данных. (A) Позиции помечаются желтым, зеленым, синим и красным цветом в зависимости от состояния сбора данных в каждой позиции. B) цветовой код для мониторинга состояния сбора данных. Зеленый: Запланированный, Желтый: Незапланированный, Синий: Приобретение, Красный: Неудача. На левой панели показано несколько отверстий, окрашенных в зеленый цвет (запланировано) и несколько отверстий, отмеченных синим цветом (приобретенных); шкала = 10 мкм. Средняя панель показывает 4 300-кратное увеличение отдельного отверстия. На этом изображении отверстия (средняя панель) синее квадратное поле показывает область фокусировки, а зеленое квадратное поле показывает область изображения; шкала = 1000 нм. На правой панели отображается полученное изображение. Крайняя правая панель показывает запланированные номера изображений, общее время, необходимое для визуализации, и сколько изображений запланировано для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Режим Spike 3D с открытым 1RBD. (A) Автоматически очищенная и заточенная карта белка шипа 1-RBD вверх открыта в боковых, верхних и нижних видах. (B) ЭМ-карта оснащена кристаллической структурой для лучшей визуализации боковых цепей. Выделенные области на карте имеют плотность для боковых цепей. Сокращения: 3D = трехмерный; RBD = рецептор-связывающий домен; ЭМ = электронная микроскопия; NTD = N-домен терминала; S1 = субъединица 1; S2 = подраздел 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Все RBD вниз близки конформация спайкового белка. (A) Автоочищенная и заточенная карта спайк-белка всех RBD вниз близкой конформации, представленной в боковых и верхних видах. (B) ЭМ-карта оснащена кристаллической структурой для лучшей визуализации боковых цепей. Стрелки показывают, что области на карте имеют плотности для боковых цепей (C). Сокращения: RBD = рецептор-связывающий домен; ЭМ = электронная микроскопия; NTD = N-домен терминала; S1 = субъединица 1; S2 = подраздел 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Графический интерфейс получения изображений Latitude-S: Различные контроллеры микроскопа (например, открытие/закрытие клапана колонны, вставка/втягивание экрана) управляются графическим интерфейсом Latitude-S. Клапан колонны, камера, состояние экрана и заполнение жидким азотом могут контролироваться на левой панели. В нижней части этой панели различные параметры калибровки отображаются зеленым цветом (например, увеличение, наклон луча, фокусировка цели). Если какой-либо параметр отображается черным, это означает, что параметр оптимизирован неправильно. Поэтому все параметры должны быть оптимизированы перед началом любого нового сеанса. Аббревиатура: GUI = графический интерфейс пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Представление состояния атласа. Различные состояния Атласа, показывающие квадраты сетки и тип образующегося льда. (А-Ф) Также выделены различные размеры атласа. (A, B, D, F) Выделяется толстый ледяной узор. (С, Г) Разбитые квадраты подсвечиваются. Толстый лед и разбитые участки (отмеченные на рисунке) не подходят для визуализации. (Е, Ф) Хорошие квадраты сетки для визуализации; A, B, C, D и F показывают квадраты сетки, подходящие для изображения с высоким разрешением. Тем не менее, толстые квадраты ледяной сетки и разбитые квадраты сетки должны быть исключены. Шкала стержней = 100 мкм (A-C), 50 мкм (D, E) и 25 мкм (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Представление состояния сетки и состояния отверстия. Состояние сетки и соответствующее состояние отверстия показаны на рисунке. (А, Е) На изображении отмечено пустое отверстие, (F, G) толстый лед, (E) загрязнение льдом и (A, B, C, D, E и G) подходящая толщина льда. Для получения изображения выбираются отверстия подходящей толщины льда (A, B, C, D, E и G). Шкала стержней = 10 мкм (A, E, F, G), 2 мкм (B), 50 мкм (C), 5 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Ссылка на отверстие для автоматической визуализации. Изображение отверстия (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) захватывается и сохраняется для дальнейшего использования. Размер эталона отверстий может варьироваться в зависимости от различных типов сеток. Рекомендуется всегда захватывать ссылку на отверстие перед началом любого нового сеанса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S5: Панель захвата изображений при различных увеличениях и выделении отверстий. (A) На панели захвата отображаются настройки для сбора данных. (B) В главном навигационном окне Latitude-S показано три последовательных увеличения. В состоянии Atlas (150x) для сбора данных выбираются квадраты сетки (левая панель, шкала = 50 мкм). При более высоком увеличении (380x) фокусируется один квадрат (средняя панель, шкала = 20 мкм). При более высоком увеличении (4 300x) фокусируются отверстия внутри каждого квадрата (правая панель, шкала = 5 мкм). Однако эти увеличения будут меняться в зависимости от размера и формы сеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S6: Создание шаблона для выбора отверстий и визуализации. Генерация шаблона выполняется путем добавления положения на отверстие для данных, а фокус располагается рядом с отверстием на углеродной поверхности. Фокус должен располагаться на углеродной области таким образом, чтобы диаметр луча не касался какого-либо соседнего отверстия. Шкала стержней = 20 мкм (левая панель), 10 мкм (средняя панель), 1000 нм (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S7: Крио-ЭМ-визуализация SARS-CoV2 с использованием Latitude-S и скрининга изображений. (A) Скрининг полученных микрофотографий: 1D CTF fit, 2D CTF fit и CTF параметры; оценка данных о спайковом белке SARS-CoV2 с использованием cisTEM. 1D CTF fit и кольцо Thon показывают, что общий сигнал составляет 4,8 Å. (B) Микроснимки при двух разных значениях расфокусировки спайкового белка получены с использованием Latitude-S. Шкала стержней = 50 нм. (C) Итоговое среднее значение 2D-класса. Среднее значение 2D-класса показывает верхний, нижний и боковой вид белка спайка. Все детали с высоким разрешением видны в средних значениях 2D-класса. Сокращения: крио-ЭМ = криоэлектронная микроскопия; 1D = одномерный; 2D = двумерный; CTF = функция передачи контраста; SARS-CoV2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S8: Обработка данных о спайковом белке SARS-CoV2, полученных с помощью программного обеспечения Latitude-S. На изображении показан рабочий процесс, используемый для обработки крио-ЭМ данных спайкового белка. 3D классификация спайкового белка выполняется с использованием Relion 3.0. Класс-1 показывает открытую конформацию 1-RBD. Класс-3 и Класс-4 показывают все RBD близкой конформации спайк-белка. Класс-5 показывает промежуточную конформацию спайкового белка. Сокращения: крио-ЭМ = криоэлектронная микроскопия; 3D = трехмерный; RBD = рецептор-связывающий домен; SARS-CoV2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S9: Дозо-фракционированное изображение, полученное в качестве эталона для окончательного получения изображения. Изображения фракционирования дозы снимаются с экспозицией 8,0 с и экспозицией 0,2 с/кадр. Нажмите кнопку «Автосохранение » рядом с камерой, чтобы автоматически сохранять файлы фильма. После получения изображения нажмите на изображение и сохраните параметры изображения, фракционированные дозой, используя кнопку обновления изображения в состоянии сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S10: Угловое распределение и корреляция оболочки Фурье сгенерированного SARS-CoV-2 1 RBD вверх по открытой карте белка всплеска конформации. (A) Угловое распределение окончательной 3D-модели 1-RBD вверх по открытой конформации спайкового белка. Синий представляет более низкие значения, а красный представляет более высокие значения нормализованного распределения частиц. (B) Кривая корреляции оболочки Фурье, показывающая разрешение 4,4 Å открытой конформации спайкового белка 1-RBD вверх, оцененной на отсечке. Сокращения: 3D = трехмерный; RBD = рецептор-связывающий домен; SARS-CoV2 = тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2; FSC = корреляция оболочки Фурье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Состояние изображения атласа | Атлас 115 |
| Увеличение | 115, Размер пикселя 34.7 нм |
| Показанная дефокусировка | 4.38 мм |
| Размер пятна | 8 |
| Яркость | 934400 |
| Режим | ВИЗУАЛИЗАЦИЯИЛМ |
| Биннинг | 1 |
| Время экспозиции | 1.0 с |
| Состояние обследования сети | Сетка 380 |
| Увеличение | 380, Размер пикселя 11.2 нм |
| Показанная дефокусировка | 2.37 мм |
| Размер пятна | 8 |
| Яркость | 626200 |
| Режим | ВИЗУАЛИЗАЦИЯИЛМ |
| Биннинг | 1 |
| Время экспозиции | 1.0 с |
| Состояние обследования скважин | Отверстие 3400 |
| Увеличение | 3,400, Размер пикселя 1.20 нм |
| Показанная дефокусировка | -0.75 мкм |
| Размер пятна | 7 |
| Диаметр балки | 8.81 мкм |
| Режим | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Биннинг | 1 |
| Время экспозиции | 1.0 с |
| Состояние фокусировки | Фокус 45k |
| Увеличение | 45,000, Размер пикселя 0.0924 нм |
| Показанная дефокусировка | 4.51 мкм |
| Размер пятна | 6 |
| Диаметр балки | 0.716 мкм |
| Режим | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Биннинг | 1 |
| Время экспозиции | 1.0 с |
| Акцизионное государство | Данные 45k |
| Увеличение | 45,000, Размер пикселя 0.0924 нм |
| Установка расфокусировки | Мин: -4 500 нм, Макс: -1 500 нм, Шаги: 250 нм |
| Размер пятна | 6 |
| Диаметр балки | 0.752 мкм |
| Режим | ВИЗУАЛИЗАЦИЯILM,SA,Mh |
| Биннинг | 1 |
| Время экспозиции | Общая экспозиция 8 с за 20 кадров |
| Настройка камеры | Подсчитано, Коэффициент усиления нормирован, Дефект исправлен |
| Настройка сохранения данных | МРК |
Таблица 1: Сводка настроек состояния Latitude-S.
| Спецификация | База K2 | Саммит К2 |
| Рабочее напряжение ТЭМ | 200-400 кВ | |
| Активная область датчика | 19,2 мм × 18,6 мм | |
| Размер датчика в пикселях | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Супер- Резолюция |
| Физический размер в пикселях | 5 мкм | |
| Биннинг | в 1–8 раз | |
| Считывание показаний датчика | Любая произвольная область | |
| Увеличение относительно пленки | в 1,3–1,5 раза | |
| Скорость считывания показаний датчика | 50 полных кадров в секунду | 400 полных кадров в секунду |
| Скорость передачи данных на компьютер | 8 полных кадров в секунду | 40 полных кадров в секунду |
| Отображение изображений | 8 полных кадров в секунду | 10 полных кадров в секунду |
| Производительность DQE (300 кВ) | >0.30 (пик) >0.25 при 0.5 физического Найквиста | >0.7 (пик) >0.50 при 0.5 физический Найквист >0.06 при 1.25 физический Найквист |
| Программное обеспечение | Набор для микроскопии Gatan, включая цифровой микрограф |
Таблица 2: Технические характеристики камеры.
| Параметр конфигурации | Ценность |
| Тип микроскопа | Талос Арктика G2 |
| Высокое напряжение | 200 кВ |
| Источник | XFEG |
| Линза | Крио Твин |
| Вакуумная система | Талос ТМП ИГП |
| Загрузчик образцов | Автозагрузчик |
Таблица 3: Конфигурация микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Latitude-S — это интуитивно понятный пользовательский интерфейс, который обеспечивает среду для автоматической настройки и сбора тысяч микроснимков высокого разрешения или файлов фильмов за два дня. Он обеспечивает легкую навигацию по сеткам и поддерживает положение ступени микроскопа, когда она движется от низкого увеличения к высокому увеличению. Каждый этап сбора данных с помощью Latitude-S экономит время, благодаря таким функциям, как простой пользовательский интерфейс, быстрая потоковая передача данных со скоростью до 4,5 ГБ/с и одновременное отображение данных во время сбора. Кроме того, предварительнокалиброванное фракционирование дозы, параметры мощности дозы, фокусировки и увеличения были легко перезагружены, чтобы начать новый сеанс автоматического сбора данных и сэкономить время.
Получение данных автоматически при отсутствии постоянного мониторинга и без ущерба для качества набора данных является сложной и трудоемкой задачей. Автоматизированный сбор данных с использованием программного обеспечения Latitude-S удобен, когда время и ресурсы являются основными ограничениями, особенно во время этой пандемии. Однако за последние несколько месяцев было решено несколько крио-ЭМ-структур различных белков SARS-CoV-2, что поможет фармацевтическим компаниям разрабатывать вакцины. Различные лаборатории используют различные типы пакетов программного обеспечения для автоматического сбора данных для сбора данных. Мы использовали Latitude-S с K2 Summit DED для автоматического сбора крио-EM данных о дырявых углеродных сетях или самодельных сетках с покрытием GO30.
Это исследование было проведено с использованием вышеупомянутых параметров в разделе протокола, что является убедительным доказательством того, что Latitude-S является подходящим и идеальным программным пакетом для автоматического сбора данных для крио-ЭМ с одной частицей. Тем не менее, настоятельно рекомендуется следовать определенным протоколам перед началом съемки с помощью камеры K2. Камера прямого обнаружения K2 требует основных процедур технического обслуживания для достижения максимальной производительности. Регулярный отжиг камеры до 50° в течение 24 ч помогает датчику работать оптимально, уменьшая фоновый шум и загрязнение на поверхностном уровне. Тем не менее, после отжига камеры обновление усиления и темных ссылок камеры является обязательным шагом (занимает ~ 45 минут) перед выполнением любого захвата изображения.
Хотя Latitude-S является стабильным и удобным программным пакетом для автоматического сбора крио-EM данных, важно оптимизировать различные параметры (увеличение, размер пятна, яркость и мощность дозы) в 5 различных состояниях Latitude-S в начале. Увеличение отверстий или состояний сетки зависит от размеров отверстий дырявых решеток или типов отверстий сетки (например, R2/2 или R1.2/1.3 или R 0,6/1). Например, размер отверстия сетки типа R0.6/1 составляет 0,6 мкм, а размер отверстия сетки R2/2 - 2 мкм. Таким образом, для правильной визуализации отверстий для типов сетки R0.6/1 и R2/2 в состояниях сетки и отверстий в Latitude-S требуются два различных типа увеличения.
Поэтому настройки увеличения для различных типов сеток в 5 различных состояниях будут переменными. Размер пятна и яркость сильно зависят от увеличения. Следовательно, эти значения могут изменяться при разных значениях увеличения. Поэтому рекомендуется оптимизировать различные параметры 5 различных состояний Latitude-S с использованием различных типов крио-ЭМ-сетей перед началом автоматического сбора данных. Однако, как только все параметры оптимизированы и сохранены, легко перезагрузить все параметры в зависимости от требований пользователя и использовать Latitude-S при различных увеличениях или типах сетки.
Важным преимуществом использования K2 с Latitude-S является то, что пользователи могут легко регулировать открытие / закрытие клапана луча, вставлять / убирать камеру, вставлять / втягивать люминофорный экран микроскопа и регулировать заполнение жидким азотом с помощью графического интерфейса Latitude-S. Однако любые другие опции (такие как наклон пушки, сдвиг пушки, смещение луча, точки поворота, центрирование диафрагмы C2, центр вращения, выравнивание без комы) недоступны через вкладку K2 Latitude-S GUI Tab (дополнительный рисунок S1 и рисунок 2). В течение долгих часов сбора данных положение луча может смещаться.
Latitude-S может выполнять автоматические периодические проверки и корректировки для отслеживания стабильности системы в течение всего периода сбора данных. Стабильность системы поддерживается за счет центрирования луча и обновления темных ссылок. Постоянная проверка обеспечивает высокое качество получаемых данных. В Latitude-S эйцентрическая высота (Z-высота) корректируется только один раз перед сбором данных, а высота эвцентрика вычисляется автоматически Latitude-S при изменении квадрата сетки. Фокус автоматически измеряется и регулируется в зависимости от заданного пользователем диапазона фокусировки. Программа сбросит позицию Z этапа, если она превысит заданное пороговое значение. Эта стабильность контролируется с помощью палитры «Стабильность системы». Однако, как и другие пакеты автоматического сбора данных, Latitude-S также имеет некоторые ограничения.
Широта-S не может вычислить эйцентрическую высоту (Z-высоту), если сетка неравномерна. В этом случае он не может собирать какие-либо данные, иначе значения расфокусировки будут полностью вне диапазона. Поэтому пользователи должны быть крайне осторожны, чтобы подготовить свои сетки без каких-либо изгибов и отображать только плоские сетки с помощью Latitude-S. Кроме того, в отличие от Leginon, SerialEM и UCSF-Image, Latitude-S не является свободно доступным программным пакетом. Latitude-S совместим с камерами Gatan, включая отфильтрованные или автономные базовые камеры прямого обнаружения K2, K3 и K3, а также камеры Rio и OneView. Другим важным недостатком для пользователей является то, что он не совместим с другими популярными DED, такими как Falcon DED. Тем не менее, это также верно для EPU, другого пакета программного обеспечения для автоматического сбора данных, который доступен с криомикроскопами и совместим только с камерой Falcon. Тем не менее, EPU также функционирует с K2 / K3 с энергетическим фильтром (BioQuantum K3 Imaging Filter), но не с автономной камерой K2 / K3.
Latitude-S очень похож на EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation и Leginon, которые являются программными пакетами, используемыми для автоматического сбора данных для крио-EM с одной частицей. Однако Latitude-S совместим только с фильтром обработки изображений K2 DED, K3 DED или BioQuantum K3. Кроме того, компания обеспечивает постоянную техническую поддержку для пользователей Latitude-S. Эта техническая поддержка полезна для небольших групп пользователей, которым необходимо использовать устройства K2 DED, K3 DED или BioQuantum K3 Imaging Filter для сбора данных и которые не имеют предварительных знаний о том, как настроить или использовать бесплатные программные пакеты, такие как SerialEM и Leginon.
Есть много других функций, таких как микрокристаллическая дифракция электронов (microED), томография и энергодисперсионная рентгеновская спектрометрия (EDS), которые доступны в различных других версиях Latitude. Поэтому пользователи могут использовать один и тот же программный пакет для сбора данных в других режимах. Насколько нам известно, сбор данных для микроЭД, томографии и ЭЦП недоступен в EPU или любых других пакетах программного обеспечения. Таким образом, этот программный пакет Latitude может быть полезен для различных целей в дополнение к автоматическому сбору данных в криоЭМ с одной частицей. Тем не менее, SerialEM и Leginon, оба бесплатных пакета программного обеспечения, подходят для камер Falcon или K2 / K3 и чрезвычайно полезны для новых пользователей. Однако Latitude-S не находится в свободном доступе, что может быть недостатком этого программного пакета.
Таким образом, инструмент автоматического сбора данных Latitude-S так же хорош, как и другие пакеты программного обеспечения для автоматического сбора данных (например, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S - это чрезвычайно стабильный и удобный в использовании пакет программного обеспечения для сбора данных, который доступен с фильтрованными или автономными базовыми камерами прямого обнаружения K2, K3 и K3, а также камерами Rio и OneView.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих или финансовых конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность Департаменту биотехнологии, Департаменту науки и техники (DST) и науки, а также Министерству развития людских ресурсов (MHRD), Индия, за финансирование и крио-ЭМ-объект в IISc-Бангалоре. Мы принимаем участие в программе DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) и DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) для Национального крио-ЭМ-объекта в IISc, Бангалор. Мы выражаем финансовую поддержку со стороны Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) (грант No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 и SERB-IPA/2020/000094), DBT (Грант No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Мы благодарим г-жу Исику Праманик за подготовку крио-ЭМ-сетей, сбор крио-ЭМ данных и подготовку Таблицы материалов. Мы также благодарим г-на Сумана Мишру за крио-ЭМ обработку изображений и за помощь в подготовке рисунков. Мы благодарим профессора Рагхавана Варадараджана за помощь в получении очищенного образца спайкового белка для этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
