Summary
DetectSyn er et upartisk, hurtigt fluorescerende assay, der måler ændringer i relativ synaps (præ- og postsynaptisk engagement) antal på tværs af behandlinger eller sygdomstilstande. Denne teknik anvender en nærhedsligeringsteknik, der kan bruges både i dyrkede neuroner og fast væv.
Abstract
Synapser er stedet for kommunikation mellem neuroner. Neuronal kredsløbsstyrke er relateret til synaptisk tæthed, og nedbrydningen af synapser er karakteristisk for sygdomstilstande som større depressiv lidelse (MDD) og Alzheimers sygdom. Traditionelle teknikker til at undersøge synapsetal omfatter genetisk ekspression af fluorescerende markører (f.eks. Grønt fluorescerende protein (GFP)), farvestoffer, der fylder en neuron (f.eks. Carbocyaninfarvestof, DiI) og immunofluorescerende påvisning af rygsøjlemarkører (f.eks. Postsynaptisk densitet 95 (PSD95)). En stor advarsel mod disse proxyteknikker er, at de kun identificerer postsynaptiske ændringer. Alligevel er en synaps en forbindelse mellem en præsynaptisk terminal og en postsynaptisk rygsøjle. Guldstandarden til måling af synapsdannelse / eliminering kræver tidskrævende elektronmikroskopi eller arraytomografiteknikker. Disse teknikker kræver specialuddannelse og dyrt udstyr. Desuden kan kun et begrænset antal neuroner vurderes og bruges til at repræsentere ændringer i en hel hjerneregion. DetectSyn er en hurtig fluorescerende teknik, der identificerer ændringer i synapsdannelse eller eliminering på grund af en sygdomstilstand eller lægemiddelaktivitet. DetectSyn anvender et hurtigt nærhedsligeringsassay til at detektere sidestillede præ- og postsynaptiske proteiner og standard fluorescerende mikroskopi, en teknik, der er let tilgængelig for de fleste laboratorier. Fluorescerende detektion af den resulterende puncta muliggør hurtig og upartisk analyse af eksperimenter. DetectSyn giver mere repræsentative resultater end elektronmikroskopi, fordi større områder kan analyseres end et begrænset antal fluorescerende neuroner. Desuden fungerer DetectSyn for in vitro-dyrkede neuroner og faste vævsskiver. Endelig tilvejebringes en metode til at analysere de data, der indsamles fra denne teknik. Samlet set tilbyder DetectSyn en procedure til påvisning af relative ændringer i synapsetæthed på tværs af behandlinger eller sygdomstilstande og er mere tilgængelig end traditionelle teknikker.
Introduction
Synapser er den grundlæggende kommunikationsenhed mellem neuroner1. Mange synapser mellem neuroner inden for de samme regioner giver anledning til kredsløb, der formidler adfærd2. Synapser består af en præsynaptisk terminal fra en neuron, der frigiver neurotransmittere eller neuropeptider, der videresender information til postsynaptiske receptorer af en anden neuron. Summen af præsynaptiske signaler bestemmer, om den postsynaptiske neuron vil affyre et handlingspotentiale og udbrede beskeden til andre neuroner.
Synaptopatologi, nedbrydning af synapser, opstår i sygdomme og lidelser præget af nedsat neuralt volumen, som Alzheimers sygdom og større depressiv lidelse, hvilket resulterer i kredsløb, der ikke længere optimalt udfører 3,4,5. Gendannelse af synapsetæthed ligger sandsynligvis til grund for effektiviteten af potentielle behandlinger for disse lidelser. For eksempel blev det for nylig påvist, at stigende synapser ligger til grund for adfærdsmæssig effektivitet af hurtige antidepressiva6. For hurtigt at screene mulige synaptopatologiske behandlinger kræver forskere teknikker, der hurtigt identificerer ændringer i synapsenumre.
Nuværende metoder er enten tidskrævende og dyre (elektronmikroskopi, arraytomografi), eller de undersøger kun postsynaptiske ændringer uden at inkorporere præsynaptisk engagement (rygsøjleanalyser, immunofluorescens / colokalisering). Farvestoffer som DiI eller fluorescerende proteiner som GFP hjælper med at visualisere neuroner og karakterisere postsynaptiske rygsøjler. Rygsøjleanalyse bruger imidlertid forskerdefinerede forhold til at bestemme morfologi, hvilket kan reducere reproducerbarheden7. Desuden er det stadig afdækket, hvordan de forskellige rygsøjleklasser relaterer sig til funktionelle synapser8. Rygsøjledannelse kan være forbigående og kan afspejle postsynaptisk plasticitet, men disse rygsøjler kan elimineres, før de stabiliseres til en synaps med en præsynaptisk neuron9.
Colokalisering giver en bedre proxy for synapser end rygsøjleanalyse, fordi man kan immunstain for præsynaptiske og postsynaptiske proteiner. Imidlertid kan synaptiske proteiner give lave colokaliseringsværdier, fordi proteinerne er sidestillet og muligvis ikke konsekvent overlapper hinanden. Fordi proteinerne ikke er helt overlejret, kan colokaliseringsteknikker muligvis ikke nøjagtigt måle ændringer i synapsdannelse på grund af denne manglende information. Endelig, selvom både elektronmikroskopi (EM) og arraytomografi giver billeder i høj opløsning af synapser, er de tidskrævende. EM kræver desuden specialudstyr, og forskere er begrænset til små mængder væv til et givet eksperiment. Mens arraytomografi elegant giver mulighed for at screene for mange proteiner på ultratynde sektioner og kan kombineres med EM10, kan denne teknik være for arbejdskrævende og uden for rammerne af eksperimenter, der skal scanne hurtigt for ændringer i synapsdannelse.
DetectSyn er en specifik anvendelse af Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen muliggør generel påvisning af protein-protein-interaktioner. DetectSyn broer proxy postsynaptiske målinger ved at forstærke et fluorescerende signal udsendt af mærkede præ- og postsynaptiske proteiner inden for 40 nm fra hinanden. Hvis de synaptiske proteiner er inden for 40 nm, som inden for en synaptisk kløft, vil de sekundære antistoffer, der indeholder DNA-sonder, hybridisere sig til cirkulært DNA. Dette hybridiserede cirkulære DNA udtrykker en fluorescerende sonde, som derefter amplificeres og detekteres med standard fluorescerende mikroskopiteknikker (se figur 1). Det afgørende er, at i modsætning til EM og array tomografi kræver denne teknik ikke specialudstyr og tager omtrent samme tid som standard immunhistokemi. Tilgængeligheden af denne teknik gør det således muligt for forskere uden for forskningsintensive institutioner at deltage i synaptopatologisk forskning. Desuden kan denne teknik undersøge ændringer i synaptisk tæthed i flere hjerneområder inden for et enkelt eksperiment, hvilket giver en mere holistisk repræsentation af synaptiske ændringer på grund af sygdom eller behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Isolering af celler og væv fra dyr var i overensstemmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
BEMÆRK: Denne protokol anvendes på prøver, der allerede er behandlet og fastgjort i henhold til specifikke eksperimentelle paradigmer og krav. Til demonstrationsformål anvendes synapsdannelse på grund af hurtig antidepressiv behandling til at fremhæve denne synapsdetektionsteknik6. Neuroner, der tidligere er dyrket på dæksedler, behandlet, fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA) og opbevaret i 1x fosfatbufret saltvand (PBS), vil blive brugt til at fremhæve in vitro-procedurerne. Tidligere skåret hippocampalt væv (25 μm tykt) fra mus behandlet, transkardielt perfuseret med iskold PBS og 4% PFA, og derefter opbevaret i kryoprotektiv vil blive brugt til at fremhæve skiveprocedurerne. Se11,12 for mere information om, hvordan man dyrker neuroner eller transkardielt perfuse gnavere. Se figur 1 for en grafisk gengivelse af denne procedure.
Figur 1: Grafisk repræsentation af DetectSyn-assay. Efter permeabiliserende cellemembraner binder primære antistoffer for Synapsin1 og PSD95 sig til disse synaptiske proteiner. Sekundære med oligonukleotidmærker binder derefter til de primære antistoffer. Hvis Synapsin1 og PSD95 er inden for 40 nm, som ved en synapse, interagerer oligonukleotiderne, og et fluorescerende tag forstærkes. Dette fluorescerende signal kan derefter afbildes via standardmikroskopi og analyseres. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Skyl prøver
- Skyl prøverne med 500 μL 1x PBS + 0,75% glycin i 5 min 3 gange med blid omrøring på en orbital shaker for at fjerne resterende PFA eller kryoprotektant.
2. Bloker og permeabiliser prøver
- Forbered blokerings- og permeabiliseringsopløsning (10% normalt æselserum, 0,25% Tween 20) i 1x PBS. Forbered dig nok til at bruge til blokering, primære og sekundære inkubationer.
- Til prøver (f.eks. dæksler eller fritflydende skiver) i 24 brøndplader tilsættes 500 μL blokerings- og permeabiliseringsopløsning. Sørg for, at hver brønd indeholder en anden prøve og er korrekt mærket for at forhindre, at prøver skiftes.
- Inkubere prøverne ved stuetemperatur (RT) i 60 minutter for dyrkede celler eller 2 timer for skiveskåret væv. Brug en orbital shaker til blid omrøring.
3. Inkubere prøver i primære antistoffer
- Forbered primære antistoffer i blokerende buffer:
- Forbered postsynaptisk densitet 95 (PSD95; 1:500, kaninpolyklonal), Synapsin1 (1:500, musemonoklonal), MAP2 (1:400, kyllingepolyklonal)
- Forbered en negativ kontrolalikvote, der udelader et af de synaptiske par (f.eks. uden PSD95)
- Fjern forsigtigt blokeringsopløsningen med en pasteur-pipette af plast. Prøv at fjerne så meget som muligt uden at forstyrre cellerne eller rive væv.
- For dyrkede celler:
- Link en stor plastik petriskål med parafilm. Overfør forsigtigt dæksler til parafilmen ved hjælp af tang.
- Tilsæt forsigtigt 60 μL af den primære antistofopløsning til toppen af dækslipsene. Sørg for ikke at spilde den primære antistofopløsning over siden af dæksedlen.
- For at give fugtighed og forhindre, at prøver tørrer ud i inkubationsperioden, tilsættes ultrarent vand til en mindre petriskål og arrangeres omhyggeligt den lille petriskål omkring dæksedlerne.
- Dæk den store petriskål og inkuber dyrkede celler i 1 time ved RT.
- Til skiveskåret væv:
- Tilsæt forsigtigt 250 μL af den primære antistofopløsning til fritsvævende skiver i en plade med 24 brønde.
- Dæk pladen til, og inkuber vævet natten over ved 4 °C med blid omrøring på en orbitalryster.
4. Vask prøver, og inkuber derefter sekundære antistoffer
- Forbered sekundære antistoffer i blokeringsbufferen:
- Forbered æsel anti-mus (1:5), æsel anti-kanin (1:5), æsel anti-kylling (1:400).
- På dette trin kan yderligere tekniske kontroller opnås ved at forberede en sekundær alikvote, der udelader enten anti-mus eller anti-kanin sekundær.
- For dyrkede celler:
- Brug tang til forsigtigt at trykke den primære opløsning af dæksedler på et papirhåndklæde
- Brug tang til forsigtigt at overføre dæksedlerne tilbage til deres oprindelige 24 brøndplade fyldt med 500 μL 1x PBS.
- Til skiveskåret væv:
- Fjern forsigtigt den primære antistofopløsning med en pasteurpipette af plast. Prøv at fjerne så meget som muligt uden at rive væv.
- Tilsæt 500 μL 1x PBS
- Prøverne vaskes i 10 min 3 gange i 1x PBS med blid omrøring på en orbital shaker. I løbet af denne tid skal du bringe alle vaskebuffere til RT.
- I løbet af denne tid skal du ændre parafilmen i den store petriskål
- For dyrkede celler:
- Brug tang til forsigtigt at overføre dæksedlerne tilbage til den parafilmede store petriskål
- Tilsæt forsigtigt 40 μL af den sekundære antistofopløsning til toppen af dækslipsene. Sørg for ikke at spilde den sekundære antistofopløsning over siden af dæksedlen.
- Tilsæt om nødvendigt mere ultrarent vand til en mindre petriskål og arranger omhyggeligt den lille petriskål omkring dæksedler.
- Dæk den store petriskål til
- Til skiveskåret væv:
- Tilsæt forsigtigt 250 μL af den sekundære antistofopløsning til fritsvævende skiver i en plade med 24 brønde.
- Dæk pladen til
BEMÆRK: Herfra skal du beskytte prøver mod lys ved at pakke toppen af pladerne ind med folie.
- Inkubere prøverne ved 37 °C i 1 time
5. Ligation
- Bland ligationsbestanden 1:5 i vand af molekylær kvalitet.
- Som i punkt 4 skal du forsigtigt overføre dækslipsene og fjerne den sekundære blanding fra det skivede væv.
- Prøverne vaskes i 500 μL vaskebuffer A
- For dyrkede celler vaskes 2 gange i 5 minutter. Til skiveskåret væv vaskes 2 gange i 10 minutter. Brug blid omrøring på en orbital shaker til begge.
- I løbet af denne tid skal du ændre parafilmen i den store petriskål
- Mens du holder ligasen på en kold blok, fortynd ligasen 1:40 i ligationsbestanden fra trin 5.1. Udfør denne fortynding umiddelbart før tilsætning af ligasen til prøverne.
- Som i punkt 4 skal du fjerne så meget af vaskebufferen A som muligt fra prøverne, før ligasen tilsættes.
- For dyrkede celler: Overfør dæksler tilbage til den parafilmede petriskål. Tilsæt 40 μL af ligationsblandingen til dæksedler, arranger små vandfyldte petriskåle omkring dæksedlerne, og dæk den store petriskål.
- Til skiveskåret væv: Tilsæt 250 μL af ligationsblandingen fra trin 5.4 til hver brønd og dæk pladen.
- Prøverne inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
6. Forstærkning
- Bland forstærkningsbestanden 1:5 i vand af molekylær kvalitet.
- Som i punkt 4 skal du forsigtigt overføre dækslipsene og fjerne ligationsblandingen fra det skivede væv.
- Vask prøver i 500 μL vaskebuffer A
- For dyrkede celler vaskes 2 gange i 2 minutter. Til skiveskåret væv vaskes 2 gange i 10 minutter. Brug blid omrøring på en orbital shaker til begge.
- I løbet af denne tid skal du ændre parafilmen i den store petriskål
- Udfør denne fortynding umiddelbart før tilsætning af polymerasen til prøver. Mens polymerasen holdes på en kold blok, fortyndes polymerase
- For dyrkede celler fortyndes polymerase 1:80 i amplifikationsbestanden fra trin 6.1.
- For skiveskåret væv fortyndes polymerase 1:40 i amplifikationsmassen fra trin 6.1.
- Som i trin 4 skal du fjerne så meget af vaskebufferen A som muligt fra prøverne, før polymerasen tilsættes.
- For dyrkede celler: Overfør dæksedlerne tilbage til den parafilmede petriskål. Tilsæt 40 μL af forstærkningsblandingen fra trin 6.4.1 til dæksedler, arranger små vandfyldte petriskåle omkring dækslipsene, og dæk den store petriskål. Prøverne inkuberes i 100 minutter ved 37 °C.
- For skiveskåret væv: Tilsæt 250 μL af forstærkningsblandingen fra trin 6.4.2 til hver brønd, og dæk pladen. Prøverne inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: I løbet af denne tid skal du forberede og mærke dias.
7. Montering
- Som i trin 4 skal du forsigtigt overføre dækslipsene og fjerne forstærkningsblandingen fra det skivede væv.
- Prøverne vaskes i 500 μL vaskebuffer B 2 gange i 10 minutter med skånsom omrøring på en orbitalryster.
- Prøverne vaskes i 500 μL 1% vaskebuffer B i 1 min. med skånsom omrøring på en orbitalryster.
- For dyrkede celler:
- Slip 3 μL monteringsmedier på et dias
- Tryk på overskydende vaskebuffer fra dæksedlen, og anbring derefter dækslen (med cellerne nedad) i monteringsmediet. Forsegl siderne med en lille mængde klar neglelak for at forsegle dæksedlen på plads.
- Til skiveskåret væv:
- Overfør forsigtigt en vævsskive til det forberedte dias og arranger det, så skiven ligger fladt. Fald mellem 5-10 μL monteringsmedier (mængden afhænger af skivens størrelse) på vævsskiven
- Læg forsigtigt et glasdæksel over vævsskive og forsegl med en lille mængde klar neglelak langs kanten for at forsegle dækslippen på plads.
- Vent mindst 15 minutter, før du analyserer under mikroskopet, eller opbevar ved -20 °C.
8. Få digitale billeder med et konfokalmikroskop
- Optimer anskaffelsesindstillingerne (f.eks. lasereffekt, forstærkning, forskydning) på tværs af prøver fra alle behandlinger. Sørg for, at optimeringen inkluderer faldende baggrundsstøj og forbedring af signalet uden at overmætte intensiteten af de fluorescerende signaler. Når indstillingerne er fastlagt, skal du anvende de samme anskaffelsesindstillinger på tværs af alle opnåede billeder.
BEMÆRK: Følgende anskaffelsesoplysninger kan bruges med et Nikon A1-konfokalmikroskop og Nikon NIS AR Elements-softwaren. - Indstil diaset med prøven på scenen, og find brændplanet for prøven ved hjælp af DAPI gennem okularet.
- Sluk for øjenporten ved at klikke på Eye-porten, og vælg en optisk konfigurationsknap for at justere indstillingerne.
- Juster forstærknings-, forskydnings- og lasereffekten for hver fluorescerende kanal for at reducere baggrundsstøj og forbedre det fluorescerende signal. Sørg for, at det fluorescerende signal ikke bliver overmættet som nævnt i trin 8.5-8.6.
- Overvåg overmætning ved hjælp af en pseudofarve til det fluorescerende signal. Nederst i livebilledet skal du højreklikke på fanen mærket med den fluorescerende kanal, der aktuelt bruges.
- Vælg derefter Kanalfarvning og vælg en pseudofarve som Rainbow Dark for at visualisere fluorescensintensiteten i en varmekortlignende pseudofarve. I Rainbow Dark indikerer køligere farver mindre fluorescerende intensitet, og varmere farver indikerer mere fluorescerende intensitet.
- Når alle fluorescerende kanaler er optimeret, skal du højreklikke på den tidligere valgte optiske konfigurationsknap og vælge Tildel aktuel kameraindstilling for denne knap.
- Kontroller, at de valgte indstillinger er tilstrækkelige til en tilfældig prøve fra hver behandlingsgruppe. Hvis de valgte indstillinger overmætter nogen af disse prøver, skal du gentage trin 8.4 for at eliminere overmætningen.
- For dyrkede neuroner skal du følge trin 8.10-8.16.
- Brug øjenporten til at søge efter en neuron med dendritter, der har minimal overlapning med andre dendritter.
- Sluk for øjenporten, og brug DAPI-kanalen til at visualisere cellelegemet i den valgte neuron. Dobbeltklik på midten af soma for at centrere neuronen midt i synsfeltet.
- Brug MAP2-kanalen til at finde det bedste fokusplan for MAP2-signalet med live scanning.
- Under fanen ND-erhvervelse skal du klikke på Gem i fil og vælge en fil, du vil gemme billedet i under Gennemse. Indtast derefter filnavnet.
- Under fanen Z skal du vælge indstillingen Symmetrisk tilstand defineret af område . Indstil fokus til det bedste MAP2-plan, og klik på knappen Relativ for at indstille dette fokusplan som midten af z-stakken.
- Indstil området til 5 μm med trin på 1 μm, og sørg for at markere Luk aktiv lukker under Z-bevægelse. Under fanen Bølgelængde skal du vælge navnet på den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under Optical Conf. Klik derefter på Kør nu.
- Gentag trin 8.1.10-8.1.15 for ca. 10 neuroner pr. dækslip/behandling.
- For skiveskåret væv skal du følge trin 8.18-8.22.
- Brug øjenporten til at søge efter det område, der er af interesse. Find for eksempel CA1 i hippocampus.
- Sluk for øjenporten, og brug MAP2-kanalen til at finde det bedste fokusplan for MAP2-signalet med live scanning.
- Vælg Scan stort billede i menuen Hent. Vælg derefter navnet på den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under panelet Optagelse fra det panel, der åbnes. Sørg også for at vælge det rigtige mål i dette panel.
- Under områdepanelet og okularet skal du bruge piletasterne til at indstille grænserne for det område, der er af interesse. Klik derefter på Gem stort billede til fil og opret et filnavn på gemmesti til billedet.
- Under panelet Opsætning skal du sørge for, at Multikanaloptagelse er markeret, og derefter vælge navnet på den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under Optisk conf.
BEMÆRK: En z-stack til et stort billede er mulig, men vil øge scanningstiden.
9. Bedømmelse
- I lighed med anskaffelsesindstillinger skal du bruge prøver fra alle behandlinger til at optimere tærskelindstillinger. Sørg for, at tærskeloptimeringen fokuserer på at mindske baggrundsstøj og forbedre signalet uden at overmætte intensiteten af de fluorescerende signaler. Når disse indstillinger er fastlagt, skal du anvende de samme tærskelindstillinger på tværs af alle billeder, der bruges til analyse, som beskrevet i trin 9.2-9.3.
- I ImageJ er tærskelindstillingen placeret under menuen Billede > Juster > tærskelværdi. Vælg Mørk baggrund mulighed, hvis billedet har en mørk baggrund.
- Juster derefter de øvre og nedre grænser for tærsklen pr. Tidligere bestemte optimerede tærskelindstillinger, og klik derefter på Anvend.
- For dyrkede celler skal du bruge MAP2-kanalen og et freehand region of interest (ROI) værktøj til at tegne et ROI for hver neuron, herunder dendritter og soma. For skiveskåret væv skal du tegne et frihånds-ROI inden for skivebilledet, der indkapsler interesseområdet (f.eks. Stratum radiatum af CA1 i hippocampus).
- Få området for ROI. I ImageJ skal du måle området under menuen Analysér > Måling.
- Registrer antallet af punkteringer inden for hvert investeringsafkast ved hjælp af et automatisk detektionsværktøj som partikelanalyse i ImageJ ved at følge trin 9.7-9.9.
- Find indstillingen Partikelanalyse under menuen Analysér > Analysér partikler. Først skal du definere puncta størrelse diameter, typisk 0,1-3 μm2.
- Vælg derefter Indstillingen Overlaymasker i rullemenuen Vis, og kontroller indstillingen Vis resultater. Klik derefter på OK.
- Hvis puncta ikke registreres med det valgte diameterområde, skal du justere området, indtil alle punkteringer er detekteret med denne analyse. Sørg for at bruge de samme indstillinger for partikelanalyse for alle billeder.
- Del antallet af puncta med området for en enkelt region af interesse ved at følge trin 9.11-9.13.
- Kopiér og indsæt resultaterne for hvert billede fra pop op-vinduet Resultater fra ImageJ i et regneark.
- Først skal du identificere, hvilken fil og prøve dataene blev opnået fra. Del derefter området for ROI med antallet af puncta.
- Ryd derefter dataene fra pop op-vinduet Resultater, og gentag trin 9.2-9.12.
- Normaliser resultaterne for at kontrollere prøver: Gennemsnit resultaterne (antal punkteringer / ROI-område) for kontrolprøverne. Del derefter de opnåede resultater af alle prøver med gennemsnittet af kontrollen for at opnå de normaliserede resultater. Det nye gennemsnit af kontrolprøverne skal være lig med 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data modificeret fra Heaney et al.6 præsenteres for at demonstrere et eksperiment, hvor øget synapsdannelse forventes (se6 for mere information og en mere dybtgående diskussion af mekanismen). Tidligere blev det påvist, at hurtige antidepressiva kræver aktivering af den hæmmende metabotrope receptor, GABAB (gamma-aminosmørsyre subtype B), for at være effektiv13. Endvidere viste tidligere data, at hurtige antidepressiva øger postsynaptiske markører14; således blev DetectSyn brugt til at teste hypotesen om, at hurtige antidepressiva øger synapsetal for at være effektive.
I dyrkede neuroner testes fire betingelser. For det første blev dyrkede neuroner i det øverste panel i figur 2A behandlet med køretøjet under de samme betingelser som den eksperimentelle kontrol. Psd95's primære antistof er dog udeladt for at tilvejebringe en teknisk kontrol for DetectSyn-assayet (se figur 1 for, hvordan hver komponent bidrager til signalet). Dernæst behandles neuroner igen med køretøjet i kontrolpanelet, men modtager både PSD95 og Synapsin1 primærvalg. Dernæst behandles dyrkede neuroner kun med det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 (Ro) eller Ro plus GABAB-agonisten, baclofen (Bac). Som tidligere påvist13 kræves både det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 og GABAB-agonistbaclofen for in vitro-effekten af Ro-25-6981. Således demonstreres en stigning i synapsdannelsen ved en stigning i hvid puncta (figur 2A). Uden baclofen ses ingen stigning i synapsdannelse in vitro .
In vivo er basale GABA-niveauer tilstrækkelige til, at det hurtige antidepressive middel virker13, så kun det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 administreres via intraperitoneal injektion til mus (figur 2B). Det venstre panel i fig. 2B repræsenterer en anden teknisk kontrol for DetectSyn-analysen. Hippocampalt væv fra en saltvandsbehandlet mus blev undersøgt med begge primærvalg for PSD95 og Synapsin1, men en af de sekundære blev udeladt. En stigning i synapsdannelsen på grund af behandling med det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 sammenlignet med saltvandsbehandlede mus er påvist i de midterste og højre paneler i figur 2B.
Repræsentative billeder til teknisk kontrol in vitro og ex vivo vises. I figur 2A udelades et af primærerne for de synaptiske par (dvs. PSD95), og i figur 2B udelades en af sekundærerne. Mens nogle puncta vises i de tekniske kontrolbilleder, er de generelt ikke af samme størrelse, som det fremgår af den hvide plet i toppanelet i figur 2A sammenlignet med den store puncta i de andre paneler. Desuden er disse puncta ikke på samme sted som den kvantificerede puncta, som det fremgår af nogle punkter, der forekommer inden for soma af den tekniske kontrol i figur 2B. Typisk forekommer ikke-specifik puncta i kernerne, måske på grund af tilstedeværelsen af DNA.
For at analysere de repræsentative resultater i figur 2A blev dendritter (visualiseret ved MAP2-farvning og repræsenteret her i en grå kontur) sporet ved hjælp af et frihåndstegningsværktøj til at skabe interesseområder (ROI'er). For det første blev arealet af MAP2 ROI'erne opnået ved hjælp af NIS Elements-funktionen, ROI-data under fanen Automatiserede måleresultater . Dernæst blev puncta detekteret ved hjælp af Thresholding-funktionen i NIS-elementer. Denne funktion opretter en binær maske af objekter, der falder inden for en defineret intensitetstærskel. Derefter blev antallet af binære objekter i MAP2 ROI'erne registreret ved hjælp af NIS Elements-funktionen, Binær i ROI, under fanen Automatiserede måleresultater . De data, der præsenteres i grafen til højre for figur 2A , er de normaliserede værdier af puncta divideret med ROI-området.
For at analysere de repræsentative resultater i figur 2B blev lagstrålingen af CA1 sporet ved hjælp af et frihåndstegningsværktøj til at skabe et investeringsafkast. For det første blev området for ROI opnået ved hjælp af ROI-datafunktionen som beskrevet i ovenstående afsnit. Dernæst blev puncta detekteret ved hjælp af funktionen Spot Detection - Bright Spots , der er placeret under menuen Binær . Dernæst blev diameter- og kontrastværdierne valgt ud fra visuel inspektion af flere skiver fra alle behandlinger. Når disse værdier var besluttet, blev de anvendt ensartet på tværs af alle analyserede billeder. Funktionen Spotdetektion opretter binære masker af objekter inden for de definerede diameter- og kontrastparametre, der er indstillet. Derefter blev antallet af binære objekter i MAP2 ROI'erne registreret ved hjælp af NIS Elements-funktionen, Binær i ROI, under fanen Automatiserede måleresultater . De data, der præsenteres i grafen til højre for figur 2B , er de normaliserede værdier af puncta divideret med ROI-området.
Figur 2: Påvisning af synapser ved hjælp af DetectSyn-assay. Hvid puncta repræsenterer synapser påvist med DetectSyn PSD95-Synapsin1 nærhedsligationsassay (gule pilespidser) i (A) in vitro-dyrkede primære hippocampale neuroner og (B) ex vivo CA1 stratum radiatum. I (A) repræsenterer den grå kontur MAP2-farvning. I (A) repræsenterer toppanelet mærket PLA-kontrol prøver, der kun behandles med køretøj, som kontrolelementet. PSD95 primær var imidlertid ikke inkluderet i reaktionen. I de sidste to paneler blev neuroner behandlet med det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) eller Ro plus GABAB-agonistbaclofen (Bac, 50 μM) i 90 minutter. Det øgede antal puncta (identificeret med gule pilespidser) indikerer, at synapsdannelsen in vitro kun øges, når det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981 administreres med GABAB-agonisten. I (B) repræsenterer grøn dendritter farvet med MAP2, og blå repræsenterer kerner farvet med DAPI. Enkelte dendritter, skitseret i gule rektangler i de fusionerede billeder, er isoleret under repræsentative billeder for at demonstrere, at puncta lokaliserer til dendritter. Dyrene blev behandlet med Ro-25-6981 (10 mg/kg), og væv blev opsamlet 45 minutter efter behandlingen. Det øgede antal puncta (identificeret ved gule pilespidser) indikerer, at antallet af synapser in vivo stiger med basal GABA-signalering og det hurtige antidepressive middel Ro-25-6981. Kvantificering af repræsentative resultater er repræsenteret af søjlediagrammerne og angiver det gennemsnitlige antal DetectSyn puncta divideret med MAP2-området. Resultaterne normaliseres til den eksperimentelle kontrol. Billeder blev opnået ved hjælp af et Nikon A1plus konfokalmikroskop. Skalastænger = (A) 10 μm; (B, øverst) 50 μm; (B, nederst) 5 μm. Søjler repræsenterer middelværdien +/- standardfejl i middelværdien. Resultater analyseret af envejs ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 ved post-hoc analyse. Figuren er modificeret fra Heaney et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DetectSyn er et hurtigt assay, der bruger et nærhedsligeringsassay til at detektere proteiner inden for 40 nm fra hinanden, hvilket muliggør påvisning af synapsdannelse. Denne teknik forbedrer de nuværende fluorescerende assays, som kun tjener som proxymålinger til synapsdannelse. DetectSyn registrerer kvantificerbare ændringer i synaptiske proteiner lokaliseret inden for 40 nm, dvs. inden for den synaptiske kløft, af hinanden. Desuden er DetectSyn mere omkostningseffektiv og tager mindre tid end teknikker, som elektronmikroskopi og arraytomografi, designet til at måle synapser og klassisk betegnet som guldstandardteknikker.
DetectSyn er en meget tilpasselig teknik. Ethvert synaptisk par kan bruges til at identificere dannelsen af specifikke typer synapser, så længe proteinparret befinder sig inden for 40 nm fra hinanden. Mens denne spændende teknik har mange anvendelser, skal man passe på at validere antistoffer, herunder optimal blokering og primære inkubationsbetingelser, og fortsætte med at understøtte deres resultater ved hjælp af andre metoder som immunofluorescens. Det foreslås at udføre disse understøttende eksperimenter i separate eksperimenter, der ikke bruger DetectSyn til at mindske antistofbindingskonkurrencen (f.eks. Brug af gede-anti-PSD95 og mus anti-PSD95 i samme eksperiment kan reducere bindingen på grund af konkurrence). Derudover skal du passe på at vælge primære antistoffer opdrættet i forskellige værter - for eksempel ged anti-PSD95 og kanin anti-Synapsin1. Hvis den samme vært bruges til begge primærvalg, vil de sekundære sonder ikke diskriminere mellem de to primærvalg.
Yderligere, fordi nærhedsligation har et forstærkningstrin, er der begrænset information, man kan trække fra den resulterende puncta. For eksempel observeres puncta af forskellig størrelse (tydelig i figur 2B), hvilket tyder på en ændring i synapsstørrelse eller flere synapser rekrutteret til det samme område. Men selvom hver prøve inden for et eksperiment gennemgår de samme betingelser, gør forstærkningstrinnet det vanskeligt at drage disse konklusioner kategorisk.
Endelig inkluderer kritiske trin for denne protokol at sikre, at ligasen og polymerasen forbliver på en isblok og tilsættes så hurtigt som muligt til prøver. Derudover vil herunder tekniske kontroller hjælpe med at identificere, hvor ikke-specifik puncta kan forekomme i et givet eksperiment. For eksempel, som det ses i figur 2B, ses punktering inden for kerner i tekniske kontroller. Det er derfor afgørende at medtage negative eller tekniske kontroller for at sikre, at signalet, der detekteres i eksperimentelle prøver, er større end det, der ses i disse kontroller. Disse tekniske kontroller opnås typisk ved at udelade et af de primære eller sekundære par. Endelig skal du sikre dig, at inkubationstemperaturerne er på 37 °C fra og med det sekundære trin.
Det er vigtigt, at DetectSyn giver en tilgængelig måde for næsten ethvert laboratorium med adgang til et standard fluorescerende mikroskop, uanset teknisk erfaring, at studere synaptopatologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) og NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) og et tilskud fra FRAXA Research (CFH) og Alzheimers Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
