Summary
DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.
Abstract
시냅스는 뉴런 사이의 통신 부위입니다. 신경 회로 강도는 시냅스 밀도와 관련이 있으며, 시냅스의 분해는 주요 우울 장애 (MDD) 및 알츠하이머 병과 같은 질병 상태의 특징입니다. 시냅스 수를 조사하기 위한 전통적인 기술에는 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP))의 유전적 발현, 뉴런을 채우는 염료(예를 들어, 카르보시아닌 염료, DiI), 및 척추 마커의 면역형광 검출(예를 들어, 시냅스 후 밀도 95(PSD95))이 포함된다. 이러한 프록시 기술에 대한 주요 경고는 시냅스 후 변경 사항 만 식별한다는 것입니다. 그러나 시냅스는 시냅스 전 말단과 시냅스 후 척추 사이의 연결입니다. 시냅스 형성/제거를 측정하기 위한 황금 표준은 시간이 많이 소요되는 전자 현미경 또는 어레이 단층 촬영 기술이 필요합니다. 이러한 기술에는 전문 교육과 값 비싼 장비가 필요합니다. 또한, 제한된 수의 뉴런 만 평가할 수 있으며 전체 뇌 영역의 변화를 나타내는 데 사용됩니다. DetectSyn은 질병 상태 또는 약물 활동으로 인한 시냅스 형성 또는 제거의 변화를 식별하는 신속한 형광 기술입니다. DetectSyn은 신속한 근접 결찰 분석을 사용하여 병치된 시냅스 전후 단백질과 표준 형광 현미경을 검출하며, 이는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 기술입니다. 결과 누자의 형광 검출은 실험의 신속하고 편향되지 않은 분석을 가능하게합니다. DetectSyn은 제한된 수의 형광 뉴런보다 더 큰 영역을 분석 할 수 있기 때문에 전자 현미경보다 더 대표적인 결과를 제공합니다. 또한, DetectSyn은 시험관 내에서 배양된 뉴런 및 고정 조직 조각에 대해 작동합니다. 마지막으로, 이 기술로부터 수집된 데이터를 분석하는 방법이 제공된다. 전반적으로 DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸쳐 시냅스 밀도의 상대적 변화를 감지하는 절차를 제공하며 기존 기술보다 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.
Introduction
시냅스는 뉴런 1 사이의 통신의 기본 단위입니다. 동일한 영역 내의 뉴런 사이의 많은 시냅스는 행동2를 매개하는 회로를 발생시킵니다. 시냅스는 다른 뉴런의 시냅스 후 수용체에 정보를 전달하는 신경 전달 물질 또는 신경 펩티드를 방출하는 하나의 뉴런에서 시냅스 전 말단으로 구성됩니다. 시냅스 전 신호의 합산은 시냅스 후 뉴런이 행동 잠재력을 발사하고 메시지를 다른 뉴런으로 전파할지 여부를 결정합니다.
시냅스의 분해 인 Synaptopathology는 알츠하이머 병 및 주요 우울 장애와 같은 신경 부피 감소로 인한 질병 및 장애에서 발생하며 더 이상 3,4,5를 최적으로 수행하지 않는 회로를 초래합니다. 시냅스 밀도를 복원하는 것은 이러한 장애에 대한 잠재적 인 치료법의 효능의 기초가 될 가능성이 큽니다. 예를 들어, 시냅스의 증가가 빠른 항우울제6의 행동 효능의 기초가 된다는 것이 최근에 입증되었다. 가능한 시냅스 병리학 치료를 신속하게 스크리닝하기 위해 연구자들은 시냅스 수의 변화를 신속하게 식별하는 기술이 필요합니다.
현재의 방법론은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들거나 (전자 현미경, 배열 단층 촬영), 시냅스 전 결합 (척추 분석, 면역 형광 / 공국소화)을 통합하지 않고 시냅스 후 변화 만 검사합니다. DiI와 같은 염료 또는 GFP와 같은 형광 단백질은 뉴런을 시각화하고 시냅스 후 척추를 특성화하는 데 도움이됩니다. 그러나 척추 분석은 연구자가 정의한 비율을 사용하여 형태학을 결정하며, 이는 재현성을 감소시킬 수 있습니다7. 또한, 상이한 척추 클래스가 기능적 시냅스와 어떻게 관련되는지는 여전히 밝혀지고 있다8. 척추 형성은 일시적일 수 있고 시냅스 후 가소성을 반영할 수 있지만, 이러한 척추는 시냅스 전 뉴런(9)을 갖는 시냅스로 안정화되기 전에 제거될 수 있다.
공국소화는 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 대한 면역염색을 할 수 있기 때문에 척추 분석보다 시냅스에 대한 더 나은 프록시를 제공합니다. 그러나, 시냅스 단백질은 단백질이 병치되어 있고 일관되게 겹치지 않을 수 있기 때문에 낮은 공동국소화 값을 산출할 수 있다. 따라서, 단백질이 완전히 중첩되지 않기 때문에, 공동국재화 기술은 이러한 누락된 정보로 인한 시냅스 형성의 변화를 정확하게 측정하지 못할 수 있다. 마지막으로, 전자 현미경 (EM)과 어레이 단층 촬영 모두 시냅스의 고해상도 이미지를 제공하지만 시간이 많이 걸립니다. EM은 또한 전문 장비를 필요로하며, 연구원은 주어진 실험을 위해 소량의 조직으로 제한됩니다. 배열 단층 촬영은 초박형 절편에서 많은 단백질을 선별 할 수있는 기능을 우아하게 제공하고 EM10과 결합 할 수 있지만,이 기술은 너무 노동 집약적이며 시냅스 형성의 변화를 신속하게 스캔해야하는 실험 범위를 벗어날 수 있습니다.
DetectSyn은 Duolink 근접 결찰 분석의 특정 응용 프로그램입니다. PLA 분석은 단백질-단백질 상호작용의 일반적인 검출을 허용한다. DetectSyn 브릿지는 서로 40 nm 내에서 태그가 지정된 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 의해 방출되는 형광 신호를 증폭하여 시냅스 후 측정을 브릿지합니다. 시냅스 단백질이 시냅스 구개열 내에서와 같이 40nm 이내에있는 경우, DNA 프로브를 포함하는 보조 항체는 원형 DNA로 혼성화됩니다. 이 혼성화된 원형 DNA는 형광 프로브를 발현하고, 이 프로브는 표준 형광 현미경 기술로 증폭 및 검출된다( 그림 1 참조). 결정적으로, EM 및 어레이 단층 촬영과는 달리,이 기술은 전문 장비를 필요로하지 않으며 표준 면역 조직 화학과 거의 동일한 시간이 걸립니다. 따라서이 기술의 접근성은 연구 집약적 인 기관 외부의 조사관이 시냅토 병리학 연구에 참여할 수있게합니다. 또한,이 기술은 단일 실험 내에서 여러 뇌 영역에서 시냅스 밀도의 변화를 조사 할 수 있으며, 질병 또는 치료로 인한 시냅스 변화의보다 전체적인 표현을 제공합니다.
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Protocol
동물로부터 세포 및 조직을 분리하는 것은 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드에 따라 이루어졌으며 웨이크 포레스트 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 이 프로토콜은 특정 실험 패러다임 및 요구 사항에 따라 이미 처리되고 고정된 샘플에 사용됩니다. 시연 목적을 위해, 신속한 항우울제 처리로 인한 시냅스 형성이 시냅스 검출 기술6을 강조하기 위해 사용된다. 이전에 커버슬립 상에서 배양되고, 처리되고, 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정되고, 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 저장된 뉴런은 시험관내 절차를 강조하기 위해 사용될 것이다. 이전에 처리된 마우스로부터 해마 조직(25 μm 두께)을 슬라이스하고, 얼음처럼 차가운 PBS 및 4% PFA로 경심 관류시킨 다음, 동결보호제에 저장하여 슬라이스 절차를 강조하는데 사용될 것이다. 뉴런을 배양하거나 설치류를 심폐 관류하는 방법에 대한 자세한 내용은 11,12를 참조하십시오. 이 절차의 그래픽 표현은 그림 1을 참조하십시오.
그림 1: DetectSyn 분석의 그래픽 표현. 세포막을 투과시킨 후, Synapsin1 및 PSD95에 대한 1차 항체는 이들 시냅스 단백질에 결합한다. 올리고뉴클레오티드 태그를 갖는 보조는 이어서 일차 항체에 결합한다. Synapsin1 및 PSD95가 시냅스에서와 같이 40nm 내에 있으면 올리고뉴클레오티드가 상호 작용하고 형광 태그가 증폭됩니다. 이 형광 신호는 표준 현미경을 통해 이미징되고 분석 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 샘플 헹굼
- 샘플을 500 μL의 1x PBS + 0.75% 글리신으로 5분 동안 3회 헹구고 오비탈 진탕기 상에서 완만하게 교반하여 잔류 PFA 또는 동결보호제를 제거하였다.
2. 샘플을 차단하고 투과시킵니다.
- 블로킹 및 투과화 용액(10% 정상 당나귀 혈청, 0.25% 트윈 20)을 1x PBS로 준비한다. 차단, 일차 및 이차 배양에 사용하기에 충분히 준비하십시오.
- 24 웰 플레이트에서 샘플 (예를 들어, 커버 슬립 또는 자유 부유 슬라이스)에 500 μL의 블로킹 및 투과 용액을 첨가하십시오. 각 웰에 서로 다른 샘플이 포함되어 있고 샘플이 전환되지 않도록 적절하게 라벨이 지정되어 있는지 확인하십시오.
- 샘플을 배양된 세포에 대해 60분 동안 또는 슬라이스된 조직에 대해 2시간 동안 실온(RT)에서 인큐베이션한다. 부드러운 교반을 위해 궤도 쉐이커를 사용하십시오.
3. 일차 항체에서 샘플을 인큐베이션한다.
- 차단 완충액에 일차 항체를 준비하십시오 :
- 시냅스 후 밀도 95 (PSD95; 1:500, 토끼 폴리클로날), 시냅신1 (1:500, 마우스 모노클로날), MAP2 (1:400, 닭 폴리클로날) 준비
- 시냅스 쌍 중 하나를 생략하는 음성 대조군 분취량을 준비하십시오 (예 : PSD95 없음)
- 조심스럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 블로킹 용액을 제거하십시오. 세포를 방해하거나 조직을 찢지 않고 가능한 한 많이 제거하십시오.
- 배양된 세포의 경우:
- 파라 필름으로 큰 플라스틱 페트리 접시를 줄 지어 라. 포셉을 사용하여 커버 슬립을 파라 필름으로 조심스럽게 옮깁니다.
- 조심스럽게 60 μL의 일차 항체 용액을 커버슬립의 상부에 첨가한다. 커버슬립의 측면 위로 일차 항체 용액을 흘리지 않도록 하십시오.
- 습도를 제공하고 잠복기 동안 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 작은 페트리 접시에 초순수를 넣고 커버 슬립 주위에 작은 페트리 접시를 조심스럽게 배치하십시오.
- 큰 페트리 접시를 덮고 배양된 세포를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 얇게 썬 조직의 경우:
- 250 μL의 일차 항체 용액을 24 웰 플레이트의 자유 부유 슬라이스에 조심스럽게 첨가한다.
- 플레이트를 덮고 조직을 오비탈 진탕기 상에서 완만한 교반으로 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
4. 샘플을 세척한 다음, 이차 항체에서 배양한다.
- 차단 완충액에 이차 항체를 준비하십시오 :
- 당나귀 안티 마우스 (1:5), 당나귀 안티 토끼 (1:5), 당나귀 안티 치킨 (1:400)을 준비하십시오.
- 이 단계에서, 추가적인 기술적 제어는 항-마우스 또는 항토끼 보조물 중 어느 하나를 생략하는 이차 분취량을 제조함으로써 수득될 수 있다.
- 배양된 세포의 경우:
- 포셉을 사용하여 커버 슬립에서 종이 타월에 기본 솔루션을 조심스럽게 두드리십시오.
- 포셉을 사용하여 커버슬립을 500μL의 1x PBS로 채워진 원래의 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
- 얇게 썬 조직의 경우:
- 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 일차 항체 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 조직을 찢지 않고 가능한 한 많이 제거하십시오.
- 500 μL의 1x PBS 추가
- 샘플을 1x PBS로 3회 10분 동안 오비탈 진탕기 상에서 완만한 교반으로 세척한다. 이 시간 동안 모든 세척 버퍼를 RT로 가져옵니다.
- 이 시간 동안 큰 페트리 접시의 파라 필름을 변경하십시오.
- 배양된 세포의 경우:
- 포셉을 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 파라 필름 처리 된 대형 페트리 접시로 다시 옮깁니다.
- 조심스럽게 40 μL의 이차 항체 용액을 커버슬립의 상부에 첨가한다. 보조 항체 용액을 커버슬립의 측면 위로 흘리지 않도록 하십시오.
- 필요한 경우 더 작은 페트리 접시에 초순수 물을 넣고 커버 슬립 주위에 작은 페트리 접시를 조심스럽게 배치하십시오.
- 큰 페트리 접시를 덮으십시오.
- 얇게 썬 조직의 경우:
- 조심스럽게 250 μL의 이차 항체 용액을 24 웰 플레이트의 자유 부유 슬라이스에 첨가한다.
- 플레이트 덮기
참고 : 여기서부터는 플레이트의 상단을 호일로 감싸서 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
- 샘플을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
5. 결찰
- 결찰 스톡을 분자 등급 물에 1:5로 혼합하십시오.
- 섹션 4에서와 같이, 커버슬립을 조심스럽게 옮기고 슬라이스된 조직에서 보조 믹스를 제거하십시오.
- 샘플을 500 μL의 세척 완충액 A로 세척한다.
- 배양된 세포의 경우, 5분 동안 2회 세척한다. 얇게 썬 조직의 경우 10 분 동안 2 번 씻으십시오. 두 가지 모두에 대해 궤도 쉐이커에 부드러운 교반을 사용하십시오.
- 이 시간 동안 큰 페트리 접시의 파라 필름을 변경하십시오.
- 리가아제를 콜드 블록에 보관하면서 5.1단계에서 라이게이션 스톡에서 리가아제를 1:40으로 희석한다. 리가아제를 샘플에 첨가하기 직전에 이 희석을 수행하십시오.
- 섹션 4에서와 같이, 리가아제를 첨가하기 전에 샘플로부터 세척 완충액 A를 가능한 한 많이 제거한다.
- 배양된 세포의 경우: 커버슬립을 파라필름 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 40μL의 결찰 믹스를 커버슬립에 넣고, 커버슬립 주위에 작은 물로 채워진 페트리 접시를 배치하고, 큰 페트리 접시를 덮는다.
- 슬라이스된 조직의 경우: 단계 5.4의 라이게이션 믹스 250μL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 덮는다.
- 샘플을 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
6. 증폭
- 증폭 스톡을 분자 등급 물에 1:5로 혼합한다.
- 섹션 4에서와 같이, 커버슬립을 조심스럽게 옮기고 슬라이스된 조직에서 결찰 믹스를 제거하십시오.
- 500 μL의 세척 완충액 A에서 샘플을 세척하십시오.
- 배양된 세포의 경우, 2분 동안 2회 세척한다. 얇게 썬 조직의 경우 10 분 동안 2 번 씻으십시오. 두 가지 모두에 대해 궤도 쉐이커에 부드러운 교반을 사용하십시오.
- 이 시간 동안 큰 페트리 접시의 파라 필름을 변경하십시오.
- 중합효소를 샘플에 첨가하기 직전에 이 희석을 수행하십시오. 중합 효소를 차가운 블록에 유지하면서 묽은 중합 효소
- 배양된 세포의 경우, 단계 6.1로부터 증폭 스톡에 중합효소를 1:80으로 희석한다.
- 슬라이스된 조직의 경우, 단계 6.1로부터 증폭 스톡에 중합효소를 1:40으로 희석한다.
- 단계 4에서와 같이, 중합효소를 첨가하기 전에 샘플로부터 세척 완충액 A를 가능한 한 많이 제거한다.
- 배양된 세포의 경우: 커버슬립을 파라필름 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 단계 6.4.1의 증폭 믹스 40μL를 커버슬립에 첨가하고, 커버슬립 주위에 작은 물이 채워진 페트리 접시를 배치하고, 큰 페트리 접시를 덮는다. 샘플을 37°C에서 100분 동안 인큐베이션한다.
- 슬라이스된 조직의 경우: 단계 6.4.2의 증폭 믹스 250 μL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 덮는다. 샘플을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 시간 동안 슬라이드를 준비하고 레이블을 지정합니다.
7. 장착
- 단계 4에서와 같이, 커버슬립을 조심스럽게 옮기고 얇게 썰어진 조직으로부터 증폭 믹스를 제거한다.
- 샘플을 500 μL의 세척 완충액 B에서 10분 동안 2회 오비탈 진탕기 상에서 온화한 교반으로 세척한다.
- 샘플을 500 μL의 1% 세척 완충액 B로 1분 동안 오비탈 진탕기 상에서 부드럽게 교반하면서 세척한다.
- 배양된 세포의 경우:
- 3μL의 장착 미디어를 슬라이드에 떨어뜨립니다.
- 커버슬립에서 과도한 세척 버퍼를 탭한 다음 커버슬립(셀이 아래쪽을 향하고 있음)을 장착 매체에 넣습니다. 덮개 슬립을 제자리에 밀봉하기 위해 소량의 투명한 매니큐어로 측면을 밀봉하십시오.
- 얇게 썬 조직의 경우:
- 조심스럽게 조직 조각을 준비된 슬라이드로 옮기고 배열하여 조각이 평평하게 놓이도록하십시오. 5-10 μL의 장착 매체 (양은 슬라이스의 크기에 따라 달라질 수 있음)를 조직 슬라이스 상에 떨어 뜨립니다.
- 유리 커버슬립을 티슈 슬라이스 위에 조심스럽게 놓고 가장자리를 따라 소량의 투명한 매니큐어로 밀봉하여 커버슬립을 제자리에 밀봉합니다.
- 현미경으로 분석하기 전에 적어도 15분 정도 기다리거나 -20°C에서 보관하십시오.
8. 공초점 현미경으로 디지털 이미지 얻기
- 모든 처리의 샘플에서 수집 설정(예: 레이저 전력, 이득, 오프셋)을 최적화합니다. 최적화에 배경 잡음을 줄이고 형광 신호의 강도를 과포화시키지 않고 신호를 향상시키는 것이 포함되는지 확인하십시오. 설정이 결정되면 획득한 모든 이미지에 동일한 획득 설정을 적용합니다.
참고: 다음 획득 세부 정보는 Nikon A1 공초점 현미경 및 Nikon NIS AR Elements 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다. - 스테이지에서 샘플이 있는 슬라이드를 설정하고 아이피스를 통해 DAPI를 사용하여 샘플의 초점 평면을 찾습니다.
- Eye 포트를 클릭하여 아이 포트를 끄고 광학 구성 버튼을 선택하여 설정을 조정합니다.
- 각 형광 채널의 게인, 오프셋 및 레이저 전력을 조정하여 배경 잡음을 줄이고 형광 신호를 향상시킵니다. 8.5-8.6단계에서 언급한 대로 형광 신호가 과포화되지 않는지 확인하십시오.
- 형광 신호에 대해 의사 색상을 사용하여 과포화를 모니터링합니다. 라이브 이미지 하단에서 현재 사용 중인 형광 채널로 레이블이 지정된 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.
- 그런 다음 채널 채색을 선택하고 레인보우 다크 와 같은 의사 색상을 선택하여 형광 강도를 히트 맵과 같은 의사 색상으로 시각화합니다. 레인보우 다크에서 더 차가운 색상은 형광 강도가 적고 더 뜨거운 색상은 더 많은 형광 강도를 나타냅니다.
- 모든 형광 채널이 최적화되면 이전에 선택한 광학 구성 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이 버튼에 대해 현재 카메라 설정 할당 을 선택합니다.
- 선택한 설정이 각 치료 그룹의 무작위 샘플에 충분한지 확인합니다. 선택한 설정이 이러한 샘플 중 하나를 과포화시키는 경우 8.4단계를 반복하여 과포화를 제거합니다.
- 배양된 뉴런의 경우 8.10-8.16단계를 따르십시오.
- 눈 포트를 사용하여 다른 수상 돌기와 최소한의 겹침이있는 수상 돌기가있는 뉴런을 검색하십시오.
- 눈 포트를 끄고 DAPI 채널을 사용하여 선택한 뉴런의 세포체를 시각화합니다. 소마의 중심을 두 번 클릭하여 시야의 중앙에 뉴런을 중앙에 맞춥니다.
- MAP2 채널을 사용하여 라이브 스캔을 통해 MAP2 신호에 가장 적합한 초점 평면을 찾습니다.
- ND 획득 탭에서 파일에 저장을 클릭하고 찾아보기 아래에서 이미지를 저장할 파일을 선택합니다. 그런 다음 파일 이름을 입력하십시오.
- Z 탭에서 대칭 모드 범위로 정의 옵션을 선택합니다. 포커스를 최상의 MAP2 평면으로 설정하고 상대 버튼을 클릭하여 이 초점 평면을 Z-스택의 중간으로 설정합니다.
- 1μm 스텝으로 범위를 5μm로 설정하고 Z 이동 중에 액티브 셔터 닫기를 확인하십시오. 파장 탭에서 Optical Conf에서 이전에 구성된 수집 설정이 있는 광학 버튼의 이름을 선택합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하십시오.
- 커버슬립/트리트먼트당 약 10개의 뉴런에 대해 8.1.10-8.1.15단계를 반복한다.
- 슬라이스된 조직의 경우 8.18-8.22단계를 수행합니다.
- 아이 포트를 사용하여 관심 영역을 검색합니다. 예를 들어, 해마의 CA1을 찾습니다.
- 아이 포트를 끄고 MAP2 채널을 사용하여 라이브 스캔을 통해 MAP2 신호에 가장 적합한 초점 평면을 찾습니다.
- 가져오기 메뉴에서 큰 이미지 스캔을 선택합니다. 그런 다음 열리는 패널에서 캡처(Capture) 패널 아래에서 이전에 구성된 획득 설정이 있는 광학 버튼의 이름을 선택합니다. 또한 이 패널에서 올바른 목표를 선택해야 합니다.
- [영역] 패널과 아이피스 아래에서 화살표 키를 사용하여 관심 영역의 경계를 설정합니다. 그런 다음 큰 이미지를 파일에 저장을 클릭하고 이미지의 저장 경로 파일 이름을 만듭니다.
- [설정] 패널에서 [다중 채널 캡처]가 선택되어 있는지 확인한 다음 Optical Conf에서 이전에 구성된 수집 설정을 사용하여 광학 단추의 이름을 선택합니다.
참고: 큰 이미지에 대한 z-스택은 가능하지만 스캔 시간은 늘어납니다.
9. 분석
- 획득 설정과 마찬가지로 모든 트리트먼트의 샘플을 사용하여 임계값 설정을 최적화합니다. 임계값 최적화가 형광 신호의 강도를 과포화시키지 않고 배경 잡음을 줄이고 신호를 향상시키는 데 초점을 맞추는지 확인하십시오. 이러한 설정이 결정되면 9.2-9.3단계에 설명된 대로 분석에 사용되는 모든 이미지에 동일한 임계값 설정을 적용합니다.
- ImageJ에서 임계값 옵션은 이미지 > 임계값 조정 메뉴 아래에 >습니다. 이미지에 어두운 배경이 있는 경우 어두운 배경 옵션을 선택합니다.
- 그런 다음 이전에 결정된 최적화된 임계값 설정당 임계값의 상한과 하한을 조정한 다음 적용을 클릭합니다.
- 배양된 세포의 경우 MAP2 채널과 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 수상 돌기 및 소마를 포함한 각 뉴런에 대한 ROI를 그립니다. 슬라이스된 조직의 경우, 관심 영역(예를 들어, 해마 내의 CA1의 지층 반경)을 캡슐화하는 슬라이스 이미지 내에 자유형 ROI를 그립니다.
- ROI의 영역을 확보하십시오. ImageJ에서 분석 > 측정 메뉴 아래의 영역을 측정합니다.
- 9.7-9.9단계에 따라 ImageJ의 입자 분석과 같은 자동 감지 도구를 사용하여 각 ROI 내에서 누점 수를 감지합니다.
- 입자 분석 메뉴 아래에서 입자 분석 옵션> 찾습니다. 먼저, 누점 크기 직경, 전형적으로 0.1-3 μm2를 정의한다.
- 그런 다음 표시 드롭다운 메뉴에서 마스크 오버레이 옵션을 선택하고 결과 표시 옵션을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오.
- 선택한 직경 범위에서 누점이 감지되지 않으면 이 분석으로 모든 누점이 감지될 때까지 범위를 조정하십시오. 모든 이미지에 대해 동일한 파티클 분석 설정을 사용해야 합니다.
- 9.11-9.13단계에 따라 누점 수를 관심 대상 개별 영역의 영역으로 나눕니다.
- ImageJ의 결과 팝업에서 각 이미지의 결과를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- 먼저 데이터를 가져온 파일과 샘플을 확인합니다. 그런 다음 ROI의 영역을 누점 수로 나눕니다.
- 그런 다음 결과 팝업에서 데이터를 지우고 9.2-9.12단계를 반복합니다.
- 대조군 샘플에 대한 결과 정규화: 대조군 샘플에 대한 결과(누점/ROI 영역 수)를 평균화합니다. 그런 다음 모든 샘플의 얻은 결과를 대조군의 평균으로 나누어 정규화 된 결과를 얻습니다. 대조군 샘플의 새로운 평균은 1과 같아야 한다.
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Representative Results
Heaney et al.6에서 수정 된 데이터는 증가 된 시냅스 형성이 예상되는 실험을 입증하기 위해 제시됩니다 (메커니즘에 대한 자세한 정보와 심층적 인 논의는 6 참조). 이전에, 신속한 항우울제가 효과적인 대사성 수용체인 GABAB(감마아미노부티르산 서브타입 B)의 활성화를 필요로 한다는 것이 입증되었다(13). 또한, 이전의 데이터는 신속한 항우울제가 시냅스 후 마커14를 증가시킨다는 것을 나타냈다; 따라서 DetectSyn은 신속한 항우울제가 시냅스 수를 증가시켜 효과적이라는 가설을 테스트하는 데 사용되었습니다.
배양된 뉴런에서, 네 가지 조건이 시험된다. 먼저, 도 2A의 상단 패널에서, 배양된 뉴런은 실험 대조군과 동일한 조건하에서 비히클로 처리되었다. 그러나, PSD95 일차 항체는 DetectSyn 분석법에 대한 기술적 대조군을 제공하기 위해 생략된다 (각 성분이 신호에 어떻게 기여하는지에 대해서는 도 1 참조). 다음으로, 제어판에서 뉴런은 다시 비히클로 치료되지만 PSD95 및 Synapsin1 프라이머리를 모두 받습니다. 다음으로, 배양된 뉴런은 신속항우울제 Ro-25-6981(Ro) 또는 Ro 플러스 GABAB 작용제인 바클로펜(Bac)만을 처리한다. 앞서 도13에 입증된 바와 같이, 신속한 항우울제 Ro-25-6981 및 GABAB 작용제 바클로펜 둘 모두는 Ro-25-6981의 시험관내 효능을 위해 요구된다. 따라서, 시냅스 형성의 증가는 백색 천자의 증가에 의해 입증된다 (도 2A). 바클로펜이 없으면 시험관 내에서 시냅스 형성의 증가가 보이지 않습니다.
생체내에서, 기저 GABA 수준은 신속한 항우울제(13)가 작동하기에 충분하므로, 신속한 항우울제 Ro-25-6981만이 마우스에 복강내 주사를 통해 투여된다(도 2B). 도 2B의 왼쪽 패널은 DetectSyn 분석에 대한 또 다른 기술적 대조군을 나타낸다. 식염수-처리된 마우스로부터의 해마 조직은 PSD95 및 Synapsin1에 대한 원발성 둘 다로 프로브되었지만, 이차 중 하나는 생략되었다. 식염수 처리된 마우스에 비해 신속한 항우울제 Ro-25-6981을 사용한 처리로 인한 시냅스 형성의 증가는 도 2B의 중간 및 오른쪽 패널에서 입증된다.
시험관내 및 생체외에서의 기술적 제어를 위한 대표적인 이미지가 도시된다. 도 2A에서, 시냅스 쌍에 대한 원색 중 하나는 생략되고(즉, PSD95), 도 2B에서, 이차 중 하나는 생략된다. 일부 누점은 기술 제어 이미지에 나타나지만, 다른 패널의 큰 누점과 비교하여 그림 2A의 상단 패널에서 흰색 얼룩에 의해 입증 된 것처럼 일반적으로 동일한 크기는 아닙니다. 또한, 이들 펑타는 도 2B의 기술 제어의 소마 내에 나타나는 일부 펑타에 의해 입증된 바와 같이 정량화된 펑타와 동일한 위치에 있지 않다. 전형적으로, 비특이적 펑타는 핵 내에서 발생하며, 아마도 DNA의 존재로 인해 발생합니다.
도 2A의 대표적인 결과를 분석하기 위해, 수상 돌기(MAP2 염색에 의해 시각화되고 여기에서 회색 윤곽선으로 표시됨)를 자유형 드로잉 도구를 사용하여 관심 영역(ROIs)을 생성하였다. 먼저, MAP2 ROI의 면적은 자동화된 측정 결과 탭 아래의 NIS Elements 기능, ROI 데이터를 사용하여 구하였다. 다음으로, NIS 엘리먼트에서 임계화 함수를 사용하여 누점을 검출하였다. 이 함수는 정의된 강도 임계값 내에 속하는 개체의 이진 마스크를 만듭니다. 그런 다음 MAP2 ROI 내의 이진 개체 수를 자동 측정 결과 탭 아래의 NIS 요소 함수인 ROI의 이진을 사용하여 감지했습니다. 도 2A의 오른쪽에 있는 그래프에 제시된 데이터는 ROI의 영역으로 나눈 누점의 정규화된 값들이다.
도 2B의 대표적인 결과를 분석하기 위해, CA1의 지층 반경을 자유형 드로잉 도구를 사용하여 ROI를 생성하여 추적하였다. 먼저, ROI의 영역은 위의 단락에서 설명한 바와 같이 ROI 데이터 기능을 사용하여 구하였다. 다음으로, 누점은 이진 메뉴 아래에 있는 스팟 감지 - 밝은 스팟 기능을 사용하여 검출되었습니다. 다음으로, 직경 및 명암비는 모든 처리로부터 다수의 슬라이스의 육안 검사에 기초하여 선택되었다. 이러한 값이 결정되면 분석된 모든 이미지에 균일하게 적용되었습니다. 스폿 감지 함수는 정의된 지름 및 대비 매개변수 세트 내에서 오브젝트의 이진 마스크를 생성합니다. 그런 다음 MAP2 ROI 내의 이진 개체 수를 자동 측정 결과 탭 아래의 NIS 요소 함수인 ROI의 이진을 사용하여 감지했습니다. 도 2B의 오른쪽에 있는 그래프에 제시된 데이터는 누점의 정규화된 값을 ROI의 영역으로 나눈 값들이다.
그림 2: DetectSyn 분석을 사용한 시냅스 검출. 백색 천자는 (A) 시험관내 배양된 1차 해마 뉴런 및 (B) 생체외 CA1 지층 반경에서 DetectSyn PSD95-Synapsin1 근접 결찰 분석(황색 화살촉)으로 검출된 시냅스를 나타낸다. (A)에서, 회색 윤곽선은 MAP2 염색을 나타낸다. (A)에서, PLA 대조군으로 표지된 상부 패널은 대조군과 같은 비히클만으로 처리된 샘플을 나타낸다. 그러나, PSD95 일차는 반응에 포함되지 않았다. 마지막 두 패널에서, 뉴런을 90분 동안 신속한 항우울제 Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) 또는 Ro 플러스 GABAB 작용제 바클로펜 (Bac, 50 μM)으로 처리하였다. 증가된 누점 수(노란색 화살촉으로 확인됨)는 시험관 내에서, 신속한 항우울제 Ro-25-6981이 GABAB 작용제와 함께 투여될 때만 시냅스 형성이 증가한다는 것을 나타낸다. (B)에서, 녹색은 MAP2로 염색된 수상돌기를 나타내고, 파란색은 DAPI로 염색된 핵을 나타낸다. 병합 된 이미지에서 노란색 사각형으로 윤곽이 그려진 단일 덴드리트는 누점이 덴드라이트로 현지화된다는 것을 보여주기 위해 대표적인 이미지 아래에 격리됩니다. 동물을 Ro-25-6981 (10 mg/kg)로 처리하였고, 치료 45분 후에 조직을 수집하였다. 누점의 증가된 수(노란색 화살촉으로 확인됨)는 생체내에서 기저 GABA 신호전달 및 신속한 항우울제 Ro-25-6981에 따라 시냅스의 수가 증가한다는 것을 나타낸다. 대표적인 결과의 정량화는 막대 그래프로 표시되며 MAP2 영역으로 나눈 DetectSyn puncta의 평균 수를 나타냅니다. 결과는 실험 대조군으로 정규화된다. 이미지는 니콘 A1plus 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. 스케일 바 = (A) 10 μm; (B, 상단) 50 μm; (B, 바닥) 5 μm. 막대는 평균의 평균 +/- 표준 오차를 나타냅니다. 단방향 ANOVA에 의해 분석된 결과: *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 사후 분석에 의해. 이 그림은 Heaney et al.6에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DetectSyn은 근접 결찰 분석을 사용하여 서로 40nm 이내의 단백질을 검출하는 신속한 분석으로, 시냅스 형성을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 시냅스 형성을위한 프록시 측정만으로 사용되는 현재의 형광 분석을 향상시킵니다. DetectSyn은 40 nm 이내, 즉 시냅스 구개열 내에서 국소화된 시냅스 단백질의 정량화 가능한 변화를 검출한다. 또한 DetectSyn은 시냅스를 측정하고 고전적으로 금 표준 기술로 지정된 전자 현미경 및 어레이 단층 촬영과 같은 기술보다 비용 효율적이며 시간이 덜 걸립니다.
DetectSyn은 고도로 사용자 정의 할 수있는 기술입니다. 모든 시냅스 쌍은 단백질 쌍이 서로 40nm 내에 존재하는 한 특정 유형의 시냅스 형성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 흥미 진진한 기술에는 많은 응용 프로그램이 있지만 최적의 차단 및 일차 배양 조건을 포함하여 항체를 검증하고 면역 형광과 같은 다른 방법을 사용하여 결과를 계속 지원해야합니다. 항체 결합 경쟁을 감소시키기 위해 DetectSyn을 이용하지 않는 별도의 실험에서 이러한 지지 실험을 수행하는 것이 제안된다 (예를 들어, 동일한 실험에서 염소 항-PSD95 및 마우스 항-PSD95를 사용하여 경쟁으로 인한 결합을 감소시킬 수 있다). 추가적으로, 상이한 숙주에서 상승된 일차 항체-예를 들어, 염소 항-PSD95 및 토끼 항-시냅신1-을 선택하도록 주의한다. 두 프라이머리에 동일한 호스트가 사용되는 경우, 보조 프로브는 두 프라이머리를 구별하지 않습니다.
또한, 근접 라이게이션은 증폭 단계를 갖기 때문에, 생성된 누점으로부터 도출할 수 있는 정보는 제한적이다. 예를 들어, 상이한 크기의 누자가 관찰되고( 도 2B에서 명백함), 시냅스 크기의 변화 또는 동일한 영역으로 모집된 다중 시냅스가 있음을 시사한다. 그러나 실험 내의 각 샘플이 동일한 조건을 겪더라도 증폭 단계는 이러한 결론을 명확하게 도출하는 것을 어렵게 만듭니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 중요한 단계는 리가아제 및 중합효소가 얼음 블록 상에 남아 있고 샘플에 가능한 한 빨리 첨가되도록 하는 것을 포함한다. 또한 기술 제어를 포함하면 주어진 실험에서 비특이적 펑타가 나타날 수 있는 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 도 2B에서 볼 수 있듯이, 핵 내의 누점은 기술적 대조군에서 볼 수 있다. 따라서 실험 샘플에서 검출된 신호가 이러한 대조군에서 볼 수 있는 신호보다 큰지 확인하기 위해 음성 또는 기술적 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 일반적으로 이러한 기술 제어는 기본 또는 보조 쌍 중 하나를 생략하여 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 인큐베이션 온도가 이차 단계에서 시작하여 37°C에서 시작되도록 한다.
중요한 것은 DetectSyn은 기술 경험에 관계없이 표준 형광 현미경에 액세스 할 수있는 거의 모든 실험실이 시냅토 병리학을 연구 할 수있는 접근 가능한 방법을 제공한다는 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 NINDS R01 NS105005 (KRG) 및 NS105005-03S1 (KRG), 국방부 USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), FRAXA 연구 (CFH) 및 알츠하이머 협회 AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG)의 보조금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
