Summary
DetectSyn är en opartisk, snabb fluorescerande analys som mäter förändringar i relativt synapsantal (pre- och postsynaptiskt engagemang) över behandlingar eller sjukdomstillstånd. Denna teknik använder en närhetsligeringsteknik som kan användas både i odlade neuroner och fast vävnad.
Abstract
Synapser är platsen för kommunikation mellan neuroner. Neuronal kretsstyrka är relaterad till synaptisk densitet, och nedbrytningen av synapser är karakteristisk för sjukdomstillstånd som egentlig depression (MDD) och Alzheimers sjukdom. Traditionella tekniker för att undersöka synapsnummer inkluderar genetiskt uttryck av fluorescerande markörer (t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP)), färgämnen som fyller en neuron (t.ex. karbocyaninfärgämne, DiI) och immunofluorescerande detektion av ryggradsmarkörer (t.ex. postsynaptisk densitet 95 (PSD95)). En viktig varning för dessa proxytekniker är att de bara identifierar postsynaptiska förändringar. Ändå är en synaps en koppling mellan en presynaptisk terminal och en postsynaptisk ryggrad. Guldstandarden för mätning av synapsbildning/eliminering kräver tidskrävande elektronmikroskopi eller arraytomografitekniker. Dessa tekniker kräver specialutbildning och kostsam utrustning. Vidare kan endast ett begränsat antal nervceller bedömas och används för att representera förändringar i en hel hjärnregion. DetectSyn är en snabb fluorescerande teknik som identifierar förändringar i synapsbildning eller eliminering på grund av ett sjukdomstillstånd eller läkemedelsaktivitet. DetectSyn använder en snabb närhetsligeringsanalys för att upptäcka bredvid varandra pre- och postsynaptiska proteiner och standard fluorescerande mikroskopi, en teknik som är lätt tillgänglig för de flesta laboratorier. Fluorescerande detektion av den resulterande puncta möjliggör snabb och opartisk analys av experiment. DetectSyn ger mer representativa resultat än elektronmikroskopi eftersom större områden kan analyseras än ett begränsat antal fluorescerande nervceller. Dessutom fungerar DetectSyn för in vitro-odlade nervceller och fasta vävnadsskivor. Slutligen tillhandahålls en metod för att analysera data som samlats in från denna teknik. Sammantaget erbjuder DetectSyn ett förfarande för att upptäcka relativa förändringar i synapstäthet över behandlingar eller sjukdomstillstånd och är mer tillgängligt än traditionella tekniker.
Introduction
Synapser är den grundläggande enheten för kommunikation mellan neuroner1. Många synapser mellan neuroner inom samma regioner ger upphov till kretsar som förmedlar beteende2. Synapser består av en presynaptisk terminal från en neuron som frigör neurotransmittorer eller neuropeptider som vidarebefordrar information till postsynaptiska receptorer hos en annan neuron. Summeringen av presynaptiska signaler avgör om den postsynaptiska neuronen kommer att avfyra en åtgärdspotential och sprida meddelandet till andra neuroner.
Synaptopatologi, nedbrytningen av synapser, uppstår i sjukdomar och störningar som kännetecknas av minskad neural volym, som Alzheimers sjukdom och egentlig depression, vilket resulterar i kretsar som inte längre optimalt utför 3,4,5. Att återställa synapstätheten ligger sannolikt till grund för effekten av potentiella behandlingar för dessa störningar. Till exempel visades det nyligen att ökande synapser ligger till grund för beteendeeffekten av snabba antidepressiva medel6. För att snabbt screena möjliga synaptopatologiska behandlingar kräver forskare tekniker som snabbt identifierar förändringar i synapsnummer.
Nuvarande metoder är antingen tidskrävande och dyra (elektronmikroskopi, arraytomografi), eller så undersöker de bara postsynaptiska förändringar utan att införliva presynaptiskt engagemang (ryggradsanalyser, immunofluorescens / kolokalisering). Färgämnen som DiI eller fluorescerande proteiner som GFP hjälper till att visualisera nervceller och karakterisera postsynaptiska ryggar. Ryggradsanalys använder dock forskardefinierade förhållanden för att bestämma morfologi, vilket kan minska reproducerbarheten7. Vidare avslöjas fortfarande hur de olika ryggradsklasserna relaterar till funktionella synapser8. Ryggradsbildning kan vara övergående och kan återspegla postsynaptisk plasticitet, men dessa ryggar kan elimineras innan de stabiliseras till en synaps med en presynaptisk neuron9.
Kolokalisering ger en bättre proxy för synapser än ryggradsanalys eftersom man kan immunfärga för presynaptiska och postsynaptiska proteiner. Synaptiska proteiner kan emellertid ge låga samlokaliseringsvärden eftersom proteinerna ligger bredvid varandra och kanske inte konsekvent överlappar varandra. Således, eftersom proteinerna inte är helt överlagrade, kan samlokaliseringstekniker inte exakt mäta förändringar i synapsbildning på grund av denna saknade information. Slutligen, även om både elektronmikroskopi (EM) och arraytomografi ger högupplösta bilder av synapser, är de tidskrävande. EM kräver vidare specialutrustning, och forskare är begränsade till små volymer vävnad för ett visst experiment. Medan arraytomografi elegant ger möjlighet att screena för många proteiner på ultratunna sektioner och kan kombineras med EM10, kan denna teknik vara för arbetsintensiv och utanför ramen för experiment som snabbt måste skanna efter förändringar i synapsbildning.
DetectSyn är en specifik tillämpning av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen möjliggör allmän detektion av protein-proteininteraktioner. DetectSyn överbryggar proxy postsynaptiska åtgärder genom att förstärka en fluorescerande signal som emitteras av taggade pre- och postsynaptiska proteiner inom 40 nm från varandra. Om de synaptiska proteinerna ligger inom 40 nm, som i en synaptisk klyfta, kommer de sekundära antikropparna, som innehåller DNA-sonder, att hybridiseras till cirkulärt DNA. Detta hybridiserade cirkulära DNA uttrycker en fluorescerande sond, som sedan förstärks och detekteras med standard fluorescerande mikroskopitekniker (se figur 1). Avgörande, till skillnad från EM och arraytomografi, kräver denna teknik inte specialutrustning och tar ungefär lika lång tid som standardimmunhistokemi. Tillgängligheten av denna teknik gör det således möjligt för utredare utanför forskningsintensiva institutioner att delta i synaptopatologisk forskning. Vidare kan denna teknik undersöka förändringar i synaptisk densitet i flera hjärnregioner inom ett enda experiment, vilket ger en mer holistisk representation av synaptiska förändringar på grund av sjukdom eller behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Isolering av celler och vävnad från djur var i enlighet med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkänd av Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
OBS: Detta protokoll används på prover som redan behandlats och fastställts enligt specifika experimentella paradigmer och krav. För demonstrationsändamål används synapsbildning på grund av snabb antidepressiv behandling för att markera denna synapsdetekteringsteknik6. Neuroner som tidigare odlats på täckglas, behandlats, fixerats i 4% paraformaldehyd (PFA) och lagrats i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kommer att användas för att markera in vitro-procedurerna. Tidigare skivad hippocampusvävnad (25 μm tjock) från behandlade möss, transkardiellt perfuserad med iskall PBS och 4% PFA, och sedan lagrad i kryoskyddande medel kommer att användas för att markera skivprocedurerna. Se11,12 för mer information om hur man odlar nervceller eller transkardiellt perfuse gnagare. Se figur 1 för en grafisk återgivning av den här proceduren.
Bild 1: Grafisk representation av DetectSyn-analys. Efter permeabilisering av cellmembran binder primära antikroppar för Synapsin1 och PSD95 till dessa synaptiska proteiner. Sekundärer med oligonukleotidtaggar binder sedan till de primära antikropparna. Om Synapsin1 och PSD95 ligger inom 40 nm, som vid en synaps, interagerar oligonukleotiderna och en fluorescerande tagg förstärks. Denna fluorescerande signal kan sedan avbildas via standardmikroskopi och analyseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Skölj prover
- Skölj proverna med 500 μL 1x PBS + 0,75% glycin i 5 min 3 gånger med försiktig omrörning på en orbitalskakare för att avlägsna kvarvarande PFA eller kryoskyddande medel.
2. Blockera och permeabilisera prover
- Förbered blockerings- och permeabiliseringslösning (10% normalt åsneserum, 0,25% Tween 20) i 1x PBS. Förbered tillräckligt för att använda för blockering, primära och sekundära inkubationer.
- Till prover (t.ex. täckglas eller fritt flytande skivor) i 24 brunnsplattor, tillsätt 500 μL blockerings- och permeabiliseringslösning. Se till att varje brunn innehåller olika prover och är korrekt märkt för att förhindra att prover byts ut.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur (RT) i 60 min för odlade celler eller 2 timmar för skivad vävnad. Använd en orbital shaker för mild agitation.
3. Inkubera prover i primära antikroppar
- Förbered primära antikroppar i blockerande buffert:
- Förbered postsynaptisk densitet 95 (PSD95; 1:500, kaninpolyklonal), Synapsin1 (1:500, musmonoklonal), MAP2 (1:400, kycklingpolyklonal)
- Förbered en negativ kontroll alikvot som utelämnar ett av de synaptiska paren (t.ex. utan PSD95)
- Ta försiktigt bort blockeringslösningen med en Pasteur-pipett av plast. Försök att ta bort så mycket som möjligt utan att störa cellerna eller riva vävnad.
- För odlade celler:
- Klä en stor petriskål i plast med parafilm. Överför försiktigt täckglas till parafilmen med pincett.
- Tillsätt försiktigt 60 μl av den primära antikroppslösningen till toppen av täckglasen. Se till att inte spilla den primära antikroppslösningen över sidan av täckglaset.
- För att ge fuktighet och förhindra att prover torkar ut under inkubationsperioden, tillsätt ultrarent vatten till en mindre petriskål och ordna försiktigt den lilla petriskålen runt täckglasen.
- Täck över den stora petriskålen och inkubera odlade celler i 1 timme vid RT.
- För skivad vävnad:
- Tillsätt försiktigt 250 μl av den primära antikroppslösningen till fritt flytande skivor i en 24-brunnsplatta.
- Täck över plattan och inkubera vävnaden över natten vid 4 °C med försiktig omrörning på en orbitalskakare.
4. Tvätta prover och inkubera sedan i sekundära antikroppar
- Förbered sekundära antikroppar i blockeringsbufferten:
- Förbered Åsna anti-mus (1:5), åsna anti-kanin (1:5), åsna anti-kyckling (1:400).
- I detta steg kan ytterligare tekniska kontroller erhållas genom att förbereda en sekundär alikvot som utelämnar antingen antimus- eller antikanin sekundär.
- För odlade celler:
- Använd pincett och knacka försiktigt av den primära lösningen från täckglas på en pappershandduk
- Använd pincett och överför försiktigt täckglasen tillbaka till deras ursprungliga 24-brunnsplatta fylld med 500 μl 1x PBS.
- För skivad vävnad:
- Ta försiktigt bort den primära antikroppslösningen med en Pasteur-pipett av plast. Försök att ta bort så mycket som möjligt utan att riva vävnad.
- Tillsätt 500 μL 1x PBS
- Tvätta proverna i 10 min 3 gånger i 1x PBS med försiktig omrörning på en orbital shaker. Under denna tid, ta med alla tvättbuffertar till RT.
- Under denna tid byter du parafilmen i den stora petriskålen
- För odlade celler:
- Använd pincett och överför försiktigt täckglasen tillbaka till den parafilmade stora petriskålen
- Tillsätt försiktigt 40 μL av den sekundära antikroppslösningen till toppen av täckglasen. Se till att inte spilla den sekundära antikroppslösningen över sidan av täckglaset.
- Om det behövs, tillsätt mer ultrarent vatten i en mindre petriskål och ordna försiktigt den lilla petriskålen runt täckglas.
- Täck över den stora petriskålen
- För skivad vävnad:
- Tillsätt försiktigt 250 μl av den sekundära antikroppslösningen till fritt flytande skivor i en 24-brunnsplatta.
- Täck över plattan
OBS: Från och med nu, skydda prover från ljus genom att förpacka plattornas toppar med folie.
- Inkubera proverna vid 37 °C i 1 timme
5. Ligering
- Blanda ligeringsstocken 1:5 i molekylärt vatten.
- Som i avsnitt 4, överför försiktigt täckglasen och ta bort den sekundära blandningen från den skivade vävnaden.
- Tvätta proverna i 500 μl tvättbuffert A
- För odlade celler, tvätta 2 gånger i 5 min. För skivad vävnad, tvätta 2 gånger i 10 min. Använd mild omrörning på en orbital shaker för båda.
- Under denna tid byter du parafilmen i den stora petriskålen
- Medan du håller ligasen på ett kallt block, späd ligasen 1:40 i ligeringslagret från steg 5.1. Utför denna utspädning omedelbart innan du tillsätter ligasen till proverna.
- Som i avsnitt 4, ta bort så mycket av tvättbufferten A som möjligt från proverna innan du tillsätter ligasen.
- För odlade celler: Överför täckglass tillbaka till den parafilmade petriskålen. Tillsätt 40 μL av ligeringsblandningen till täckglas, ordna små vattenfyllda petriskålar runt täckglasen och täck den stora petriskålen.
- För skivad vävnad: Tillsätt 250 μL av ligeringsblandningen från steg 5.4 till varje brunn och täck plattan.
- Inkubera proverna i 30 minuter vid 37 °C.
6. Förstärkning
- Blanda förstärkningsbeståndet 1:5 i molekylärt vatten.
- Som i avsnitt 4, överför försiktigt täckglasen och ta bort ligeringsblandningen från den skivade vävnaden.
- Tvätta prover i 500 μl tvättbuffert A
- För odlade celler, tvätta 2 gånger i 2 min. För skivad vävnad, tvätta 2 gånger i 10 min. Använd mild omrörning på en orbital shaker för båda.
- Under denna tid byter du parafilmen i den stora petriskålen
- Utför denna utspädning omedelbart innan polymeraset tillsätts till proverna. Medan du håller polymeraset på ett kallt block, späd polymeraset
- För odlade celler, späd polymeras 1:80 i förstärkningsbeståndet från steg 6.1.
- För skivad vävnad, späd polymeras 1:40 i förstärkningsstocken från steg 6.1.
- Som i steg 4, ta bort så mycket av tvättbufferten A som möjligt från proverna innan du tillsätter polymeraset.
- För odlade celler: Överför täckglasen tillbaka till den parafilmade petriskålen. Tillsätt 40 μL av förstärkningsblandningen från steg 6.4.1 till täckglas, ordna små vattenfyllda petriskålar runt täckglasen och täck den stora petriskålen. Inkubera proverna i 100 minuter vid 37 °C.
- För skivad vävnad: Tillsätt 250 μL av förstärkningsblandningen från steg 6.4.2 till varje brunn och täck över plattan. Inkubera proverna i 2 timmar vid 37 °C.
OBS: Under den här tiden förbereder och märker du bilder.
7. Montering
- Som i steg 4, överför försiktigt täckglasen och ta bort förstärkningsblandningen från den skivade vävnaden.
- Tvätta proverna i 500 μl tvättbuffert B 2 gånger i 10 min med försiktig omrörning på en orbitalskakare.
- Tvätta proverna i 500 μl 1% tvättbuffert B i 1 min med försiktig omrörning på en orbitalskakare.
- För odlade celler:
- Släpp 3 μL monteringsmedia på en bild
- Knacka bort överflödig tvättbuffert från täckglaset och placera sedan täckglaset (med cellerna nedåt) i monteringsmediet. Försegla sidorna med en liten mängd klart nagellack för att täta täckglaset på plats.
- För skivad vävnad:
- Överför försiktigt en vävnadsskiva till den förberedda bilden och ordna den, så att skivan ligger platt. Släpp mellan 5-10 μL monteringsmedia (mängden beror på skivans storlek) på vävnadsskivan
- Placera försiktigt ett glasöverdrag över vävnadsskivan och försegla med en liten mängd klart nagellack längs kanten för att täta täckglaset på plats.
- Vänta minst 15 minuter innan du analyserar under mikroskopet, eller förvara vid -20 °C.
8. Få digitala bilder med ett konfokalmikroskop
- Optimera förvärvsinställningarna (t.ex. laserkraft, förstärkning, förskjutning) över prover från alla behandlingar. Se till att optimeringen inkluderar minskande bakgrundsbrus och förbättring av signalen utan att övermätta intensiteten hos de fluorescerande signalerna. När inställningarna har fastställts tillämpar du samma hämtningsinställningar på alla bilder som erhålls.
OBS: Följande förvärvsinformation kan användas med ett Nikon A1 konfokalmikroskop och Nikon NIS AR Elements-programvaran. - Ställ in bilden med provet på scenen och hitta fokalplanet för provet med DAPI genom okularet.
- Stäng av ögonporten genom att klicka på Ögonport och välj en optisk konfigurationsknapp för att justera inställningarna.
- Justera förstärkning, förskjutning och lasereffekt för varje fluorescerande kanal för att minska bakgrundsbruset och förbättra den fluorescerande signalen. Se till att den fluorescerande signalen inte blir övermättad enligt steg 8.5-8.6.
- Övervaka övermättnad med en pseudofärg för den fluorescerande signalen. Längst ned i livebilden högerklickar du på fliken märkt med den fluorescerande kanal som för närvarande används.
- Välj sedan Kanalfärgning och välj en pseudofärg som Rainbow Dark för att visualisera fluorescensintensiteten i en värmekartliknande pseudofärg. I Rainbow Dark indikerar svalare färger mindre fluorescerande intensitet och varmare färger indikerar mer fluorescerande intensitet.
- När alla fluorescerande kanaler är optimerade högerklickar du på den tidigare valda optiska konfigurationsknappen och väljer Tilldela aktuell kamerainställning för den här knappen.
- Kontrollera att de valda inställningarna är tillräckliga för ett slumpmässigt urval från varje behandlingsgrupp. Om de valda inställningarna övermättar något av dessa exempel upprepar du steg 8.4 för att eliminera övermättnaden.
- För odlade nervceller, följ steg 8.10-8.16.
- Använd ögonporten och sök efter en neuron med dendriter som har minimal överlappning med andra dendriter.
- Stäng av ögonporten och använd DAPI-kanalen för att visualisera cellkroppen hos den valda neuronen. Dubbelklicka på mitten av soma för att centrera neuronen i mitten av synfältet.
- Använd MAP2-kanalen för att hitta det bästa fokusplanet för MAP2-signalen med liveskanning.
- Under fliken ND-förvärv klickar du på Spara till fil och väljer en fil att spara bilden i under Bläddra. Ange sedan filnamnet.
- Under fliken Z väljer du alternativet Symmetriskt läge definierat av intervall . Ställ in fokus på det bästa MAP2-planet och klicka på knappen Relativ för att ställa in detta fokalplan som mitten av z-stacken.
- Ställ in intervallet på 5 μm med 1 μm steg och se till att kontrollera Stäng aktiv slutare under Z-rörelse. Under fliken Våglängd väljer du namnet på den optiska knappen med de tidigare konfigurerade anskaffningsinställningarna under Optisk konf. Klicka sedan på Kör nu.
- Upprepa steg 8.1.10-8.1.15 för cirka 10 nervceller per täckglas/behandling.
- För skivad vävnad, följ steg 8.18-8.22.
- Använd ögonporten och sök efter intresseområdet. Leta till exempel upp CA1 för hippocampus.
- Stäng av ögonporten och använd MAP2-kanalen för att hitta det bästa fokusplanet för MAP2-signalen med liveskanning.
- Under menyn Hämta väljer du Skanna stor bild. Välj sedan den optiska knappens namn med de tidigare konfigurerade förvärvsinställningarna under hämtningspanelen från panelen som öppnas. Se också till att välja rätt mål i den här panelen.
- Under panelen Område och okularet använder du piltangenterna för att ställa in gränserna för det intressanta området. Klicka sedan på Spara stor bild till fil och skapa ett filformat för bilden.
- Under panelen Inställningar kontrollerar du att Flerkanalsinspelning är markerat och väljer sedan namnet på den optiska knappen med de tidigare konfigurerade hämtningsinställningarna under Optisk conf.
OBS: En z-stack för en stor bild är möjlig men ökar skanningstiden.
9. Analys
- På samma sätt som förvärvsinställningar använder du exempel från alla behandlingar för att optimera tröskelinställningarna. Se till att tröskeloptimeringen fokuserar på att minska bakgrundsbruset och förbättra signalen utan att övermätta intensiteten hos de fluorescerande signalerna. När dessa inställningar har fastställts tillämpar du samma tröskelinställningar för alla bilder som används för analys enligt beskrivningen i steg 9.2–9.3.
- I ImageJ finns tröskelalternativet under menyn Bild > Justera > Tröskelvärde. Välj den Mörk bakgrund alternativ om bilden har en mörk bakgrund.
- Justera sedan de övre och nedre gränserna för tröskeln per tidigare fastställda optimerade tröskelinställningar och klicka sedan på Apply.
- För odlade celler använder du MAP2-kanalen och ett roi-verktyg (freehand region of interest) för att rita en ROI för varje neuron, inklusive dendriter och soma. För skivad vävnad, rita en frihands ROI i skivbilden som inkapslar intresseområdet (t.ex. stratum radiatum av CA1 inom hippocampus).
- Få området för ROI. I ImageJ mäter du området under menyn Analysera > mät.
- Upptäck antalet punkter inom varje ROI med hjälp av ett automatiskt detekteringsverktyg som partikelanalys i ImageJ enligt steg 9.7-9.9.
- Hitta alternativet Partikelanalys under menyn Analysera > Analysera partiklar. Definiera först punctastorleksdiametern, vanligtvis 0,1-3 μm2.
- Välj sedan Överläggsmasker alternativ från Visa rullgardinsmenyn och kontrollera Visa resultat alternativ. Klicka sedan på OK.
- Om puncta inte detekteras med det valda diameterområdet, justera intervallet tills all puncta detekteras med denna analys. Se till att använda samma inställningar för partikelanalys för alla bilder.
- Dela antalet puncta med området för en enskild region av intresse genom att följa stegen 9.11-9.13.
- Kopiera och klistra in resultaten för varje bild från popup-fönstret Resultat från ImageJ i ett kalkylblad.
- Identifiera först vilken fil och vilket prov data erhölls från. Dela sedan området för ROI med antalet puncta.
- Rensa sedan data från popup-fönstret Resultat och upprepa steg 9.2-9.12.
- Normalisera resultat för att kontrollera prover: Genomsnitt av resultaten (antal puncta/ ROI-område) för kontrollproverna. Dela sedan de erhållna resultaten av alla prover med genomsnittet av kontrollen för att erhålla de normaliserade resultaten. Det nya genomsnittet av kontrollproverna bör vara lika med 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data modifierade från Heaney et al.6 presenteras för att demonstrera ett experiment där ökad synapsbildning förväntas (se6 för mer information och en mer djupgående diskussion om mekanismen). Tidigare har det visats att snabba antidepressiva medel kräver aktivering av den hämmande metabotropa receptorn, GABAB (gamma-aminosmörsyra subtyp B), för att vara effektiv13. Vidare indikerade tidigare data att snabba antidepressiva medel ökar postsynaptiska markörer14; Således användes DetectSyn för att testa hypotesen att snabba antidepressiva medel ökar synapsantalet för att vara effektiva.
I odlade neuroner testas fyra tillstånd. Först, i den övre panelen i figur 2A, behandlades odlade neuroner med vehikeln under samma förhållanden som den experimentella kontrollen. Den primära PSD95-antikroppen utelämnas dock för att ge en teknisk kontroll för DetectSyn-analysen (se figur 1 för hur varje komponent bidrar till signalen). Därefter, i kontrollpanelen, behandlas neuroner igen med fordonet men får både PSD95 och Synapsin1 primärer. Därefter behandlas odlade neuroner endast med det snabba antidepressiva Läkemedlet Ro-25-6981 (Ro) eller Ro plus GABAB-agonisten, baklofen (Bac). Som tidigare visat13 krävs både det snabba antidepressiva Ro-25-6981 och GABAB-agonisten baklofen för in vitro-effekten av Ro-25-6981. Således demonstreras en ökning av synapsbildning genom en ökning av vit puncta (Figur 2A). Utan baklofen ses ingen ökning av synapsbildning in vitro .
In vivo är basala GABA-nivåer tillräckliga för att det snabba antidepressiva läkemedlet ska fungera13, så endast det snabba antidepressiva Ro-25-6981 administreras via intraperitoneal injektion till möss (Figur 2B). 2B representerar en annan teknisk kontroll för DetectSyn-analysen. Hippocampusvävnad från en saltlösningsbehandlad mus undersöktes med båda primärerna för PSD95 och Synapsin1, men en av sekundärerna utelämnades. En ökning av synapsbildning på grund av behandling med det snabba antidepressiva läkemedlet Ro-25-6981 jämfört med saltlösningsbehandlade möss visas i mitten och höger panel i figur 2B.
Representativa bilder för tekniska kontroller in vitro och ex vivo visas. I figur 2A utelämnas en av primärerna för de synaptiska paren (dvs PSD95), och i figur 2B utelämnas en av sekundärerna. Medan vissa puncta visas i de tekniska kontrollbilderna, är de i allmänhet inte lika stora, vilket framgår av den vita fläcken i den övre panelen i figur 2A jämfört med den stora puncta i de andra panelerna. Vidare är dessa puncta inte på samma plats som den kvantifierade puncta, vilket framgår av vissa puncta som förekommer inom soma för den tekniska kontrollen i figur 2B. Vanligtvis förekommer icke-specifik puncta i kärnorna, kanske på grund av närvaron av DNA.
För att analysera de representativa resultaten i figur 2A spårades dendriter (visualiserade med MAP2-färgning och representerade här i en grå kontur) med hjälp av ett frihandsritverktyg för att skapa intressanta regioner (ROI). Först erhölls området för MAP2 ROIs med hjälp av NIS Elements-funktionen, ROI-data under fliken Automatiserade mätresultat . Därefter upptäcktes puncta med hjälp av tröskelfunktionen i NIS Elements. Den här funktionen skapar en binär mask av objekt som faller inom en definierad intensitetströskel. Därefter upptäcktes antalet binära objekt i MAP2 ROIs med hjälp av NIS Elements-funktionen, Binary in ROI, under fliken Automated Measurement Results . Data som presenteras i diagrammet till höger om figur 2A är de normaliserade värdena för puncta dividerat med ROI-området.
För att analysera de representativa resultaten i figur 2B spårades CA1:s stratum radiatum med hjälp av ett ritverktyg för frihand för att skapa en ROI. Först erhölls ROI-området med hjälp av ROI-datafunktionen, som beskrivs i stycket ovan. Därefter upptäcktes puncta med funktionen Spot Detection - Bright Spots , som finns under binärmenyn . Därefter valdes diameter- och kontrastvärdena baserat på visuell inspektion av flera skivor från alla behandlingar. När dessa värden väl hade bestämts tillämpades de enhetligt på alla analyserade bilder. Funktionen Dekoridentifiering skapar binära masker av objekt inom de definierade diameter- och kontrastparametrarna. Därefter upptäcktes antalet binära objekt i MAP2 ROIs med hjälp av NIS Elements-funktionen, Binary in ROI, under fliken Automated Measurement Results . De data som presenteras i diagrammet till höger om figur 2B är de normaliserade värdena för puncta dividerat med ROI-området.
Bild 2: Identifiering av synapser med DetectSyn-analys. Vit puncta representerar synapser som detekterats med DetectSyn PSD95-Synapsin1 närhetsligeringsanalys (gula pilspetsar) i (A) in vitro odlade primära hippocampusneuroner och (B) ex vivo CA1 stratum radiatum. I (A) representerar den grå konturen MAP2-färgning. I (A) representerar den övre panelen märkt PLA-kontroll prover som behandlats med endast fordon, som kontrollen. PSD95-primären ingick dock inte i reaktionen. I de två sista panelerna behandlades neuroner med det snabba antidepressiva läkemedlet Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) eller Ro plus GABAB-agonisten baklofen (Bac, 50 μM) i 90 minuter. Det ökade antalet puncta (identifierat med gula pilspetsar) indikerar att in vitro, synapsbildning bara ökar när det snabba antidepressiva Läkemedlet Ro-25-6981 administreras med GABAB-agonisten. I (B) representerar grönt dendriter färgade med MAP2 och blått representerar kärnor färgade med DAPI. Enstaka dendriter, skisserade i gula rektanglar i de sammanfogade bilderna, isoleras under representativa bilder för att visa att puncta lokaliseras till dendriter. Djuren behandlades med Ro-25-6981 (10 mg/kg) och vävnad samlades in 45 minuter efter behandlingen. Det ökade antalet puncta (identifierat med gula pilspetsar) indikerar att in vivo ökar antalet synapser med basal GABA-signalering och det snabba antidepressiva läkemedlet Ro-25-6981. Kvantifiering av representativa resultat representeras av stapeldiagrammen och anger det genomsnittliga antalet DetectSyn puncta dividerat med MAP2-området. Resultaten normaliseras till den experimentella kontrollen. Bilder erhölls med hjälp av ett Nikon A1plus konfokalmikroskop. Skalstaplar = (A) 10 μm; (B, överst) 50 μm; (B, botten) 5 μm. Staplar representerar medelvärdet +/- standardfelet för medelvärdet. Resultat analyserade av envägs ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 genom post-hoc-analys. Figuren har modifierats från Heaney et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DetectSyn är en snabb analys som använder en närhetsligeringsanalys för att detektera proteiner inom 40 nm från varandra, vilket möjliggör detektering av synapsbildning. Denna teknik förbättrar nuvarande fluorescerande analyser, som endast fungerar som proxymätningar för synapsbildning. DetectSyn detekterar kvantifierbara förändringar i synaptiska proteiner lokaliserade inom 40 nm, dvs inom den synaptiska klyftan, av varandra. Vidare är DetectSyn mer kostnadseffektivt och tar mindre tid än tekniker, som elektronmikroskopi och arraytomografi, utformade för att mäta synapser och klassiskt betecknas som guldstandardtekniker.
DetectSyn är en mycket anpassningsbar teknik. Varje synaptiskt par kan användas för att identifiera bildandet av specifika typer av synapser, så länge proteinparet ligger inom 40 nm från varandra. Även om denna spännande teknik har många tillämpningar, måste man se till att validera antikroppar, inklusive optimala blockerings- och primära inkubationsförhållanden, och fortsätta att stödja deras resultat med andra metoder som immunofluorescens. Det föreslås att utföra dessa stödjande experiment i separata experiment som inte använder DetectSyn för att minska antikroppsbindningskonkurrensen (t.ex. att använda get-anti-PSD95 och mus-anti-PSD95 i samma experiment kan minska bindningen på grund av konkurrens). Var också noga med att välja primära antikroppar uppfödda i olika värdar - till exempel get-anti-PSD95 och kanin-anti-Synapsin1. Om samma värd används för båda primärvalen kommer de sekundära sonderna inte att skilja mellan de två primärvalen.
Vidare, eftersom närhetsligering har ett förstärkningssteg, finns det begränsad information man kan dra från den resulterande puncta. Till exempel observeras puncta av olika storlek (framgår av figur 2B), vilket tyder på en förändring i synapsstorlek eller flera synapser rekryterade till samma område. Men även om varje prov i ett experiment genomgår samma förhållanden, gör förstärkningssteget det svårt att dra dessa slutsatser kategoriskt.
Slutligen inkluderar kritiska steg för detta protokoll att säkerställa att ligasen och polymeraset förblir på ett isblock och tillsätts så snabbt som möjligt till prover. Dessutom kommer tekniska kontroller att hjälpa till att identifiera var icke-specifik puncta kan visas i ett visst experiment. Till exempel, som ses i figur 2B, ses puncta i kärnor i tekniska kontroller. Därför är det viktigt att inkludera negativa eller tekniska kontroller för att säkerställa att signalen som detekteras i experimentella prover är större än den som ses i dessa kontroller. Vanligtvis erhålls dessa tekniska kontroller genom att utelämna ett av de primära eller sekundära paren. Slutligen, se till att inkubationstemperaturen är vid 37 °C med början i det sekundära steget.
Viktigt är att DetectSyn ger ett tillgängligt sätt för nästan alla laboratorier med tillgång till ett standard fluorescerande mikroskop, oavsett teknisk erfarenhet, för att studera synaptopatologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) och NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) och ett bidrag från FRAXA Research (CFH) och Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
