Summary
DetectSyn - это непредвзятый, быстрый флуоресцентный анализ, который измеряет изменения относительного числа синапсов (до- и постсинаптического взаимодействия) между методами лечения или болезненными состояниями. Этот метод использует технику бесконтактной лигации, которая может быть использована как в культивируемых нейронах, так и в фиксированной ткани.
Abstract
Синапсы являются местом связи между нейронами. Сила нейронной цепи связана с синаптической плотностью, а разрушение синапсов характерно для таких болезненных состояний, как большое депрессивное расстройство (MDD) и болезнь Альцгеймера. Традиционные методы исследования чисел синапсов включают генетическую экспрессию флуоресцентных маркеров (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP)), красителей, которые заполняют нейрон (например, карбоцианиновый краситель, DiI), и иммунофлуоресцентное обнаружение маркеров позвоночника (например, постсинаптическая плотность 95 (PSD95)). Основным предостережением к этим прокси-методам является то, что они идентифицируют только постсинаптические изменения. Тем не менее, синапс является связью между пресинаптическим терминалом и постсинаптическим позвоночником. Золотой стандарт для измерения образования/элиминации синапсов требует трудоемкой электронной микроскопии или методов массивной томографии. Эти методы требуют специализированной подготовки и дорогостоящего оборудования. Кроме того, только ограниченное количество нейронов может быть оценено и используется для представления изменений во всей области мозга. DetectSyn - это быстрый флуоресцентный метод, который идентифицирует изменения в образовании или устранении синапсов из-за болезненного состояния или активности препарата. DetectSyn использует быстрый анализ бесконтактного лигирования для обнаружения сопоставленных пре- и постсинаптических белков и стандартной флуоресцентной микроскопии, метода, легко доступного для большинства лабораторий. Флуоресцентное обнаружение полученной пункты позволяет проводить быстрый и непредвзятый анализ экспериментов. DetectSyn дает более репрезентативные результаты, чем электронная микроскопия, потому что могут быть проанализированы большие области, чем ограниченное количество флуоресцентных нейронов. Кроме того, DetectSyn работает для культивируемых in vitro нейронов и фиксированных срезов тканей. Наконец, предоставляется метод анализа данных, собранных с помощью этой техники. В целом, DetectSyn предлагает процедуру обнаружения относительных изменений плотности синапсов при лечении или болезненных состояниях и является более доступной, чем традиционные методы.
Introduction
Синапсы являются фундаментальной единицей связи между нейронами1. Многие синапсы между нейронами в пределах одних и тех же областей порождают цепи, которые опосредуют поведение2. Синапсы состоят из пресинаптического терминала от одного нейрона, который высвобождает нейротрансмиттеры или нейропептиды, которые передают информацию постсинаптическим рецепторам другого нейрона. Суммирование пресинаптических сигналов определяет, будет ли постсинаптический нейрон запускать потенциал действия и распространять сообщение на другие нейроны.
Синаптопатология, разрушение синапсов, возникает при заболеваниях и расстройствах, отмеченных уменьшением нервного объема, таких как болезнь Альцгеймера и большое депрессивное расстройство, в результате чего цепи больше не выполняютоптимально 3,4,5. Восстановление плотности синапсов, вероятно, лежит в основе эффективности потенциальных методов лечения этих расстройств. Например, недавно было продемонстрировано, что увеличение синапсов лежит в основе поведенческой эффективности быстрых антидепрессантов6. Чтобы быстро отсеять возможные методы лечения синаптопатологии, исследователям требуются методы, которые быстро идентифицируют изменения в количестве синапсов.
Современные методологии либо трудоемки и дороги (электронная микроскопия, массивная томография), либо они исследуют только постсинаптические изменения без включения пресинаптического участия (анализ позвоночника, иммунофлуоресценция / колокализация). Красители, такие как DiI, или флуоресцентные белки, такие как GFP, помогают визуализировать нейроны и характеризуют постсинаптические шипы. Тем не менее, анализ позвоночника использует определенные исследователями соотношения для определения морфологии, которая может снизить воспроизводимость7. Кроме того, как различные классы позвоночника связаны с функциональными синапсами, все еще раскрывается8. Образование позвоночника может быть преходящим и может отражать постсинаптическую пластичность, но эти шипы могут быть устранены до стабилизации в синапс с пресинаптическим нейроном9.
Колокализация обеспечивает лучший показатель для синапсов, чем анализ позвоночника, потому что можно иммуноразмношить пресинаптические и постсинаптические белки. Тем не менее, синаптические белки могут давать низкие значения колокализации, потому что белки сопоставляются и могут не последовательно перекрываться. Таким образом, поскольку белки не накладываются полностью, методы колокализации могут не точно измерять изменения в образовании синапсов из-за этой недостающей информации. Наконец, хотя и электронная микроскопия (ЭМ), и массивная томография обеспечивают изображения синапсов с высоким разрешением, они отнимают много времени. ЭМ также требует специализированного оборудования, и исследователи ограничены небольшими объемами ткани для любого данного эксперимента. В то время как массивная томография элегантно обеспечивает возможность скрининга многих белков на ультратонких срезах и может сочетаться с EM10, этот метод может быть слишком трудоемким и выходить за рамки экспериментов, которые необходимо быстро сканировать на предмет изменений образования синапсов.
DetectSyn является специфическим применением анализа близости лигирования Duolink. Анализ PLA позволяет в целом обнаруживать белково-белковые взаимодействия. DetectSyn мостит прокси-постсинаптические меры путем усиления флуоресцентного сигнала, излучаемого помеченными пре- и постсинаптическими белками в пределах 40 нм друг от друга. Если синаптические белки находятся в пределах 40 нм, как в синаптической щели, то вторичные антитела, которые содержат ДНК-зонды, будут гибридизоваться в круговую ДНК. Эта гибридизированная круговая ДНК экспрессирует флуоресцентный зонд, который затем амплифицируется и обнаруживается с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии (см. Рисунок 1). Важно отметить, что в отличие от ЭМ и массивной томографии, эта методика не требует специализированного оборудования и занимает примерно столько же времени, сколько и стандартная иммуногистохимия. Таким образом, доступность этого метода позволяет исследователям за пределами научно-исследовательских учреждений участвовать в исследованиях синаптопатологии. Кроме того, этот метод может исследовать изменения синаптической плотности в нескольких областях мозга в рамках одного эксперимента, предлагая более целостное представление синаптических изменений из-за болезни или лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Выделение клеток и тканей от животных было в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Wake Forest Institutional Animal
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется на образцах, уже обработанных и зафиксированных в соответствии с конкретными экспериментальными парадигмами и требованиями. В демонстрационных целях для выделения этого метода обнаружения синапсов6 используется образование синапсов в результате быстрого лечения антидепрессантами. Нейроны, ранее культивируемые на покровных листах, обработанные, зафиксированные в 4% параформальдегиде (PFA) и хранящиеся в 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS), будут использоваться для выделения процедур in vitro. Ранее нарезанная ткань гиппокампа (толщиной 25 мкм) у обработанных мышей, транскардиально перфузированная ледяным PBS и 4% PFA, а затем хранящаяся в криопротекторе, будет использоваться для выделения процедур среза. Пожалуйста, смотрите11,12 для получения дополнительной информации о том, как культивировать нейроны или транскардиально перфузировать грызунов. Графическое представление этой процедуры см. на рисунке 1.
Рисунок 1: Графическое представление анализа DetectSyn. После пермеабилизации клеточных мембран первичные антитела к Synapsin1 и PSD95 связываются с этими синаптическими белками. Вторичные вещества с олигонуклеотидными метками затем связываются с первичными антителами. Если Synapsin1 и PSD95 находятся в пределах 40 нм, как у синапса, то олигонуклеотиды взаимодействуют, и флуоресцентная метка усиливается. Этот флуоресцентный сигнал затем может быть визуализирован с помощью стандартной микроскопии и проанализирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Образцы промывки
- Промыть образцы 500 мкл 1x PBS + 0,75% глицина в течение 5 мин 3 раза с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере для удаления остаточного PFA или криопротектора.
2. Блокируйте и пронизывайте образцы
- Приготовьте блокирующий и пермеабилизирующий раствор (10% обычная ослиная сыворотка, 0,25% Tween 20) в 1x PBS. Подготовьте достаточно для использования для блокирующих, первичных и вторичных инкубаций.
- К образцам (например, чехлам или свободно плавающим срезам) в 24 пластинах скважины добавляют 500 мкл блокирующего и пермеабилизирующего раствора. Убедитесь, что каждая скважина содержит отдельный образец и имеет соответствующую маркировку, чтобы предотвратить переключение образцов.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре (RT) в течение 60 мин для культивируемых клеток или 2 ч для нарезанной ткани. Используйте орбитальный шейкер для мягкого перемешивания.
3. Инкубировать образцы в первичных антителах
- Получают первичные антитела в блокирующем буфере:
- Приготовить постсинаптическую плотность 95 (PSD95; 1:500, кроличий поликлональный), Synapsin1 (1:500, мышиный моноклональный), MAP2 (1:400, куриный поликлональный)
- Подготовьте отрицательную контрольную аликвоту, которая опускает одну из синаптических пар (например, без PSD95)
- Аккуратно снимите блокирующий раствор пластиковой пипеткой Пастера. Постарайтесь удалить как можно больше, не нарушая клетки и не разрывая ткани.
- Для культивируемых клеток:
- Выложите большую пластиковую чашку Петри парапленкой. Аккуратно переложите крышки на парапленку с помощью щипцов.
- Осторожно добавьте 60 мкл раствора первичного антитела в верхнюю часть покровных пластин. Убедитесь, что раствор первичного антитела не разливается на боковую сторону крышки.
- Чтобы обеспечить влажность и предотвратить высыхание образцов в течение инкубационного периода, добавьте сверхчистую воду в меньшую чашку Петри и аккуратно расположите маленькую чашку Петри вокруг укрытий.
- Накройте большую чашку Петри и инкубируйте культивируемые клетки в течение 1 ч при РТ.
- Для нарезанной ткани:
- Осторожно добавляют 250 мкл раствора первичного антитела к свободно плавающим срезам в 24-луночной пластине.
- Накройте пластину и инкубируйте ткань в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
4. Промыть образцы, затем инкубировать вторичные антитела
- Подготовьте вторичные антитела в блокирующем буфере:
- Приготовьте Ослик против мыши (1:5), Осел против кролика (1:5), Осел против курицы (1:400).
- На этом этапе дополнительные технические средства контроля могут быть получены путем подготовки вторичной аликвоты, которая опускает либо антимышечную, либо анти-кроликовую вторичную.
- Для культивируемых клеток:
- Используя щипцы, осторожно отсоедините основной раствор с обложек на бумажное полотенце
- Используя щипцы, осторожно перенесите крышки обратно на их первоначальную 24-луночную пластину, заполненную 500 мкл 1x PBS.
- Для нарезанной ткани:
- Осторожно удалите раствор первичного антитела пластиковой пипеткой Пастера. Постарайтесь удалить как можно больше, не разрывая ткань.
- Добавьте 500 мкл 1x PBS
- Промывайте образцы в течение 10 мин 3 раза в 1x PBS с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере. За это время принесите все промывочные буферы в RT.
- За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
- Для культивируемых клеток:
- Используя щипцы, аккуратно переложите чехлы обратно на парафильмированную большую чашку Петри
- Осторожно добавьте 40 мкл раствора вторичного антитела в верхнюю часть покровных пластинок. Убедитесь, что раствор вторичного антитела не разливается на боковую сторону крышки.
- При необходимости добавьте больше сверхчистой воды в меньшую чашку Петри и аккуратно разложите маленькую чашку Петри вокруг укрытий.
- Накройте большую чашку Петри
- Для нарезанной ткани:
- Осторожно добавляют 250 мкл раствора вторичного антитела к свободно плавающим срезам в 24-луночной пластине.
- Накройте пластину
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента защитите образцы от света, обернув верхушки пластин фольгой.
- Инкубация образцов при температуре 37 °C в течение 1 ч
5. Перевязка
- Смешайте перевязочный материал 1:5 в молекулярной воде.
- Как и в разделе 4, аккуратно перенесите обшивки и удалите вторичную смесь из нарезанной ткани.
- Промывайте образцы в 500 мкл промывочного буфера А
- Для культивируемых клеток промыть 2 раза в течение 5 мин. Для нарезанной ткани промыть 2 раза в течение 10 мин. Используйте мягкое перемешивание на орбитальном шейкере для обоих.
- За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
- Удерживая лигазу на холодной блокаде, разбавьте лигазу 1:40 в лигативном материале со стадии 5.1. Выполните это разведение непосредственно перед добавлением лигазы в образцы.
- Как и в разделе 4, удалите как можно больше промывочного буфера А из образцов перед добавлением лигазы.
- Для культивируемых клеток: Перенесите крышки обратно в парафильмированную чашку Петри. Добавьте 40 мкл лигативной смеси в обшивки, разложите небольшие наполненные водой чашки Петри вокруг обложек и накройте большую чашку Петри.
- Для нарезанной ткани: Добавьте 250 мкл лигационной смеси с этапа 5,4 в каждую лунку и накройте пластину.
- Инкубируйте образцы в течение 30 мин при 37 °C.
6. Усиление
- Смешайте усилительный материал 1:5 в воде молекулярного класса.
- Как и в разделе 4, аккуратно переложите обшивки и удалите лигационную смесь из нарезанной ткани.
- Промывка образцов в 500 мкл промывочного буфера А
- Для культивируемых клеток промыть 2 раза в течение 2 мин. Для нарезанной ткани промыть 2 раза в течение 10 мин. Используйте мягкое перемешивание на орбитальном шейкере для обоих.
- За это время поменяйте парапленку в большую чашку Петри
- Выполняйте это разведение непосредственно перед добавлением полимеразы в образцы. Удерживая полимеразу на холодном блоке, разбавляют полимеразу
- Для культивируемых клеток разбавляют полимеразу 1:80 в амплификационном материале с этапа 6.1.
- Для нарезанной ткани разводят полимеразу 1:40 в амплификационном материале из шага 6.1.
- Как и на этапе 4, удалите как можно больше промывочного буфера А из образцов перед добавлением полимеразы.
- Для культивируемых клеток: Перенесите крышки обратно в парафильмированную чашку Петри. Добавьте 40 мкл амплификационной смеси из шага 6.4.1 в крышки, расположите небольшие наполненные водой чашки Петри вокруг обложек и накройте большую чашку Петри. Инкубируйте образцы в течение 100 мин при 37 °C.
- Для нарезанной ткани: Добавьте 250 мкл амплификационной смеси из шага 6.4.2 в каждую лунку и накройте пластину. Инкубировать образцы в течение 2 ч при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени подготовьте и пометьте слайды.
7. Монтаж
- Как и на шаге 4, аккуратно переложите крышки и удалите амплификационную смесь из нарезанной ткани.
- Промыть образцы в 500 мкл промывочного буфера В 2 раза в течение 10 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
- Промывайте образцы в 500 мкл 1% промывочного буфера B в течение 1 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
- Для культивируемых клеток:
- Перетащите 3 мкл монтажного носителя на слайд
- Отсоедините лишний буфер промывки от крышки, а затем поместите крышку (ячейками вниз) в монтажный носитель. Запечатайте боковые стороны небольшим количеством прозрачного лака для ногтей, чтобы запечатать крышку на месте.
- Для нарезанной ткани:
- Аккуратно переложите кусочек ткани на подготовленный слайд и расположите его, чтобы ломтик лежал ровно. Капля между 5-10 мкл монтажного носителя (количество будет зависеть от размера среза) на срез ткани
- Осторожно поместите стеклянную крышку поверх среза ткани и запечатайте небольшим количеством прозрачного лака для ногтей вдоль края, чтобы запечатать крышку на месте.
- Подождите не менее 15 минут, прежде чем анализировать под микроскопом, или храните при -20 °C.
8. Получение цифровых изображений с помощью конфокального микроскопа
- Оптимизируйте параметры сбора (например, мощность лазера, усиление, смещение) для всех образцов из всех методов лечения. Убедитесь, что оптимизация включает в себя уменьшение фонового шума и усиление сигнала без перенасыщения интенсивности флуоресцентных сигналов. После определения параметров примените одинаковые параметры сбора ко всем полученным изображениям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие сведения о приобретении могут быть использованы с конфокальным микроскопом Nikon A1 и программным обеспечением Nikon NIS AR Elements. - Установите слайд с образцом на сцене и найдите фокальную плоскость для образца с помощью DAPI через окуляр.
- Выключите порт глаз, щелкнув порт Eye и выбрав кнопку оптической конфигурации для настройки настроек.
- Отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера для каждого флуоресцентного канала, чтобы уменьшить фоновый шум и улучшить флуоресцентный сигнал. Убедитесь, что флуоресцентный сигнал не становится перенасыщенным, как указано в шагах 8.5-8.6.
- Мониторинг перенасыщения с помощью псевдоцвета для флуоресцентного сигнала. В нижней части живого изображения щелкните правой кнопкой мыши вкладку, помеченную флуоресцентным каналом, используемым в данный момент.
- Затем выберите «Раскраска канала» и выберите псевдоцвет, например «Rainbow Dark», чтобы визуализировать интенсивность флуоресценции в псевдоцвете, похожем на тепловую карту. В Rainbow Dark более холодные цвета указывают на меньшую интенсивность флуоресценции, а более горячие цвета указывают на большую интенсивность флуоресценции.
- После оптимизации всех флуоресцентных каналов щелкните правой кнопкой мыши ранее выбранную кнопку оптической конфигурации и выберите «Назначить текущую настройку камеры» для этой кнопки.
- Убедитесь, что выбранные параметры достаточны для случайной выборки из каждой группы лечения. Если выбранные параметры перенасыщают любой из этих образцов, повторите шаг 8.4, чтобы устранить перенасыщение.
- Для культивируемых нейронов выполните шаги 8.10-8.16.
- Используя глазной порт, ищите нейрон с дендритами, которые имеют минимальное перекрытие с другими дендритами.
- Выключите глазной порт и используйте канал DAPI для визуализации клеточного тела выбранного нейрона. Дважды щелкните по центру сомы, чтобы центрировать нейрон в середине поля зрения.
- Используя канал MAP2, найдите наилучшую плоскость фокусировки для сигнала MAP2 с помощью сканирования в реальном времени.
- На вкладке ND Acquisition нажмите «Сохранить в файл» и выберите файл для сохранения изображения в разделе «Обзор». Затем введите имя файла.
- На вкладке Z выберите параметр Симметричный режим, определяемый диапазоном . Установите фокус на лучшую плоскость MAP2 и нажмите кнопку Relative , чтобы установить эту фокальную плоскость в качестве середины z-стека.
- Установите диапазон на 5 мкм с шагом 1 мкм и убедитесь, что установлен флажок Закрыть активный затвор во время движения Z. На вкладке Длина волны выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора в разделе Optical Conf. Затем нажмите «Выполнить сейчас».
- Повторите шаги 8.1.10-8.1.15 примерно для 10 нейронов на обшивку/обработку.
- Для нарезанной ткани выполните шаги 8.18-8.22.
- Используя глаз-порт, найдите интересующий регион. Например, найдите CA1 гиппокампа.
- Выключите глазной порт и используйте канал MAP2, чтобы найти наилучшую плоскость фокусировки для сигнала MAP2 с помощью сканирования в реальном времени.
- В меню «Получение» выберите « Сканировать большое изображение». Затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных на панели «Захват» на открывшейся панели. Кроме того, убедитесь, что выбрана правильная цель в этой панели.
- Под панелью « Область» и окуляром с помощью клавиш со стрелками установите границы интересующей области. Затем нажмите «Сохранить большое изображение в файл» и создайте путь к сохранению имени файла для изображения.
- На панели «Настройка» убедитесь, что установлен флажок «Многоканальный захват», а затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных в разделе Optical Conf.
ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек для большого изображения возможен, но увеличит время сканирования.
9. Анализ
- Подобно настройкам сбора, используйте образцы из всех методов лечения для оптимизации пороговых значений. Убедитесь, что пороговая оптимизация фокусируется на уменьшении фонового шума и улучшении сигнала без перенасытки интенсивности флуоресцентных сигналов. После определения этих настроек примените одинаковые пороговые значения ко всем изображениям, используемым для анализа, как описано в шагах 9.2-9.3.
- В ImageJ параметр порога находится в меню Image > Adjust > Threshold. Выберите параметр «Темный фон», если изображение имеет темный фон.
- Затем отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога в соответствии с ранее определенными оптимизированными настройками порога, затем нажмите «Применить».
- Для культивируемых клеток используйте канал MAP2 и инструмент «Область интереса от руки» (ROI), чтобы нарисовать ROI для каждого нейрона, включая дендриты и сому. Для нарезанной ткани нарисуйте свободную рентабельность инвестиций в изображение среза, которое инкапсулирует интересующую область (например, радиативный слой CA1 в гиппокампе).
- Получите площадь ROI. В ImageJ измерьте область в меню Анализ > Мера.
- Определите количество пункты в каждой рентабельности инвестиций с помощью автоматического инструмента обнаружения, такого как анализ частиц в ImageJ, выполнив шаги 9.7-9.9.
- Найдите опцию Анализ частиц в меню Анализ > Анализ частиц. Во-первых, определите диаметр размера пункты, обычно 0,1-3 мкм2.
- Затем выберите параметр «Наложенные маски» в раскрывающемся меню «Показать» и установите флажок «Результаты отображения». Затем нажмите OK.
- Если пункта не обнаружена с выбранным диапазоном диаметров, отрегулируйте диапазон до тех пор, пока все пункты не будут обнаружены с помощью этого анализа. Убедитесь, что для всех изображений используются одинаковые настройки анализа частиц.
- Разделите число пунктуров на область отдельной интересующей области, выполнив шаги 9.11-9.13.
- Скопируйте и вставьте результаты для каждого изображения из всплывающего окна «Результаты» из ImageJ в электронную таблицу.
- Во-первых, определите, из какого файла и образца были получены данные. Затем разделите площадь ROI на количество пунктуй.
- Затем очистите данные во всплывающем окне «Результаты» и повторите шаги 9.2–9.12.
- Нормализация результатов для контрольных образцов: Усреднение результатов (количество зон пункты/ROI) для контрольных образцов. Затем разделите полученные результаты всех образцов на среднее значение контроля для получения нормированных результатов. Новое среднее значение контрольных образцов должно быть равно 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные, модифицированные из Heaney et al.6 , представлены для демонстрации эксперимента, в котором ожидается увеличение образования синапсов (см.6 для получения дополнительной информации и более подробного обсуждения механизма). Ранее было продемонстрировано, что быстрые антидепрессанты требуют активации ингибирующего метаботропного рецептора, GABAB (гамма-аминомасляный подтип B), чтобы бытьэффективными 13. Кроме того, предыдущие данные указывали на то, что быстрые антидепрессанты увеличивают постсинаптические маркеры14; Таким образом, DetectSyn был использован для проверки гипотезы о том, что быстрые антидепрессанты увеличивают количество синапсов, чтобы быть эффективными.
В культивируемых нейронах тестируются четыре условия. Во-первых, на верхней панели рисунка 2А культивируемые нейроны обрабатывали транспортным средством в тех же условиях, что и экспериментальный контроль. Тем не менее, первичное антитело PSD95 опущено для обеспечения технического контроля для анализа DetectSyn (см. Рисунок 1 для того, чтобы узнать, как каждый компонент вносит свой вклад в сигнал). Затем, на панели управления, нейроны снова обрабатываются транспортным средством, но получают как PSD95, так и Synapsin1 первичные. Далее культивируемые нейроны лечат только быстрым антидепрессантом Ro-25-6981 (Ro) или Ro плюс агонист GABAB, баклофен (Bac). Как было ранее продемонстрировано13, для эффективности Ro-25-6981 in vitro необходимы как быстрый антидепрессант Ro-25-6981, так и агонист GABAB баклофен. Таким образом, увеличение образования синапсов демонстрируется увеличением белой пункции (рисунок 2А). Без баклофена не наблюдается увеличения образования синапсов in vitro .
In vivo базальные уровни ГАМК достаточны для работы быстрого антидепрессанта13, поэтому только быстрый антидепрессант Ro-25-6981 вводится через внутрибрюшинную инъекцию мышам (рисунок 2B). Левая панель на рисунке 2B представляет собой еще один технический элемент управления для анализа DetectSyn. Ткань гиппокампа от мыши, обработанной физиологическим раствором, была прощупана обоими первичными для PSD95 и Synapsin1, но один из вторичных был опущен. Увеличение образования синапсов из-за лечения быстрым антидепрессантом Ro-25-6981 по сравнению с мышами, обработанными физиологическим раствором, продемонстрировано на средней и правой панелях рисунка 2B.
Показаны репрезентативные изображения для технического контроля in vitro и ex vivo . На рисунке 2A опущен один из первичных для синаптических пар (т.е. PSD95), а на рисунке 2B опущен один из второстепенных. В то время как некоторые пункты появляются на изображениях технического контроля, они, как правило, не имеют одинакового размера, как показано белым пятнышком на верхней панели рисунка 2A по сравнению с большой пунктуй на других панелях. Кроме того, эти пункты не находятся в том же месте, что и пункта, как показано некоторыми пунктами, появляющимися в соме технического контроля на рисунке 2B. Как правило, неспецифические пункции возникают внутри ядер, возможно, из-за присутствия ДНК.
Для анализа репрезентативных результатов на рисунке 2A дендриты (визуализированные окрашиванием MAP2 и представленные здесь серым контуром) были прослежены с помощью инструмента рисования от руки для создания областей интереса (ROI). Во-первых, область ROI MAP2 была получена с помощью функции NIS Elements, ROI Data на вкладке «Автоматизированные результаты измерений ». Затем puncta были обнаружены с помощью функции Thresholding в NIS Elements. Эта функция создает двоичную маску объектов, которые попадают в заданный порог интенсивности. Затем количество двоичных объектов в ROI MAP2 было обнаружено с помощью функции NIS Elements Binary in ROI на вкладке «Автоматические результаты измерений ». Данные, представленные на графике справа от рисунка 2A , представляют собой нормализованные значения пункты, деленные на площадь ROI.
Чтобы проанализировать репрезентативные результаты на рисунке 2B, радиатовый слой CA1 был прослежен с помощью инструмента рисования от руки для создания ROI. Во-первых, область ROI была получена с помощью функции данных ROI, как описано в пункте выше. Затем пункции были обнаружены с помощью функции Spot Detection - Bright Spots , расположенной в меню Binary . Затем значения диаметра и контрастности были выбраны на основе визуального осмотра нескольких срезов из всех обработок. Как только эти значения были определены, они были применены единообразно ко всем анализируемым изображениям. Функция Обнаружения пятен создает двоичные маски объектов в пределах заданного набора параметров диаметра и контрастности. Затем количество двоичных объектов в ROI MAP2 было обнаружено с помощью функции NIS Elements Binary in ROI на вкладке «Автоматические результаты измерений ». Данные, представленные на графике справа от рисунка 2B , представляют собой нормализованные значения пункты, деленные на площадь ROI.
Рисунок 2: Обнаружение синапсов с помощью анализа DetectSyn. Белые пункты представляют собой синапсы, обнаруженные с помощью анализа бесконтактного лигирования DetectSyn PSD95-Synapsin1 (желтые наконечники стрел) в (A) in vitro культивируемых первичных нейронах гиппокампа и (B) ex vivo CA1 stratum radiatum. В (A) серый контур представляет окрашивание MAP2. В (A) верхняя панель с маркировкой PLA представляет образцы, обработанные только транспортным средством, например Control. Однако первичное psd95 не было включено в реакцию. На последних двух панелях нейроны обрабатывали быстрым антидепрессантом Ro-25-6981 (Ro, 10 мкМ) или Ro плюс агонист GABAB баклофен (Bac, 50 мкМ) в течение 90 мин. Повышенное количество пункты (идентифицированной желтыми наконечниками стрел) указывает на то, что in vitro образование синапсов увеличивается только при быстром введении антидепрессанта Ro-25-6981 с агонистом GABAB. В (B) зеленый представляет дендриты, окрашенные MAP2, а синий представляет ядра, окрашенные DAPI. Одиночные дендриты, очерченные желтыми прямоугольниками на объединенных изображениях, изолированы под репрезентативными изображениями, чтобы продемонстрировать, что пункты локализуются в дендриты. Животных обрабатывали Ro-25-6981 (10 мг/кг), а ткани собирали через 45 мин после лечения. Повышенное количество пункты (идентифицированной желтыми наконечниками стрелок) указывает на то, что in vivo количество синапсов увеличивается при базальной передаче сигналов ГАМК и быстром антидепрессанте Ro-25-6981. Количественная оценка репрезентативных результатов представлена гистограммами и показывает среднее количество пункты DetectSyn, деленной на область MAP2. Результаты нормируются для экспериментального контроля. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Nikon A1plus. Шкала стержней = (А) 10 мкм; (B, сверху) 50 мкм; (B, дно) 5 мкм. Столбцы представляют среднюю +/- стандартную погрешность среднего значения. Результаты анализируются односторонним ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 методом пост-хок анализа. Рисунок был изменен по сравнению с Heaney et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DetectSyn - это быстрый анализ, который использует анализ бесконтактного лигирования для обнаружения белков в пределах 40 нм друг от друга, что позволяет обнаруживать образование синапсов. Этот метод улучшает текущие флуоресцентные анализы, которые служат только в качестве прокси-измерений для образования синапсов. DetectSyn обнаруживает поддающиеся количественной оценке изменения в синаптических белках, локализованных в пределах 40 нм, то есть в синаптической щели, друг от друга. Кроме того, DetectSyn является более экономически эффективным и занимает меньше времени, чем такие методы, как электронная микроскопия и массивная томография, предназначенные для измерения синапсов и классически обозначенные как методы золотого стандарта.
DetectSyn - это очень настраиваемый метод. Любая синаптическая пара может быть использована для идентификации образования определенных типов синапсов, если белковая пара находится в пределах 40 нм друг от друга. Хотя этот захватывающий метод имеет много применений, необходимо позаботиться о проверке антител, включая оптимальную блокировку и условия первичной инкубации, и продолжать поддерживать их результаты с использованием других методов, таких как иммунофлуоресценция. Предлагается проводить эти поддерживающие эксперименты в отдельных экспериментах, которые не используют DetectSyn для снижения конкуренции за связывание антител (например, использование козьего анти-PSD95 и мышиного анти-PSD95 в одном и том же эксперименте может уменьшить связывание из-за конкуренции). Кроме того, позаботьтесь о выборе первичных антител, выращенных у разных хозяев, например, козьий анти-PSD95 и кролик анти-Synapsin1. Если для обоих праймериз используется один и тот же хост, вторичные зонды не будут различать два праймериз.
Кроме того, поскольку бесконтактное лигирование имеет стадию усиления, существует ограниченная информация, которую можно извлечь из полученной пункции. Например, наблюдаются пункты разного размера (показано на рисунке 2B), что свидетельствует об изменении размера синапса или нескольких синапсах, набранных в одну и ту же область. Однако, несмотря на то, что каждый образец в эксперименте подвергается одним и тем же условиям, этап амплификации затрудняет категоричные выводы.
Наконец, критические шаги для этого протокола включают обеспечение того, чтобы лигаза и полимераза оставались на ледяной глыбе и как можно быстрее добавлялись в образцы. Кроме того, включение технического контроля поможет определить, где в данном эксперименте могут появиться неспецифические пункты. Например, как показано на рисунке 2B, пункты внутри ядер видны в технических органах управления. Таким образом, крайне важно включить отрицательный или технический контроль, чтобы гарантировать, что сигнал, обнаруженный в экспериментальных образцах, больше, чем тот, который наблюдается в этих контрольных группах. Как правило, эти технические средства контроля получаются путем пропуска одной из первичных или вторичных пар. Наконец, убедитесь, что температура инкубации составляет 37 °C, начиная со вторичной стадии.
Важно отметить, что DetectSyn предоставляет доступный способ практически для любой лаборатории, имеющей доступ к стандартному флуоресцентному микроскопу, независимо от технического опыта, для изучения синаптопатологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения NINDS R01 NS105005 (KRG) и NS105005-03S1 (KRG), Министерством обороны USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), а также грантом от FRAXA Research (CFH) и Ассоциации Альцгеймера, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
