Summary
由于测序技术的广泛使用，在蚊子中发现了许多新的病毒样序列。我们提供了一种使用脊椎动物和蚊子细胞系分离和扩增病毒的有效程序，这可能作为未来研究蚊子相关病毒（包括蚊媒和蚊子特异性病毒）的基础。
Abstract
随着测序技术的广泛应用，在包括蚊子在内的节肢动物中发现了许多新型病毒样序列。这些新的蚊媒病毒的两个主要类别是“蚊媒病毒（MBV）”和“蚊媒病毒（MSV）”。这些新型病毒可能对脊椎动物和蚊子都有致病性，或者它们可能只是与蚊子共生。实体病毒对于确认这些病毒的生物学特征至关重要。因此，这里描述了从现场收集的蚊子中分离和扩增病毒的详细方案。首先，制备蚊子样品作为蚊子匀浆的上清液。离心两次后，将上清液接种到蚊子细胞系C6/36或脊椎动物细胞系BHK-21中进行病毒扩增。7天后，收集上清液作为P1上清液并储存在-80°C。 接下来，P1上清液在C6 / 36或BHK-21细胞中再传代两次，同时每天检查细胞状态。当发现细胞的细胞致病作用（CPE）时，收集这些上清液并用于鉴定病毒。该协议是未来研究蚊子相关病毒（包括MBV和MSV）的基础。
Introduction
蚊子是一组重要的致病性节肢动物媒介。Culicidae1，2家族中大约有3，500种蚊子。高通量测序技术的发展导致在世界不同地区的蚊子中发现了许多新的病毒样序列3。一般来说，这些蚊子相关病毒可分为两大类：MBV和MSV。
MBV是一组不同的病毒，是许多人类或动物疾病的病原体，例如黄热病病毒（YFV）、登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）和裂谷热病毒（RVFV）4。它们严重威胁着公众健康，导致全世界人类和动物的严重发病率和死亡率。MBV通过从受感染的蚊子传播到幼稚的宿主，以及从病毒感染的宿主和进食的蚊子的传播，自然地维持不同宿主之间的生命周期5。因此，这些病毒可以在实验室中感染蚊子细胞系和脊椎动物细胞系1。
MSV包括宜昌病毒（YCN）、黄库蚊病毒（CxFV）和朝阳病毒（CHAOV），是昆虫特异性病毒1，6，7的一个亚组。近年来，新型MSV的发现有所增加，其中一些MSV被发现对MBV的传播有影响。例如，CxFV可能是毛库蚊的持续感染，可以在早期阶段抑制西尼罗河病毒的复制8。已发现另一种昆虫特异性黄病毒，细胞融合剂病毒（CFAV）可抑制DENV和寨卡病毒（ZIKV）在埃及伊蚊中的繁殖9。因此，该协议是分离蚊子相关病毒的有用方法，可以帮助进一步研究与蚊子相关的病原体的分布和控制蚊媒疾病的控制。
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Protocol
1. 蚊虫采样和分类
- 通过现场的轻型捕蚊器MXA-02或二氧化碳捕蚊器诱捕成年蚊子。
- 通过浸入液氮10，11杀死收集的蚊子。通过冷链物流系统将它们运送到实验室12.
注意：干冰主要用于冷链物流系统。 - （可选）如果样品地点靠近实验室，则直接将网捕器中的活蚊子送到实验室，并通过在≤-20°C冷冻30分钟来对它们实施安乐死4。
- 通过工具书13 对收集到的蚊子进行形态学鉴定，以进行蚊子的分类和鉴定。
注意：如有必要，DNA条形码可用于分类和识别蚊子14，15。 - 根据采样日期和位点，将它们分配到不同的池中，然后将它们储存在 2-5 mL 管中。
- 绘制一个表格，记录每个管子的蚊子种类、数量、采样代码、日期和地点。
- 打印带有采样代码的标签并将其贴在试管上。
- 将装有蚊子样品的管保持在-80°C，直到进一步分析。
2. 蚊子研磨
- 将 20-50 只蚊子放入每个 2 mL 无菌管中，其中装有 3 mm 陶瓷珠和含有 1.5 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基，含有 2% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液。
注意：将试管放在冰块上。 - 用低温组织均质器均质蚊子，在4°C下以70Hz研磨30秒，进行三个循环16。
- 将混合物在4°C下以15，000× g 离心30分钟，并将上清液转移到新管中。
- 将上清液在4°C下再次以15，000× g 离心10分钟，以除去蚊子碎片12，17。
注意：如有必要，可以使用0.22μm过滤器过滤上清液。 - 将上清液（P0）分装到2 mL螺帽储存管（每管200μL）中，并将其储存在-80°C。
3. 细胞和细胞培养维持培养基的制备
注意：蚊子细胞系C6 / 36（白纹伊蚊 RNAi缺陷）和脊椎动物细胞系BHK-21（小仓鼠肾）用于病毒扩增和分离。
- 将1×106 C 6 / 36细胞接种到75cm 2烧瓶中，其中10mL RPMI培养基补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）在28°C在5%CO2加湿培养箱中。
- 将 1 × 106 BHK-21 细胞接种到 75 cm 2 烧瓶中，在 5% CO2 加湿培养箱中接种 10 mL 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM），补充有 10% FBS 和 1% P/S。
注意：细胞每周传代两到三次17，18。 - 将培养在75cm2 烧瓶（C6 / 36或BHK-21细胞）中的细胞接种到24孔板中（每孔C6 / 36：1.4×105;每孔BHK-21：0.8×105）。
- 将24孔板置于28°C或37°C过夜。
- 在显微镜下观察细胞，确认每个孔中的细胞汇合度是否为80%-90%。
- 准备细胞培养维持培养基（500 mL）。
注意：对于C6 / 36，培养基是补充有2%FBS和2%青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B溶液的RPMI培养基。对于BHK-21，培养基是补充有2%FBS和2%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的DMEM培养基。
4. 病毒隔离
注意：所有步骤均在生物安全2级（BSL-2）实验室进行。生物安全实验室的安全等级要求是根据不同国家和地区的法规，通过生物安全风险评估确定的。该过程必须在生物安全柜中进行。
- 从 24 孔板中取出细胞培养基，并向每个孔中加入 100 μL 细胞培养维持培养基和 100 μL 蚊子匀浆 （P0） 的上清液。
- 将板在28°C或37°C孵育60分钟，每15分钟轻轻摇动一次以防止细胞干燥。
- 除去上清液，并用 600 μL 细胞培养维持培养基轻轻冲洗每个孔，以完全去除碎片。
- 向每个孔中加入 800 μL 细胞培养维持培养基，并将板保持在 28 °C 或 37 °C 的 5% CO2 加湿培养箱中 7 天。
- 每天在显微镜下监测每个孔的细胞状态15。
- 在第7天收集 细胞的上清液（P1上清液），并将上清液储存在-80°C。
- 重复步骤4.1-4.6 2x以获得P2和P3上清液。
注意：在步骤4.3中，P2和P3可选择用600μL细胞培养维持培养基轻轻冲洗每个孔。 - 取决于哪个孔显示细胞致病效应（CPE） - 细胞死亡，脓肿并从表面分离;与邻近细胞融合形成合胞体;或出现核或细胞质包涵体 — 将 300-400 μL 该 CPE 孔的上清液添加到含有细胞的新 6 孔板的每个孔中（细胞汇合度为 80%-90%）以大大扩增病毒。
- 收集上清液并将其等分到 2 mL 螺旋盖储存管（每管 500 μL）中。将它们储存在-80°C。
注意：在细胞中连续传代三代后，丢弃未诱导CPE的样品。如有必要，可以增加细胞中连续传代的世代。
5. 通过RT-PCR检测病毒序列
- 使用病毒 RNA 迷你试剂盒从 200 μL 病毒上清液中提取总 RNA16。
注意：此处使用自动核酸提取系统按照仪器制造商的说明提取总RNA。 - 使用 PCR 仪器按照 RT-PCR 试剂盒说明将 RNA 转换为 cDNA。
- 将 15 μL RNA 与 1 μL 随机引物混合加入 PCR 管中。将管子在70°C放置5分钟，然后将其放在冰上5分钟。
- 向管中加入 5 μL 5x 缓冲液和 25 μL 混合物（10 mM dNTP、40 U/μL RNase 抑制剂和 200 U/μL M-MLV），并将管在 42 °C 下放置 60 分钟和 95 °C 放置 10 分钟。
- 将试管储存在-20°C。
- 使用PCR试剂盒和通用引物（表1）通过PCR检测病毒。
- 对于虫媒病毒，使用以下组分设置 PCR 反应系统（总计 30 μL）：3 μL 10x Taq 缓冲液、3 μL dNTP （1mM）、1 μL 正向引物 （10 μm）、1 μL 反向引物 （10 μm）、0.3 μL Taq （10 U/μL）、19.7 μL ddH 2 O 和2μL cDNA。
- 对于黄病毒的检测，将反应过程设置为：阶段1：35个循环，94°C持续30秒，52°C持续30秒，72°C持续30秒;第2阶段：72°C10分钟。
- 对于甲病毒的检测，将反应过程设置为：第一阶段：35次循环，94°C持续30秒，50°C持续30秒，72°C持续30秒;第2阶段：72°C10分钟。
- 对于布尼亚病毒的检测，将反应过程设置为：阶段1：35个循环，94°C持续30秒，50°C持续30秒，72°C持续30秒;第2阶段：72°C10分钟。
- 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并送去进行测序分析。
注意：如果条件允许，可以对上清液进行下一代测序分析，以识别新病毒并获得整个病毒基因组序列。
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Representative Results
用蚊子匀浆（P0）的上清液接种后，C6 / 36细胞表现出广泛的细胞间空间，并且在120小时（图1A）与未接种的细胞（对照）相比观察到脱落的细胞（图1B）同时（图1B）。将BHK-21细胞与P3上清液孵育后，与对照细胞（图1D）相比，在48小时（图1C）在BHK-21细胞中观察到可见的CPE。进行PCR以确定病毒种类。用于检测黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒的通用引物是商业合成的（表1）。将布尼亚病毒埃比努尔湖病毒的PCR产物设置为阳性对照，并添加到泳道1中。使用布尼亚病毒、黄病毒和甲病毒的通用引物生成病毒上清液的PCR产物，然后分别将其添加到泳道2、3和4中。黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒的PCR产物估计大小分别为266 bp、434 bp和251 bp。条带仅在泳道 2 和阳性对照泳道 1 中可见。因此，上清液中的病毒很可能是布尼亚病毒（图2）。
图1：用病毒上清液孵育后细胞的CPE观察。 感染后120小时C6/36细胞的状态（CPE）（A）和对照细胞同时的状态（B）。BHK-21细胞在48 hpi（C）和对照细胞（D）的状态。比例尺 = 100 μm。缩写：CPE = 细胞致病作用;HPI = 感染后数小时。 请点击此处查看此图的大图。
图2：病毒上清液的PCR结果。 泳道 1 代表布尼亚病毒（埃比努尔湖病毒）的阳性对照。泳道2-4使用布尼亚病毒（251 bp）、黄病毒（266 bp）和甲病毒（434 bp）的通用引物表示上清液的PCR结果。 请点击此处查看此图的大图。
| 病毒 | 底漆 | 寡核苷酸（5'→3'） | PCR产物的大小（bp） | ||
| 黄病毒 | F1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA | 266 | ||
| F2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| 甲病毒 | M2w | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| 布尼亚病毒 | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
表 1：虫媒病毒检测的通用引物。
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Discussion
该方法的目的是提供一种使用各种细胞系分离蚊子相关病毒的实用方法。将抗生素 - 抗真菌剂（青霉素 - 链霉素 - 两性霉素）添加到蚊子匀浆的上清液中以避免被细菌或真菌污染至关重要。在田间获得的蚊子和病毒上清液必须在-80°C下冷藏，以避免反复冻融循环。
协议中的另一个关键步骤是研磨。蚊子样本应彻底粉末化并储存在冰上。地面不足的蚊子组织可诱发细胞死亡，并可能扭曲CPE分析的结果。在病毒分离之前，有必要使用普通蚊子来确认研磨参数。研磨必须在低温下进行，以防止病毒在此过程中变得不活跃。
这种方法可以有效地分离和扩增蚊子相关病毒，但仅适用于可能在哺乳动物或昆虫细胞系中显示CPE的病毒。此方法不适用于不诱导 CPE 的病毒。使用该协议，我们可以获得仅包含一种病毒类型或与不同病毒的混合物的候选病毒。进一步的研究 - 病毒纯化，形态学鉴定和斑块分析 - 仍然需要获得纯化的病毒。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了武汉市科技计划项目（2018201261638501）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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