Summary
Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.
Abstract
Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM'ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM'ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1'in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1'deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 80.000'den fazla insanı etkilemektedir1. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) 2,3,4'ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, kemoterapi veya immünoterapiye yanıtları tahmin etmek için klinik olarak onaylanmış biyobelirteçler mevcut değildir. Mesane kanseri progresyonunu yönlendiren mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilecek ve farklı tedavi modaliteleri için prediktif biyobelirteçler geliştirebilecek bilgilendirici preklinik modeller üretmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Mesane translasyonel araştırmalarında önemli bir engel, insan mesane kanseri patogenezini ve tedavi yanıtlarını özetleyen preklinik modellerin bulunmamasıdır 5,6. İn vitro 2D modeller (hücre hatları veya şartlı olarak yeniden programlanmış hücreler), in vitro 3D modeller (organoidler, 3D baskı) ve in vivo modeller (ksenogreft, kanserojen kaynaklı, genetik olarak tasarlanmış modeller ve hasta kaynaklı ksenograft) dahil olmak üzere çoklu klinik öncesi modeller geliştirilmiştir2,6. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM'ler), tümör fenotiplerinin analizleri, aday genlerin ve / veya sinyal yolaklarının mekanik araştırmaları ve terapötik yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi dahil olmak üzere mesane kanseri biyolojisindeki birçok uygulama için yararlıdır 6,7. GEMM'ler, bir veya daha fazla tümör baskılayıcı gendeki genetik delesyonları kontrol etmek için bölgeye özgü rekombinazları (Cre-loxP) kullanabilir. Çoklu gen delesyonları ile istenen GEM'leri üretme süreci zaman alıcı, zahmetli ve pahalıdır5. Bu yöntemin genel amacı, üçlü flokslu aleller (Trp53, Pten ve Rb1)8 taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinden mesane üçlü nakavt (TKO) modellerinin oluşturulması için hızlı ve etkili bir ex vivo Cre dağıtım yöntemi geliştirmektir. Exvivo yönteminin en büyük avantajı hızlı iş akışıdır (yıllarca fare yetiştiriciliği yerine 1-2 hafta). Bu makalede, immünkompetan C57 BL/6J farelerde floksed aleller, ex vivo adenovirüs transdüksiyonu, organoid kültürler ve in vitro ve in vivo karakterizasyon ile normal ürotelyal hücrelerin toplanması için protokol anlatılmaktadır. Bu yöntem, floksed alellerin herhangi bir kombinasyonunu barındıran immünkompetan farelerde klinik olarak ilgili mesane kanseri organoidleri üretmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (1395M, Biyogüvenlik 180501 ve 180502).
NOT: Adım 1-3'ü aynı gün gerçekleştirin.
1. Fare mesanesinin diseksiyonu
- Diseksiyon için hazırlık
- Makas, forseps, steril DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri 35 mm kültür tabaklarda, %70 etanol, steril gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın. Diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin. Erkek üçlü flokslu fareler üretin Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f (4 fare, 10 haftalık), daha önce Dr. Goodrich'in laboratuvarında açıklandığı gibi 8.
- Ötenazi ve kesi
- Fareleri 2.0 L / dak akış hızı kullanarak CO2 boğulması ile ötenazileştirin, ardından servikal çıkık gelir. Diseksiyon alanını% 70 etanol ile temizleyin ve temiz bir kağıt havlu ile örtün.
- Fareyi diseksiyon alanındaki gazlı bezin üzerine yerleştirin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün ve mesaneye maruz kalan daha düşük bir orta hat karın kesisi yapmak için steril diseksiyon makası kullanın.
- Mesanenin diseksiyonu
- Mesaneyi kavramak için forseps kullanın ve bilateral üreterovezik kavşakların tanımlanması için yavaşça yukarı çekin. İki üreter açıklığı arasındaki sınır çizgisini takip ederek mesane fundusunu çıkarmak için makas kullanın.
- Mesaneyi, 2 mL DPBS içeren steril bir kaba aktarın. Yağ ve bağ dokusunu çıkarın ve mesaneyi steril 2 mL DPBS içeren yeni bir kaba koyun. Bu zamanda, adenovirüsü -80 ° C depodan çıkarın ve buz üzerinde tutun.
2. Ürotelyal hücrelerin ayrışması
- Hücre ayrışması için hazırlık
- Forseps, cerrahi neşterler (saplı 10 boyutlu bıçak), 35 mm kültür tabaklarında steril DPBS, CCM(-) olarak tanımlanan kömürden arındırılmış FBS içermeyen komple kültür ortamı, kollajenaz/hyaluronidaz karışımı, tripsin yerine geçen rekombinant enzim, DPBS'de 10 μM taze Y-27632 ile %10 odun kömürü soyulmuş FBS, 100 μm steril hücre süzgeci ve 15 mL santrifüj tüpü dahil olmak üzere tüm steril aletleri hazırlayın.
NOT: Tam kültür ortamı (CCM), sağlanan büyüme faktörleri ve% 5 odun kömürü soyulmuş FBS,% 1 L-glutamin ikamesi, 100 μg / mL primosin ve 10 μM taze Y-27632 ile desteklenmiş meme epitel hücresi büyüme ortamını içerir.
- Forseps, cerrahi neşterler (saplı 10 boyutlu bıçak), 35 mm kültür tabaklarında steril DPBS, CCM(-) olarak tanımlanan kömürden arındırılmış FBS içermeyen komple kültür ortamı, kollajenaz/hyaluronidaz karışımı, tripsin yerine geçen rekombinant enzim, DPBS'de 10 μM taze Y-27632 ile %10 odun kömürü soyulmuş FBS, 100 μm steril hücre süzgeci ve 15 mL santrifüj tüpü dahil olmak üzere tüm steril aletleri hazırlayın.
- Mesanenin kıyılması ve sindirilmesi
- Mesanenin 2 mL steril DPBS ile biyogüvenlik kabininde 35 mm'lik bir tabakta tekrar nakledilmesi ve yıkanması.
- Mesane dokularını dört fareden 1 mL CCM (-) içeren bir kaba toplayın ve cerrahi bir bıçak kullanarak her mesaneyi dört eşit parçaya bölün. Ürotelyum yüzeyini ortama maruz bırakmak için mesaneyi açmak için forseps kullanın.
- Mesane parçalarını ve ortamını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bulaşı 2 mL CCM (-) 2x ile yıkayın ve toplam 5 mL hacme kadar bir santrifüj tüpünde toplayın.
- Kollajenaz / hyaluronidaz karışımını 300 U / mL kollajenaz ve 100 U / mL hyaluronidaz nihai konsantrasyonuna ekleyin ve tüpü yatay olarak 37 ° C orbital inkübasyon çalkalayıcısına 200 rpm'de 30 dakika boyunca yerleştirin.
- Doku sindiriminden sonra, tüpe DPBS'de% 10 odun kömürü soyulmuş FBS'nin eşit hacmini (5 mL) ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin.
- Süper natantı çıkarın ve atın. Hücre peletine 2 mL tripsin ikamesi ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü 37 ° C'de bir hücre inkübatörüne ve% 5 CO2'ye 4 dakika boyunca koyun.
- Kuluçkadan sonra, standart bir P1000 ucu ile 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. DPBS'ye 5 mL'lik %10 odun kömürü soyulmuş FBS ekleyin.
- İlişkisiz hücreleri 100 μm steril hücre süzgeci ile süzün. Hücre süspansiyonunu ve santrifüjünü 5 dakika boyunca 200 x g'de toplayın.
- Hücreleri sayma ve yeniden başlatma
- Süper natantı çıkarın ve atın. Hücre peletini 1 mL CCM ile yeniden askıya alın.
- Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve 0.5 mL taze CCM ile 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna sadece 0.5 x 106 hücre plakası yerleştirin. Bu zamanda, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinin matris özlerini ( bakınız Malzeme Tablosu) -20 °C depolamadan çıkarın ve buz üzerinde çözün. 6 delikli bir plakayı 37 °C hücre inkübatöründe önceden ısıtın.
NOT: Kalan hücreler, virüs dışı iletim kontrolü için hücre peletleri olarak santrifüj edilebilir ve dondurulabilir.
3. Adenoviral transdüksiyon ve kaplama organoidleri
DİKKAT: Adenovirüsü işlerken lütfen dikkatli olun. Laboratuvar personeli biyogüvenlik seviye 2 uygulamalarını takip etmeli ve adenovirüsü %10 çamaşır suyu ile dezenfekte etmelidir.
- 24 delikli plakaya 2 μL adenovirüs (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU / μL) ekleyin. İlişkisiz ürotelyal hücrelerle iyice karıştırın.
- Transdüksiyon etkinliğini artırmak için, 24 delikli plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ederek spinokülasyon gerçekleştirin. 24 delikli plakayı 37 ° C'de bir hücre inkübatörüne ve% 5 CO2'ye 1 saat boyunca yerleştirin.
- Hücreleri ve ortamı kuyudan 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süper nantantı çıkarın ve atın, 50 μL CCM ekleyin ve alttaki hücrelerle iyice karıştırın.
- 140 μL matris özü ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için hafifçe karıştırın. Çözeltiyi, organoidler için kubbeler oluşturmak üzere 50 μL/kubbede önceden ısıtılmış 6 delikli plakaya hızlı bir şekilde ekleyin.
- Plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatöre yavaşça aktarın ve kubbelerin 5 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. 6 delikli plakayı baş aşağı çevirin ve 25 dakika daha katılaşmaya devam edin.
- Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 2,5 mL CCM ekleyin ve plakayı organoid kültür için bir inkübatöre yerleştirin.
4. Organoid kültürleme ve pasaj
- Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Lee ve ark.9'da bildirildiği gibi organoid kültürleme, pasaj ve dondurma işlemlerini gerçekleştirin. Fujii ve ark.10'da açıklandığı gibi numune işleme jeli kullanarak organoidlerin gömülmesini gerçekleştirin.
- Ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 1 mL dispase ekleyin. Kubbeyi yavaşça kırın ve P1000 pipet ucuyla iyice karıştırın.
- Plakayı 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, tüm hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve kuyuyu DPBS'de 4 mL% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ile yıkayın. Organoid hücreler büyük kümeler halinde görünüyorsa, Adım 2.2.6'yı gerçekleştirin. ve Adım 2.2.7. ilişkisiz hücreler almak için.
- Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1 mL CCM ile yıkayın.
- Hücreleri% 70 matris ekstraktında yeniden askıya alın ve Adım 3.4.-3.6'yı izleyin. kültürleme için. Alternatif olarak, hücreleri %90 odun kömürü soyulmuş FBS ve %10 DMSO'da 10 μM taze Y-27632 ile takviye ederek kriyoprotekte edin.
5. Organoid hücrelerin deri altından C57BL / 6J fareye implantasyonu
- İmplantasyon için hazırlık
- İğnelerde 25G 1.5, 1 mL şırınga, 1 mg / mL dispaz, matris ekstresi, DPBS'de% 10 odun kömürü soyulmuş FBS'yi 10 μM taze Y-27632 ve 15 mL santrifüj tüpü ile hazırlayın.
- Organoid hücre toplama
- En az 5 pasaj için stabil bir kültür elde ettikten sonra, in vivo enjeksiyon için genişletilmiş organoid hücreleri toplayın. 4.2.-4.4 Adımlarını izleyin. ve 1 mL CCM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücrelerin sayımı ve deri altı enjeksiyonu
- Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjlemeden sonra, DPBS'de% 50 matris ekstraktının 100 μL'sinde 2 x 106 hücreyi yeniden askıya alın. Süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve bir hayvan prosedür odasındaki bir biyogüvenlik kabinine alın.
- İki erkek C57BL/6J fareyi (10 haftalık) %4 izofluran ve 1 L/dkO2 akışı ile bir odada yaklaşık 4 dakika boyunca anestezi altına alın. Fareler sağ reflekslerini kaybettikten ve solunum şekilleri daha derin ve daha yavaş hale geldiğinde, fareleri% 2 izofluran ve 1 L / dakO2 akışı ile yeniden solunmayan bir devreye aktarın. Hayvanların gözlerini travmatik yaralanmalardan korumak için veteriner merhem uygulayın.
- Farenin sağ kanadındaki enjeksiyon bölgesinin etrafındaki bir alanı tıraş edin ve% 70 etanol kullanın ve ardından 100 μL hücre süspansiyonunu anestezi altında sağ kanada doğrudan enjekte etmek için 25 G'lik bir iğne kullanın.
- Enjeksiyondan sonra, inhalasyonel anesteziyi çıkarın ve fareleri tamamen iyileşene ve harekete geçene kadar bir ısı lambasının altındaki bir kafese yerleştirin. Fareleri barınma için iade edin ve tümör oluşumunu izleyin.
6. Tümör toplanması ve in vivo yayılımı
- Hazırlık Adım 2.1.1'i izleyin. 2.0 L / dak akış hızı kullanılarak CO 2 boğulması ile fareleri ötenazileştirin ve ardından ~ 2.0 cm çapında (yaklaşık2-3 hafta) bir tümör oluştuktan sonra servikal çıkık izler. Fareleri temiz bir diseksiyon alanına aktarın, fare yan tümör alanına% 70 etanol püskürtün ve tümörü ayırmak için bir kesi yapmak için steril diseksiyon makası ve forseps kullanın.
- Tümörü 5 mL DPBS ile 60 mm'lik bir tabakta yıkayın ve bağ dokusunu çıkarmak için makas kullanın. Taze tümörün bir parçasını kesin ve DPBS'de% 4 paraformaldehit ile 48 saat boyunca batırın ve histoloji analizi için parafin gömme ve bölümleme için gönderin.
- Hücre ayrışması için taze tümörün diğer yarısını işleyin. Kısaca, taze tümörü 5 mL CCM (-) ile 60 mm'lik bir tabakta ayrışma için 1mm3 parçaya bölün. Ardından, Adım 2.2.4.-2.2.8.'i izledikten sonra, Adım 5.3'ü takiben in vivo geçiş için ilişkisiz hücreleri yeni C57BL / 6J farelere enjekte edin. veya Adım 3.4.-3.6.'yı izleyerek in vitro organoid kültürü gibi tutun veya 10 μM taze Y-27632 ile% 90 odun kömürü soyulmuş FBS ve% 10 DMSO kullanarak% 90 odun kömürü soyulmuş FBS ve% 10 DMSO kullanarak doğrudan sıvı azotta dondurun.
- Gerekirse, donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözerek ve CCM (-) ile yıkayarak geri kazanın. Bundan sonra, in vivo tümör oluşumu için farelere doğrudan enjeksiyon için DPBS'de% 50 matris ekstraktının 100 μL'sinde onları askıya alın. Bir in vivo enjeksiyon için en az 2 x 106 çözülmüş hücre kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarının iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Eşlik eden video, ürotelyal hücrelerin mesanenin fundusundan nasıl ayrıldığını ve üçlü floksed hücrelerin Ad5CMVCre ile ex vivo olarak nasıl dönüştürüldüğünü göstermektedir. Şekil 1A , minimal submukoza ve kas hücrelerinin enzim sindiriminden sonra ilişkisinin kesildiğini göstermiştir. Adenovirüs-Cre dağıtımının etkinliğini doğrulamak için, membran hedefli tdTomato/membran lokalize gelişmiş yeşil floresan proteini (mT/mG) ile üçlü floklu farelerden kopuk ürotelyal hücreler adenovirüs Cre ile transdüke edildi. Yeşil floresan protein (GFP), hücrelerin yaklaşık% 100'ünde tespit edildi ve adenovirüs transdüksiyonunun yüksek verimliliğini gösterdi (Şekil 1B).
Stabil TKO organoidleri standart organoid protokolleri (5'ten fazla pasajlı in vitro ; Şekil 2A). İn vitro organoid kesitlerin H&E ve immünofloresansı (IF) (Şekil 2A), ürotelyal soy belirteçleri CK5 ve p6311'in pozitif ekspresyonu ile yüksek dereceli ürotelyal karsinomun morfolojisini göstermiştir. PCR analizinde TKO organoidlerinde rekombine aleller saptanırken, rekombine edilmemiş floksed aleller sadece adenovirüs ile tedavi edilmemiş ürotelyal hücrelerde saptandı (Şekil 2B). 8 hafta içinde başlangıç subkutan (SQ) tümör oluşumu için C57BL/6J'ye toplam 2 x 106 primer ex vivo organoid enjekte edildi. Daha sonra, SQ tümörü (pasaj 1) toplandı ve farelerde geçti. Genel olarak, 2 cm'lik bir SQ tümörü (pasaj 2-5) oluşturmak için 2-3 haftaya ihtiyaç vardı (Şekil 2C). TKO in vivo ksenogreftin immünohistokimyası (IHC) CK7 (yamalı), CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu gösterdi (Şekil 2D). Mezenkim hücrelerinin kontaminasyonunu tespit etmek için, TKO tümörleri vimentin için boyandı. H&E boyası soldaki tümörü ve sağdaki kapsülü sarı çizgiyle sınırlamış olarak gösterdi. Vimentin pozitifliği sadece tümör kapsülünde veya stromada saptandı (Şekil 2E).
Şekil 1: LoxP bölgeleri olan fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonları. (A) ex vivo adenovirüs Ad5CMVCre aracılığıyla TKO organoid üretiminin iş akışı. Kısa süreli 30 dakikalık enzim sindirimi, ürotelyal hücreleri altta yatan submukoza ve muscularis propria'dan ayırmak için yeterliydi. İlişkisiz ürotelyal hücreler, TKO organoidleri için Ad5CMVCre ile dönüştürüldü ve daha sonra C57BL / 6J farelere enjekte edildi. (B) mT/mG (Cre rekombinasyonunu takiben yeşil floresan proteinine dönüşen kırmızı floresan proteininin kurucu transgen ekspresyonu) ile üçlü floks ürotelyal hücreler Ad5CMVCre ile transdüke edildi. Hücrelerin yaklaşık% 100'ü GFP pozitifti, bu da yüksek verimli transdüksiyon ve Cre rekombinasyonunu gösteriyordu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TKO organoidlerinin ex vivo adenovirüs-Cre rekombinaz ile karakterizasyonu. (A) İlişkisiz Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f ürotelyal hücreleri, TKO organoidleri (parlak alan) üretmek için adenovirüs (Ad5CMVCre) ile transdüke edildi. TKO organoidleri türleşme jeli ile gömüldü ve H & E ve immünofloresan için boyandı. (B) Genomik DNA, üçlü floklu ürotelyal hücrelerden (şerit 2) ve TKO organoidlerinden (şerit 4) ekstrakte edildi ve Trp53, Rb1 ve Pten'in floksed alellerini veya Cre rekombine alellerini tespit etmek için PCR ile güçlendirildi. PCR bantları ethidium bromür ile boyandı. Şerit 1 ve şerit 3 negatif ve pozitif rekombine kontrollerdi. (C) SQ enjeksiyonundan sonraki 17. günde brüt TKO SQ tümörü (pasaj 4) gösterildi. (D) TKA SQ ksenogreftlerinden tümör doku kesitleri H&E, IF (CK5, CK8) veya IHC (CK7, p63, Upk3) ile boyandı. Kısaltmalar: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Sitokeratin 20; CK8 = Sitokeratin 8; CK7 = Sitokeratin 7; Upk3 = Uroplakin III. (E) TKO SQ ksenogreftlerinden tümör doku kesitleri H&E ve IF (vimentin) ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GEMM'ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoidlerinin yüksek dereceli ürotelyal ürotelyum ile tutarlı histoloji sergilediğini, skuamöz farklılaşma ve hem in vitro organoidler hem de in vivo ksenogreftler gibi bazal benzeri bir alt tip sergilediğini göstermektedir. TKO organoidleri, Trp53, Rb1 ve Pten kaybının etkilerini, ilaç taramasını ve sinyal yolaklarının moleküler değerlendirmesini incelemek için in vitro olarak kullanılabilir. C57BL / 6J farelerde hızlı tümör oluşumu, kemoterapi veya immünoterapi gibi sistemik tedavilere tedavi yanıtlarını değerlendirmek için tasarlanmış in vivo çalışmalara olanak sağlayacaktır.
Ürotelyum, bir bazal hücre tabakasından (CK5 ve p63 için pozitif), 1-2 kat ara hücreden (Üroplakinler ve p63 pozitif) ve şemsiye hücrelerden (Üroplakinler, CK8 ve CK20 pozitif)6 oluşur. Yöntemdeki kritik bir adım, ürotelyal olmayan submukoza hücrelerinin minimum kontaminasyonuna izin veren uzun süreli (4 saat) enzim sindirimi yerine sınırlı süreli (30 dakika) doku ayrışmasıdır (Şekil 1A). Daha uzun bir ayrılma süresi, endotel hücreleri ve fibroblast hücreleri gibi stromal hücrelerin yüzdesini artırabilir. Adenovirüsün ex vivo transdüksiyon basamağı oldukça etkilidir. Ex vivo adenovirüs Cre transdüksiyonundan sonra GFP, ürotelyal hücrelerin yaklaşık %100'ünde mT/mG muhabir alelleri ile görselleştirildi (Şekil 1B).
Ex vivo yöntemin sınırlamaları vardır. İlk olarak, ilişkisiz hücreler adenovirüs transdüksiyonundan önce önceden seçilmez. Örneğin, hücreler ürotelyal hücrelere karşı ürotelyal olmayan hücreler veya luminal hücreler ve bazal hücreler için farklılaşmaz. EpCAM ve/veya CD49f ile hücre sıralama, ex vivo transdüksiyon 12,13'ten önce saf epitel hücrelerini ve/veya kök hücreleri sıralamak için kullanılabilir. İkincisi, bu protokolde kullanılan CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs, doku ayrışmasından sonra çok çeşitli hücre tiplerini hedefler (ürotelyal vs ürotelyal olmayan, bazal ve luminal hücreler). Bu spesifik olmayan hedefleme, en fazla onkojenik potansiyele sahip hücrelerin aşırı büyümesine neden olan bir seçim yanlılığına yol açabilir. Hücre tipine özgü adenovirüs vektörleri hem akciğer kanseri hem de mesane kanseri GEMM'lerinde topikal olarak kullanılmıştır14,15,16,17. Exvivo hücre tipine özgü adenovirüs (CK8 promotörü veya CK5 promotörü olan adenovirüs) kullanılarak yapılan gelecekteki çalışmalar, TKO organoidlerinin bazal veya luminal hücrelerden türetilip türetilmediğine dair menşe hücre sorularını ele alabilir18. CK20 veya Upk2 promotöre özgü adenovirüs (bilgimiz için mevcut değildir) ürotelyumdaki şemsiye hücreleri dönüştürmek için de tasarlanabilir. Bununla birlikte, ex vivo mesane enfeksiyonu için bu promotöre özgü adenovirüslerin etkinliğini ve özgüllüğünü incelemek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır. Adenovirüs-Cre etkinliğinde konakçı ortama bağlı olarak in vivo ve ex vivo transdüksiyon arasında tutarsızlık olabilir18. Üçüncüsü, ex vivo yöntem, in vivo tümörigenezi ve histomorfolojiyi etkileyebilecek tümör ortamının eksikliği ile sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, ex vivo yönteminin en büyük avantajı hızlı iş akışıdır (yıllarca fare yetiştiriciliği yerine 1-2 hafta). Ex vivo yaklaşımın ikinci avantajı, adenovirüs-Cre'nin (Ad5CMVCre) ticari olarak temin edilebilmesi, basit ve viral transdüksiyon ve Cre rekombinasyonu için neredeyse% 100 verimli olmasıdır (Şekil 1B). Buna karşılık, CRISPR düzenleme veya lentiviral transdüksiyon kullanan alternatif ex vivo yöntemler, daha az verimli genomik düzenleme nedeniyle daha fazla klon seçimi gerektirir 5,13,19,20.
Özetle, tarif edilen ex vivo adenovirüs yaklaşımı, insan mesane kanseri ile ilgili ilgi çekici genlerin (floksed aleller) herhangi bir kombinasyonunu kullanarak mesane kanseri modelleri oluşturmada uygun, hızlı ve etkilidir. Bu modeller, menşe hücrenin mesane kanseri fenotipi üzerindeki etkisini ele almak ve tanımlanmış genetik mutasyonlar ortamında immünoterapilere verilen tedavi yanıtlarını değerlendirmek için hücre tipine özgü adenovirüs ve hücre sıralama ile birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma çalışması kısmen NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ve R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibesi), Roswell Park Alliance Vakfı ve Üroloji Dostları Vakfı tarafından desteklenmiştir. Marisa Blask ve Mila Pakhomova'ya makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
