Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie
Summary
Dit protocol beschrijft grootte-uitsluitingschromatografie, een gemakkelijke en reproduceerbare techniek voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes uit kweeksupernatanten.
Abstract
De rol van extracellulaire blaasjes (EV’s) in de context van bacteriële infectie is naar voren gekomen als een nieuwe weg voor het begrijpen van microbiële fysiologie. Specifiek spelen Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV’s een rol in de gastheer-pathogeen interactie en reactie op omgevingsstress. Mtb EV’s zijn ook zeer antigeen en hebben potentieel als vaccincomponenten. De meest gebruikelijke methode voor het zuiveren van Mtb EV’s is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt. Dit proces heeft verschillende beperkingen, waaronder een lage doorvoer, lage opbrengst, afhankelijkheid van dure apparatuur, technische uitdagingen en het kan een negatieve invloed hebben op de resulterende voorbereiding. Size exclusion chromatography (SEC) is een zachtere alternatieve methode die veel van de beperkingen van ultracentrifugatie bestrijdt. Dit protocol toont aan dat SEC effectief is voor Mtb EV-verrijking en produceert hoogwaardige Mtb EV-preparaten met een verhoogde opbrengst op een snelle en schaalbare manier. Bovendien toont een vergelijking met ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt door kwantificerings- en kwalificatieprocedures de voordelen van SEC aan. Terwijl de evaluatie van ev-kwantiteit (nanodeeltjestrackinganalyse), fenotype (transmissie-elektronenmicroscopie) en inhoud (Western blotting) is afgestemd op Mtb EV’s, kan de geleverde workflow worden toegepast op andere mycobacteriën.
Introduction
Extracellulaire vesicle (EV) afgifte door pathogenen kan de sleutel zijn tot het ontsluiten van nieuwe technologieën om infectieziekten te beheersen1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is een ziekteverwekker van hoge betekenis, infecteert ongeveer een derde van de wereldbevolking en eist elk jaar het leven van miljoenen mensen2. Ev-productie door Mtb is goed gedocumenteerd maar ongrijpbaar in de biogenese en gevarieerde rollen (d.w.z. immunostimulerend, immunosuppressief, ijzer- en nutriëntenacquisitie) van deze EV’s in de context van infectie 3,4,5. Inspanningen om de samenstelling van Mtb EV’s te begrijpen onthulden 50-150 nm lipidemembraan-ingesloten bollen afgeleid van het plasmamembraan met lipiden en eiwitten van immunologische betekenis 3,6. Onderzoek naar de rol van MTB EV’s in de bacteriële fysiologie heeft het belang van bacteriële EV-modulatie als reactie op omgevingsstress voor overleving aan het lichtgebracht 5. Gastheer-pathogeen interactiestudies zijn ingewikkelder om te interpreteren, maar er zijn aanwijzingen dat Mtb EV’s de immuunrespons van de gastheer kunnen beïnvloeden en mogelijk kunnen dienen als een effectieve vaccinatiecomponent 3,4,7.
De meeste studies van Mtb EV’s tot nu toe hebben vertrouwd op dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor blaasjesverrijking8. Dit is effectief geweest voor kleinschalige studies; deze techniek heeft echter verschillende technische en logistieke uitdagingen. Alternatieve workflows koppelen meerstaps centrifugatie, voor het verwijderen van hele cellen en groot puin, met een laatste ultracentrifugatiestap naar pellet-EV’s. Deze methodologie kan variëren in efficiëntie en resulteert vaak in een lage opbrengst en co-zuivering van oplosbare niet-blaasjes geassocieerde biomoleculen, terwijl het ook de integriteit van blaasjes beïnvloedt9. Bovendien is dit proces tijdrovend, handmatig intensief en zeer beperkt in doorvoer vanwege apparatuurbeperkingen.
Het huidige protocol beschrijft een alternatieve techniek voor ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt: grootte-exclusiechromatografie (SEC). Deze methode is gedemonstreerd voor omgevingsmycobacteriën en in het huidige werk is het geëxtrapoleerd naar Mtb10. Een in de handel verkrijgbare kolom en automatische fractiecollector kunnen de consistentie in de vesische bereiding verbeteren en de noodzaak voor specifieke, dure apparatuur verminderen. Het is ook mogelijk om dit protocol in een fractie van de tijd te voltooien in vergelijking met ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, waardoor de doorvoer toeneemt. Deze techniek is technisch minder uitdagend, waardoor het gemakkelijker te beheersen is en kan de reproduceerbaarheid tussen / intra-laboratoria vergroten. Ten slotte heeft SEC een hoge scheidingsefficiëntie en is zachtaardig, waardoor de integriteit van de blaasjes behouden blijft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes zijn zeer antigene reservoirs, die ze presenteren als een aantrekkelijke manier voor het ontwikkelen van diagnostische hulpmiddelen en toekomstige vaccins 4,19,20. Historisch gezien is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt gebruikt om Mtb EV’s te scheiden van ander oplosbaar, uitgescheiden materiaal8. Hoewel dit proces effectief is, is h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de steun erkennen van het College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award en College Research Council Shared Research Program aan NKG en financiering door ATCC (award # 2016-0550-0002) aan KMD. We willen ook Anne Simpson bedanken voor technische ondersteuning en BEI Resources, NIAID, NIH voor de volgende reagentia: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (geproduceerd in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (geproduceerd in vitro), NR-49223, en Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (geproduceerd in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
