Микобактерии туберкулеза Обогащение внеклеточных пузырьков с помощью хроматографии с исключением размеров
Summary
Этот протокол описывает размерную эксклюзионную хроматографию, легкий и воспроизводимый метод обогащения внеклеточных везикул Mycobacterium tuberculosis из супернатантов культуры.
Abstract
Роль внеклеточных везикул (EV) в контексте бактериальной инфекции стала новым способом понимания микробной физиологии. В частности, mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV играют роль во взаимодействии хозяина и патогена и реакции на стресс окружающей среды. Mtb EV также очень антигенны и демонстрируют потенциал в качестве компонентов вакцины. Наиболее распространенным методом очистки Mtb EV является ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Этот процесс имеет несколько ограничений, включая низкую пропускную способность, низкую производительность, зависимость от дорогостоящего оборудования, технические проблемы, и это может негативно повлиять на полученную подготовку. Хроматография с исключением размеров (SEC) является более мягким альтернативным методом, который борется со многими ограничениями ультрацентрифугирования. Этот протокол демонстрирует, что SEC эффективен для обогащения Mtb EV и производит высококачественные препараты Mtb EV повышенной производительности быстрым и масштабируемым способом. Кроме того, сравнение с ультрацентрифугированием градиента плотности с помощью количественных и квалификационных процедур демонстрирует преимущества SEC. В то время как оценка количества EV (анализ отслеживания наночастиц), фенотипа (просвечивающая электронная микроскопия) и содержания (вестерн-блоттинг) адаптирована к Mtb EV, предоставленный рабочий процесс может быть применен к другим микобактериям.
Introduction
Высвобождение внеклеточных везикул (EV) патогенами может быть ключом к раскрытию новых технологий для борьбы с инфекционными заболеваниями1. Микобактерии туберкулеза (Mtb) являются возбудителем с высокими последствиями, заражая примерно одну треть населения мира и ежегодно унося жизни миллионов людей2. Производство EV Mtb хорошо документировано, но неуловимо в биогенезе и различных ролях (т.е. иммуностимулирующих, иммуносупрессивных, железо и питательных веществ) этих EV в контексте инфекции 3,4,5. Попытки понять состав Mtb EV выявили 50-150 нм липидных мембранно-замкнутых сфер, полученных из плазматической мембраны, содержащей липиды и белки иммунологического значения 3,6. Исследование роли Mtb EV в бактериальной физиологии выявило важность бактериальной модуляции EV в ответ на стресс окружающей среды для выживания5. Исследования взаимодействия хозяина и патогена были более сложными для интерпретации, но данные указывают на то, что Mtb EV могут влиять на иммунный ответ хозяина и потенциально могут служить эффективным компонентом вакцинации 3,4,7.
Большинство исследований Mtb EV до сих пор основывались на ультрацентрифугировании градиента плотности для обогащенияпузырьков 8. Это было эффективно для мелкомасштабных исследований; однако этот метод сопряжен с рядом технических и логистических проблем. Альтернативные рабочие процессы сочетают многоступенчатое центрифугирование для удаления целых клеток и крупного мусора с заключительным этапом ультрацентрифугирования для пеллетных электромобилей. Эта методология может варьироваться по эффективности и часто приводит к низкому выходу и совместной очистке растворимых биомолекул, не связанных с везикулами, а также влияет на целостностьпузырьков 9. Кроме того, этот процесс занимает много времени, интенсивно используется вручную и очень ограничен по пропускной способности из-за ограничений оборудования.
Настоящий протокол описывает альтернативный метод ультрацентрифугирования градиента плотности: хроматография с исключением размеров (SEC). Этот метод был продемонстрирован для экологических микобактерий, и в текущей работе он был экстраполирован на Mtb10. Коммерчески доступная колонна и автоматический коллектор фракций могут улучшить консистенцию в пузырной подготовке и уменьшить потребность в специальном, дорогостоящем оборудовании. Также можно завершить этот протокол за долю времени по сравнению с ультрацентрифугированием градиента плотности, увеличивая пропускную способность. Этот метод является менее технически сложным, что облегчает его освоение и может повысить межлабораторную воспроизводимость. Наконец, SEC обладает высокой эффективностью разделения и является щадящим, сохраняя целостность везикул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Внеклеточные везикулы Микобактерии туберкулеза являются высокоантигенными резервуарами, что представляет их в качестве привлекательного направления для разработки диагностических инструментов и будущих вакцин 4,19,20. Историчес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить признательность NKG за поддержку со стороны Колледжа ветеринарной медицины и биомедицинских наук и Совместной исследовательской программы Исследовательского совета колледжа для NKG и финансирование ATCC (награда No 2016-0550-0002) KMD. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Симпсон за техническую поддержку и BEI Resources, NIAID, NIH за следующие реагенты: Моноклональные антимикобактерии туберкулеза LpqH (ген Rv3763), IT-54 (производится in vitro), NR-13792, моноклональные антимикобактерии туберкулеза GroES (ген Rv3418c), клон IT-3 (SA-12) (производится in vitro), NR-49223 и моноклональные антимикобактерии туберкулеза LAM, клон CS-35 (производится в пробирке), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
