Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme
Summary
Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.
Abstract
Bakteriyel enfeksiyon bağlamında hücre dışı veziküllerin (EV’ler) rolü, mikrobiyal fizyolojiyi anlamak için yeni bir yol olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV’leri konakçı-patojen etkileşiminde ve çevresel strese yanıtta rol oynamaktadır. Mtb EV’ler ayrıca oldukça antijeniktir ve aşı bileşenleri olarak potansiyel gösterir. Mtb EV’leri saflaştırmak için en yaygın yöntem yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bu işlemin düşük verim, düşük verim, pahalı ekipmanlara bağımlılık, teknik zorluklar gibi çeşitli sınırlamaları vardır ve ortaya çıkan hazırlığı olumsuz yönde etkileyebilir. Boyut dışlama kromatografisi (SEC), ultrasantrifüjlemenin birçok sınırlamasıyla mücadele eden daha yumuşak bir alternatif yöntemdir. Bu protokol, SEC’in Mtb EV zenginleştirmesi için etkili olduğunu ve hızlı ve ölçeklenebilir bir şekilde artan verime sahip yüksek kaliteli Mtb EV preparatları ürettiğini göstermektedir. Ek olarak, niceleme ve kalifikasyon prosedürleri ile yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile yapılan bir karşılaştırma, SEC’in faydalarını göstermektedir. EV miktarının (nanopartikül izleme analizi), fenotipin (transmisyon elektron mikroskobu) ve içeriğinin (Batı lekelenmesi) değerlendirilmesi Mtb EV’lere uyarlanırken, sağlanan iş akışı diğer mikobakterilere uygulanabilir.
Introduction
Patojenler tarafından hücre dışı vezikül (EV) salınımı, bulaşıcı hastalıkları kontrol etmek için yeni teknolojilerin kilidini açmanın anahtarı olabilir1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dünya nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte eden ve her yıl milyonlarca insanın hayatına mal olan yüksek sonuçlu bir patojendir2. Mtb tarafından EV üretimi, enfeksiyonbağlamında bu EV’lerin biyogenezinde ve çeşitli rollerinde (yani, immünostimülatör, immünosüpresif, demir ve besin edinimi) iyi belgelenmiştir, ancak zordur 3,4,5. Mtb EV’lerin bileşimini anlama çabaları, immünolojik öneme sahip lipitler ve proteinler içeren plazma zarından türetilen 50-150 nm lipid membranı ile kaplı küreleri ortaya çıkardı 3,6. Mtb EV’lerin bakteriyel fizyolojideki rolünün araştırılması, hayatta kalma için çevresel strese yanıt olarak bakteriyel EV modülasyonunun önemini ortaya koymuştur5. Konakçı-patojen etkileşim çalışmalarının yorumlanması daha karmaşık olmuştur, ancak kanıtlar Mtb EV’lerin konakçının bağışıklık tepkisini etkileyebileceğini ve potansiyel olarak etkili bir aşılama bileşeniolarak hizmet edebileceğini göstermektedir 3,4,7.
Mtb EV’ler üzerinde şimdiye kadar yapılan çalışmaların çoğu, vezikül zenginleştirme8 için yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemesine dayanmaktadır. Bu, küçük ölçekli çalışmalar için etkili olmuştur; Bununla birlikte, bu tekniğin çeşitli teknik ve lojistik zorlukları vardır. Alternatif iş akışları, tüm hücrelerin ve büyük kalıntıların giderilmesi için çok adımlı santrifüjlemeyi, pelet EV’lere son bir ultrasantrifüjleme adımıyla birleştirir. Bu metodoloji verimlilikte değişebilir ve genellikle düşük verim ve vezikül ile ilişkili olmayan biyomoleküllerin birlikte saflaştırılması ile sonuçlanırken, aynı zamanda vezikül bütünlüğünü de etkiler9. Ek olarak, bu işlem zaman alıcıdır, manuel olarak yoğundur ve ekipman kısıtlamaları nedeniyle verim açısından çok sınırlıdır.
Mevcut protokol, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye alternatif bir teknik tanımlamaktadır: boyut dışlama kromatografisi (SEC). Bu yöntem çevresel mikobakteriler için gösterilmiştir ve mevcut çalışmada Mtb10’a ekstrapolasyon yapılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen bir kolon ve otomatik fraksiyon toplayıcı, vezikal preparatta tutarlılığı artırabilir ve spesifik, pahalı ekipman ihtiyacını azaltabilir. Bu protokolü, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile karşılaştırıldığında zamanın bir kısmında tamamlamak ve verimi artırmak da mümkündür. Bu teknik teknik olarak daha az zordur, ustalaşmayı kolaylaştırır ve laboratuvarlar arası / laboratuvar içi tekrarlanabilirliği artırabilir. Son olarak, SEC yüksek ayırma verimliliğine sahiptir ve veziküllerin bütünlüğünü koruyan naziktir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküller, onları tanı araçları ve gelecekteki aşılar geliştirmek için cazip bir yol olarak sunan oldukça antijenik rezervuarlardır 4,19,20. Tarihsel olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme, Mtb EV’leri diğer çözünür, salgılanan malzemelerden ayırmak için kullanılmıştır8. Bu süreç etkili olsa da, aynı zamanda zaman alıc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Veteriner Hekimliği ve Biyomedikal Bilimler Fakültesi Deneyimsel Ödülü ve Üniversite Araştırma Konseyi Ortak Araştırma Programı’nın NKG’ye verdiği desteği ve ATCC’nin (ödül # 2016-0550-0002) KMD’ye sağladığı desteği kabul etmek istiyoruz. Ayrıca teknik destek için Anne Simpson’a ve aşağıdaki reaktifler için BEI Resources, NIAID, NIH’ye teşekkür ederiz: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (in vitro olarak üretilmiştir), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (in vitro olarak üretilmiştir), NR-49223 ve Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (in vitro olarak üretilmiştir), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
