Mycobacterium tuberkulos Extracellulär vesikelanrikning genom storleksuteslutningskromatografi
Summary
Detta protokoll beskriver storleksuteslutningskromatografi, en enkel och reproducerbar teknik för att berika Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar från kultursupnatanter.
Abstract
Rollen av extracellulära vesiklar (EV) i samband med bakteriell infektion har dykt upp som en ny väg för att förstå mikrobiell fysiologi. Specifikt spelar Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbilar en roll i värd-patogeninteraktionen och svaret på miljöstress. Mtb elbilar är också mycket antigena och visar potential som vaccinkomponenter. Den vanligaste metoden för att rena Mtb elbilar är densitetsgradient ultracentrifugering. Denna process har flera begränsningar, inklusive låg genomströmning, lågt utbyte, beroende av dyr utrustning, tekniska utmaningar och det kan påverka den resulterande förberedelsen negativt. Storleksuteslutningskromatografi (SEC) är en mildare alternativ metod som bekämpar många av begränsningarna för ultracentrifugering. Detta protokoll visar att SEC är effektivt för Mtb EV-anrikning och producerar högkvalitativa Mtb EV-preparat med ökat utbyte på ett snabbt och skalbart sätt. Dessutom visar en jämförelse med ultracentrifugering av densitetsgradient genom kvantifierings- och kvalificeringsförfaranden fördelarna med SEC. Medan utvärderingen av EV-kvantitet (nanopartikelspårningsanalys), fenotyp (transmissionselektronmikroskopi) och innehåll (Western blotting) är skräddarsydd för Mtb-elbilar, kan arbetsflödet som tillhandahålls tillämpas på andra mykobakterier.
Introduction
Extracellulär vesikel (EV) frisättning av patogener kan vara nyckeln till att låsa upp ny teknik för att kontrollera infektionssjukdomar1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) är en patogen med hög konsekvens, som infekterar ungefär en tredjedel av världens befolkning och kräver miljontals människors liv varje år2. EV-produktion av Mtb är väldokumenterad men ändå svårfångad i biogenesen och varierade roller (dvs. immunstimulerande, immunsuppressiv, järn- och näringsförvärv) för dessa elbilar i samband med infektion 3,4,5. Ansträngningar för att förstå sammansättningen av Mtb-elbilar avslöjade 50-150 nm lipidmembranslutna sfärer härledda från plasmamembranet innehållande lipider och proteiner av immunologisk betydelse 3,6. Undersökning av Mtb EV: s roll i bakteriell fysiologi har avslöjat vikten av bakteriell EV-modulering som svar på miljöstress för överlevnad5. Värd-patogeninteraktionsstudier har varit mer komplicerade att tolka, men bevis tyder på att Mtb-elbilar kan påverka värdens immunsvar och potentiellt kan fungera som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De flesta studier av Mtb-elbilar hittills har förlitat sig på ultracentrifugering av densitetsgradient för vesikelanrikning8. Detta har varit effektivt för småskaliga studier; denna teknik har dock flera tekniska och logistiska utmaningar. Alternativa arbetsflöden kopplar samman flerstegscentrifugering, för avlägsnande av hela celler och stora skräp, med ett sista ultracentrifugeringssteg för att pellet-elbilar. Denna metod kan variera i effektivitet och resulterar ofta i lågt utbyte och samrening av lösliga icke-vesikelassocierade biomolekyler samtidigt som det påverkar vesikelintegriteten9. Dessutom är den här processen tidskrävande, manuellt intensiv och mycket begränsad i genomströmning på grund av utrustningsbegränsningar.
Det nuvarande protokollet beskriver en alternativ teknik till ultracentrifugering av densitetsgradient: storleksuteslutningskromatografi (SEC). Denna metod har demonstrerats för miljömykobakterier, och i det aktuella arbetet har den extrapolerats till Mtb10. En kommersiellt tillgänglig kolonn och automatisk fraktionsuppsamlare kan förbättra konsistensen vid vesikal beredning och minska behovet av specifik, dyr utrustning. Det är också möjligt att slutföra detta protokoll på en bråkdel av tiden jämfört med ultracentrifugering av densitetsgradient, vilket ökar genomströmningen. Denna teknik är mindre tekniskt utmanande, vilket gör det lättare att behärska och kan öka reproducerbarheten mellan / inom laboratorier. Slutligen har SEC hög separationseffektivitet och är skonsam, vilket bevarar vesiklarnas integritet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar är mycket antigena reservoarer, som presenterar dem som en attraktiv väg för att utveckla diagnostiska verktyg och framtida vacciner 4,19,20. Historiskt sett har ultracentrifugering av densitetsgradient använts för att separera Mtb-elbilar från annat lösligt, utsöndrat material8. Även om denna process är effektiv är den också tidskr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill erkänna stöd från College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award och College Research Council Shared Research Program till NKG och finansiering av ATCC (utmärkelse # 2016-0550-0002) till KMD. Vi vill också tacka Anne Simpson för teknisk support och BEI Resources, NIAID, NIH för följande reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producerad in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producerad in vitro), NR-49223 och Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (producerad in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
