Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement
Summary
Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.
Abstract
Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des dommages irréparables à l’ADN dans les cellules cancéreuses, conduisant à l’apoptose ou à la sénescence prématurée. Contrairement à la mort cellulaire apoptotique, la sénescence est une machinerie fondamentalement différente qui restreint la propagation des cellules cancéreuses. Des décennies d’études scientifiques ont révélé les effets pathologiques complexes des cellules cancéreuses sénescentes dans les tumeurs et les microenvironnements qui modulent les cellules cancéreuses et les cellules stromales. De nouvelles preuves suggèrent que la sénescence est un facteur pronostique puissant pendant le traitement du cancer, et donc une détection rapide et précise des cellules sénescentes dans les échantillons de cancer est essentielle. Cet article présente une méthode pour visualiser et détecter la sénescence induite par le traitement (TIS) dans les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires diffuses de lymphome à grandes cellules B (LDGCB) ont été traitées avec du mafosfamide (MAF) ou de la daunorubicine (DN) et examinées pour le marqueur de sénescence, la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), le marqueur de synthèse de l’ADN 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le marqueur de dommages à l’ADN gamma-H2AX (γH2AX). L’imagerie par cytomètre en flux peut aider à générer des images unicellulaires à haute résolution en peu de temps pour visualiser et quantifier simultanément les trois marqueurs dans les cellules cancéreuses.
Introduction
Une variété de stimuli peut déclencher la sénescence cellulaire, amenant les cellules à entrer dans un état d’arrêt stable du cycle cellulaire. Ces stimuli comprennent des changements de signalisation intrinsèques ou des stress extrinsèques. Les signaux intrinsèques comprennent le raccourcissement progressif des télomères, les changements dans la structure des télomères, la modification épigénétique, les troubles de la protéostase, le dysfonctionnement mitochondrial et l’activation des oncogènes. Les stress extrinsèques comprennent les signaux de dommages inflammatoires et/ ou tissulaires, les traitements radiologiques ou chimiques et la privation nutritionnelle 1,2,3,4. Parmi les types distincts de sénescence, les plus fréquemment observés et les mieux étudiés sont la sénescence réplicative, la sénescence induite par l’oncogène (OIS), la sénescence radio-induite et la sénescence induite par la thérapie (TIS). L’OIS est une réponse cellulaire aiguë aux dommages génotoxiques causés par le stress réplicatif généré par l’activation aberrante de l’oncogène et peut dans une certaine mesure empêcher la progression pathologique d’une lésion prénéoplasique à une tumeur à part entière. TiS se produit lorsque les cellules tumorales sont stressées par des médicaments chimiothérapeutiques oudes rayonnements ionisants 5,6.
La sénescence est considérée comme une épée à double tranchant en pathologie en raison de sa nature très dynamique. Il a été initialement décrit comme un mécanisme bénéfique de suppression de tumeur pour éliminer les cellules endommagées du pool circulant de cellules en division, préservant le fonctionnement normal des organes et inhibant la croissance tumorale 7,8,9. Cependant, de nouvelles preuves ont suggéré un côté sombre de la sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, connues sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), conduisant à la fibrose et aux organes défectueux et favorisant l’initiation et la progression de la tumeur10. De plus, les cellules cancéreuses sénescentes subissent une reprogrammation épigénétique et d’expression génique parallèlement au remodelage de la chromatine et à l’activation d’une réponse soutenue aux dommages à l’ADN (DDR)11,12, acquérant de nouvelles propriétés de cellules souches cancéreuses 3. Bien que les tumeurs capables de sénescence répondent mieux à l’intervention thérapeutique que les tumeurs incapables de sénescence13, la persistance des cellules sénescentes peut entraîner un mauvais pronostic à long terme si elles ne sont pas efficacement identifiées et éliminées par les médicaments sénolytiques5. Quoi qu’il en soit, une méthode fiable pour évaluer la sénescence présente un intérêt clinique important, non seulement pour le pronostic du traitement thérapeutique, mais également pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les cellules sénescentes.
Indépendamment des différents déclencheurs, les cellules sénescentes présentent certaines caractéristiques communes, notamment une morphologie élargie, aplatie et multinucléée avec de grandes vacuoles, des noyaux significativement dilatés, la formation d’hétérochromatine associée à la sénescence (SAHF) riche en H3K9me3 dans le noyau, l’accumulation persistante de foyers de marqueurs de dommages à l’ADN γH2AX, activé p53-p21CIP1 et Rb-p16INK4a les mécanismes de régulation du cycle cellulaire, l’arrêt stable du cycle cellulaire G1, l’induction massive de SASP et l’activité élevée de la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal)14. Étant donné qu’aucun marqueur unique n’est suffisant pour définir la sénescence, la coloration enzymatique pour l’activité SA-β-gal, qui est considérée comme l’étalon-or pour la détection de la sénescence, est généralement associée à une coloration immunohistochimique pour H3K9me3 et Ki67 pour détecter TIS15. Cependant, le SA-β-gal chimique à base de chromogène est difficile à quantifier. Ici, nous avons combiné la détection de SA-β-gal (fSA-β-gal) à base de fluorescence 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) à base de fluorescence SA-β-gal) avec une coloration immunofluorescente pour l’ADN incorporé à γH2AX et EdU pour identifier les cellules sénescentesC12FDG + EdU-γH2AX + à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie avancée, qui combine la vitesse, la sensibilité et les images unicellulaires détaillées avec des informations spatiales qui ne peuvent pas être fournies par la cytométrie en flux et la microscopie. Cette méthode permet la génération rapide d’images haute résolution permettant le positionnement et la quantification des signaux fluorescents dans les cellules, tout en autorisant l’analyse rapide de plusieurs échantillons en construisant des pipelines standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode a examiné la capacité d’entrée de sénescence de quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB lors d’un traitement de chimiothérapie, avec une imagerie en champ lumineux et une quantification basée sur la cytométrie en flux. Au niveau unicellulaire, nous avons détecté avec succès d’importantes populations sénescentes C12FDG+EdU-Ki67+ dans les cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées, et dans une moindre mesure dans les cellules OCI-LY1, tand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention à Yong Yu de l’Université Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
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