Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia
Summary
Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.
Abstract
Drogas quimioterápicas podem induzir danos irreparáveis de DNA em células cancerosas, levando à apoptose ou senescência prematura. Ao contrário da morte celular apoptótica, a senescência é uma máquina fundamentalmente diferente que restringe a propagação de células cancerígenas. Décadas de estudos científicos revelaram os efeitos patológicos complexos das células cancerígenas senescentes em tumores e microambientes que modulam células cancerígenas e células estromais. Novas evidências sugerem que a senescência é um fator prognóstico potente durante o tratamento do câncer e, portanto, a detecção rápida e precisa de células senescentes em amostras de câncer é essencial. Este artigo apresenta um método para visualizar e detectar senescência induzida por terapia (TIS) em células cancerosas. Linhas celulares difusas de grandes células B (DLBCL) foram tratadas com mafosfamida (MAF) ou daunorubicina (DN) e examinadas para o marcador de senescência, β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal), o marcador de síntese de DNA 5-ethynyl-2′-desoxyuridina (EdU), e o marcador de dano de DNA gama-H2AX (γH2AX). A imagem do citómetro de fluxo pode ajudar a gerar imagens unicelulares de alta resolução em um curto período de tempo para visualizar e quantificar simultaneamente os três marcadores em células cancerosas.
Introduction
Uma variedade de estímulos pode desencadear senescência celular, fazendo com que as células entrem em um estado de parada estável do ciclo celular. Esses estímulos incluem alterações intrínsecas de sinalização ou tensões extrínsecas. Sinais intrínsecos incluem encurtamento progressivo do telômero, alterações na estrutura do telômero, modificação epigenética, distúrbios da proteostase, disfunção mitocondrial e ativação de oncogênicos. As tensões extrínsecas incluem sinais inflamatórios e/ou de danos teciduais, radiação ou tratamento químico e privação nutricional 1,2,3,4. Entre os tipos distintos de senescência, os mais comumente vistos e bem estudados são senescência replicativa, senescência induzida por oncogênico (OIS), senescência induzida por radiação e senescência induzida pela terapia (IS). OIS é uma resposta celular aguda aos danos genotoxicos causados pelo estresse replicativo gerado pela ativação do oncogene aberrante e pode, em certa medida, impedir a progressão patológica de uma lesão pré-inoplástica para um tumor completo. O TIS acontece quando as células tumorais são estressadas por drogas quimioterápicas ou radiação ionizante 5,6.
Senescência é considerada uma espada de dois gumes em patologia devido à sua natureza altamente dinâmica. Foi inicialmente descrito como um mecanismo benéfico para remover células danificadas da piscina circulante de células divisórias, salvaguardando a função normal dos órgãos e inibindo o crescimento do tumor 7,8,9. No entanto, evidências emergentes sugerem um lado negro da senescência. As células senescentes secretam citocinas proinflamatórias, conhecidas como fenótipo secreto associado à senescência (SASP), levando à fibrose e órgãos defeituosos e promovendo a iniciação e progressão do tumor10. Além disso, as células cancerígenas senescentes passam por reprogramação epigenética e de expressão genética em paralelo com a remodelação da cromatina e ativação de uma resposta sustentada de danos de DNA (DDR)11,12, recém-adquirindo novas propriedades de células-troncocancerosas 3. Embora os tumores capazes de senescência respondam melhor à intervenção terapêutica em comparação com os indeferidores de senescência13, a persistência das células senescentes pode levar a um prognóstico de longo prazo ruim se não forem efetivamente identificados e eliminados por drogas senolíticas5. De qualquer forma, um método confiável para avaliar a senescência é de interesse clínico significativo, não apenas para o prognóstico do tratamento terapêutico, mas também para o desenvolvimento de novas estratégias voltadas para células senescentes.
Independentemente de diferentes gatilhos, as células senescentes apresentam algumas características comuns, incluindo morfologia ampliada, achatada, multinucleada com grandes vacúolos, núcleos significativamente expandidos, formação de heterocromatina associada à senescência h3K9me3 (SAHF) no núcleo, acúmulo persistente de focos de dano de DNA γH2AX, ativação p53-p21CIP1 e RB-p16INK mecanismos regulatórios do ciclo celular, detenção estável do ciclo celular G1, indução maciça de SASP e atividade de β-galactosidase associada à senescência elevada (SA-β-gal)atividade 14. Uma vez que nenhum marcador único é suficiente para definir senescência, a coloração enzimática para a atividade SA-β-gal, que é considerada o padrão ouro para detecção de senescência, é geralmente combinada com coloração imunohistoquímica para H3K9me3 e Ki67 para detectar TIS15. No entanto, a sa-β-gal de base cromogênica química é difícil de quantificar. Aqui, combinamos 5-dodecanoylaminofluoresceín-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) baseado em fluorescência SA-β-gal (fSA-β tecção de imunofluorescentes para γH2AX e DNA incorporado edu para identificar células senescentes C12FDG+EdU-ΓH2AX+ usando o sistema avançado de citômetro de fluxo de imagem, que combina a velocidade, sensibilidade e imagens detalhadas unicelulares com informações espaciais que não podem ser fornecidas por citometria de fluxo e microscopia. Este método permite a rápida geração de imagens de alta resolução permitindo o posicionamento e quantificação de sinais fluorescentes dentro das células, ao mesmo tempo em que licencia a análise rápida de várias amostras através da construção de dutos padrão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método examinou a capacidade de entrada de senescência de quatro diferentes linhas celulares DLBCL após o tratamento quimioterápico, com imagem de campo brilhante e quantificação baseada em citometria de fluxo. Em um nível unicelular, detectamos com sucesso populações senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ em células KARPAS422 e WSU-DLCL2 tratadas, e em menor grau nas células OCI-LY1, enquanto a linha celular SU-DHL6 era resistente ao tratamento. A diferença na capacidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para Yong Yu da Universidade Johannes Kepler Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
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