치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출
Summary
여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.
Abstract
화학 요법 약물은 암세포에서 돌이킬 수없는 DNA 손상을 유도하여 아폽토시스 또는 조기 노화를 유발할 수 있습니다. 세포사멸 세포 사멸과는 달리, 노화는 암세포의 번식을 억제하는 근본적으로 다른 기계이다. 수십 년간의 과학적 연구는 암세포와 기질 세포를 조절하는 종양 및 미세 환경에서 노인성 암 세포의 복잡한 병리학 적 효과를 밝혀 냈습니다. 새로운 증거는 노화가 암 치료 중 강력한 예후 인자이므로 암 샘플에서 노화 세포의 신속하고 정확한 검출이 필수적임을 시사합니다. 이 논문은 암세포에서 치료 유도 노화 (TIS)를 시각화하고 검출하는 방법을 제시합니다. 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주를 마포스파미드 (MAF) 또는 다우노루비신 (DN)으로 처리하고, 노화 마커, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal), DNA 합성 마커 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU), 및 DNA 손상 마커 감마-H2AX (γH2AX)에 대해 조사하였다. 유세포 분석기 이미징은 단기간에 고해상도 단일 세포 이미지를 생성하여 암세포의 세 가지 마커를 동시에 시각화하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
다양한 자극은 세포 노화를 유발하여 세포가 안정된 세포 주기 정지 상태로 진입하게 할 수 있습니다. 이러한 자극에는 내재적 신호 변화 또는 외적 스트레스가 포함됩니다. 내재적 신호에는 진행성 텔로미어 단축, 텔로미어 구조의 변화, 후성유전학적 변형, 프로테오스타시스 장애, 미토콘드리아 기능장애, 종양유전자의 활성화가 포함된다. 외인성 스트레스에는 염증 및/또는 조직 손상 신호, 방사선 또는 화학적 치료, 영양 결핍 1,2,3,4가 포함됩니다. 뚜렷한 유형의 노화 중에서 가장 일반적으로 볼 수 있고 잘 연구 된 것은 복제 노화, 종양 유전자 유도 노화 (OIS), 방사선 유도 노화 및 치료 유도 노화 (TIS)입니다. OIS는 비정상적인 종양유전자 활성화에 의해 생성된 복제 스트레스에 의해 야기되는 유전독성 손상에 대한 급성 세포 반응이며, 신생물성 병변으로부터 본격적인 종양으로의 병리학적 진행을 어느 정도 예방할 수 있다. TIS는 종양 세포가 화학 요법 약물 또는 이온화 방사선 5,6에 의해 스트레스를 받을 때 발생합니다.
노화는 매우 역동적 인 특성으로 인해 병리학에서 양날의 검으로 간주됩니다. 처음에는 분열 세포의 순환 풀에서 손상된 세포를 제거하고 장기의 정상적인 기능을 보호하고 종양 성장 7,8,9을 억제하는 유익한 종양 억제 메커니즘으로 설명되었습니다. 그러나 새로운 증거는 노화의 어두운면을 시사했다. 노화 세포는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 전염증성 사이토카인을 분비하여, 섬유증 및 기능성 기관을 유도하고 종양 개시 및 진행을 촉진한다(10). 더욱이, 노년기 암세포는 후성유전학적 및 유전자-발현 리프로그래밍을 통해 크로마틴 리모델링 및 지속적인 DNA-손상 반응(DDR)11,12의 활성화와 병행하여, 새로운 암-줄기-세포 특성을 새롭게 획득한다3. 노화가 가능한 종양은 노화가 불가능한 종양(13)에 비해 치료 개입에 더 잘 반응하지만, 노화 세포의 지속성은 혈청용해제에 의해 효과적으로 확인되고 제거되지 않으면 장기간 예후가 좋지 않을 수 있다5. 어느 쪽이든, 노화를 평가하는 신뢰할 수있는 방법은 치료 치료의 예후뿐만 아니라 노인 세포를 목표로하는 새로운 전략 개발에도 중요한 임상 적 관심사입니다.
다른 트리거에 관계없이, 노화 세포는 큰 액포를 갖는 확대, 평탄화, 다핵 형태학, 상당히 확장된 핵, 핵에서 H3K9me3 풍부 노화 관련 헤테로크로마틴(SAHF)의 형성, DNA 손상 마커 γH2AX 초점의 지속적인 축적, 활성화된 p53-p21CIP1 및 Rb-p16INK4a 등 몇 가지 공통된 특징을 나타낸다. 세포 주기 조절 메카니즘, 안정한 G1 세포 주기 정지, SASP의 대규모 유도, 및 상승된 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성14. 노화를 정의하기에 충분한 단일 마커가 없기 때문에, 노화 검출의 황금 표준으로 간주되는 SA-β-gal 활성에 대한 효소 염색은 일반적으로 TIS15를 검출하기 위해 H3K9me3 및 Ki67에 대한 면역 조직화학 염색과 결합됩니다. 그러나, 화학적 염색체-기반 SA-β-gal은 정량화하기가 어렵다. 여기에서는 5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(C12 FDG) 형광 기반 SA-β-gal(fSA-β-gal) 검출을 γH2AX 및 EdU 혼입 DNA에 대한 면역형광 염색과 결합하여 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 유세포 분석기 및 현미경으로 제공할 수 없는 공간 정보와 결합한 고급 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 세포를 확인했습니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 이미지를 신속하게 생성할 수 있으므로 세포 내에서 형광 신호를 배치하고 정량화할 수 있으며, 표준 파이프라인을 구축하여 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 화학 요법 치료시 네 개의 다른 DLBCL 세포주의 노화 진입 능력을 밝은 필드 이미징 및 유세포 측정 기반 정량화로 조사했습니다. 단일 세포 수준에서, 우리는 처리 된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서 주요C12 FDG + EdU-Ki67 + 노인성 집단을 성공적으로 검출했으며, OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포주가 치료에 내성을 갖는 반면, OCI-LY1 세포에서는 더 적은 정도까지 성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Johannes Kepler University Linz (BERM16108001)의 Yong Yu에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
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