Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia
Summary
Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.
Abstract
I farmaci chemioterapici possono indurre danni irreparabili al DNA nelle cellule tumorali, portando ad apoptosi o senescenza prematura. A differenza della morte cellulare apoptotica, la senescenza è un meccanismo fondamentalmente diverso che limita la propagazione delle cellule tumorali. Decenni di studi scientifici hanno rivelato i complessi effetti patologici delle cellule tumorali senescenti nei tumori e nei microambienti che modulano le cellule tumorali e le cellule stromali. Nuove prove suggeriscono che la senescenza è un potente fattore prognostico durante il trattamento del cancro, e quindi è essenziale un rilevamento rapido e accurato delle cellule senescenti nei campioni di cancro. Questo documento presenta un metodo per visualizzare e rilevare la senescenza indotta dalla terapia (TIS) nelle cellule tumorali. Le linee cellulari diffuse di linfoma a grandi cellule B (DLBCL) sono state trattate con mafosfamide (MAF) o daunorubicina (DN) ed esaminate per il marcatore di senescenza, la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), il marcatore di sintesi del DNA 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e il marcatore di danno al DNA gamma-H2AX (γH2AX). L’imaging del citometro a flusso può aiutare a generare immagini a singola cellula ad alta risoluzione in un breve periodo di tempo per visualizzare e quantificare simultaneamente i tre marcatori nelle cellule tumorali.
Introduction
Una varietà di stimoli può innescare la senescenza cellulare, facendo sì che le cellule entrino in uno stato di arresto stabile del ciclo cellulare. Questi stimoli includono cambiamenti intrinseci di segnalazione o stress estrinseci. I segnali intrinseci includono l’accorciamento progressivo dei telomeri, i cambiamenti nella struttura dei telomeri, la modificazione epigenetica, i disturbi della proteostasi, la disfunzione mitocondriale e l’attivazione degli oncogeni. Gli stress estrinseci includono segnali infiammatori e / o di danno tissutale, radiazioni o trattamenti chimici e privazione nutrizionale 1,2,3,4. Tra i tipi distinti di senescenza, i più comunemente visti e ben studiati sono la senescenza replicativa, la senescenza indotta da oncogeni (OIS), la senescenza indotta da radiazioni e la senescenza indotta dalla terapia (TIS). L’OIS è una risposta cellulare acuta al danno genotossico causato dallo stress replicativo generato dall’attivazione aberrante dell’oncogene e può in una certa misura prevenire la progressione patologica da una lesione preneoplastica a un tumore in piena regola. La TIS si verifica quando le cellule tumorali sono stressate da farmaci chemioterapici o radiazioni ionizzanti 5,6.
La senescenza è considerata un’arma a doppio taglio in patologia a causa della sua natura altamente dinamica. Inizialmente è stato descritto come un meccanismo benefico soppressivo del tumore per rimuovere le cellule danneggiate dal pool circolante di cellule in divisione, salvaguardando la normale funzione degli organi e inibendo la crescita tumorale 7,8,9. Tuttavia, le prove emergenti hanno suggerito un lato oscuro della senescenza. Le cellule senescenti secernono citochine proinfiammatorie, note come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), che portano alla fibrosi e agli organi malfunzionanti e promuovono l’inizio e la progressione del tumore10. Inoltre, le cellule tumorali senescenti subiscono una riprogrammazione epigenetica e di espressione genica in parallelo con il rimodellamento della cromatina e l’attivazione di una risposta sostenuta al danno al DNA (DDR)11,12, acquisendo di recente nuove proprietà delle cellule staminali tumorali3. Sebbene i tumori capaci di senescenza rispondano meglio all’intervento terapeutico rispetto a quelli incapaci di senescenza13, la persistenza delle cellule senescenti può portare a una prognosi a lungo termine sfavorevole se non vengono efficacemente identificati ed eliminati dai farmaci senolitici5. In entrambi i casi, un metodo affidabile per valutare la senescenza è di notevole interesse clinico, non solo per la prognosi del trattamento terapeutico, ma anche per lo sviluppo di nuove strategie mirate alle cellule senescenti.
Indipendentemente dai diversi fattori scatenanti, le cellule senescenti presentano alcune caratteristiche comuni, tra cui morfologia allargata, appiattita, multinucleata con grandi vacuoli, nuclei significativamente espansi, formazione di eterocromatina associata alla senescenza ricca di H3K9me3 (SAHF) nel nucleo, accumulo persistente di focolai di marcatore di danno al DNA γH2AX, p53-p21attivato CIP1 e Rb-p16INK4a meccanismi di regolazione del ciclo cellulare, arresto stabile del ciclo cellulare G1, induzione massiccia di SASP e elevata attività della β-galattosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza14. Poiché nessun singolo marcatore è sufficiente per definire la senescenza, la colorazione enzimatica per l’attività SA-β-gal, che è considerata il gold standard per il rilevamento della senescenza, è solitamente combinata con la colorazione immunoistochimica per H3K9me3 e Ki67 per rilevare TIS15. Tuttavia, il SA-β-gal a base cromogenica chimica è difficile da quantificare. Qui, abbiamo combinato il rilevamento SA-β-gal (fSA-β-gal) a base di fluorescenza a base di fluorescenza 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galattopiranoside (C12FDG) con la colorazione immunofluorescente per γH2AX e il DNA incorporato in EdU per identificare le cellule senescenti C12FDG + EdU-γH2AX + utilizzando l’avanzato sistema di citometro a flusso di imaging, che combina la velocità, la sensibilità e le immagini dettagliate a singola cellula con informazioni spaziali che non possono essere fornite dalla citometria a flusso e dalla microscopia. Questo metodo consente una rapida generazione di immagini ad alta risoluzione che consentono il posizionamento e la quantificazione dei segnali fluorescenti all’interno delle celle, consentendo al contempo l’analisi rapida di più campioni mediante la costruzione di pipeline standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo ha esaminato la capacità di ingresso in senescenza di quattro diverse linee cellulari DLBCL durante il trattamento chemioterapico, con imaging a campo luminoso e quantificazione basata sulla citometria a flusso. A livello di singola cellula, abbiamo rilevato con successo le principali popolazioni senescenti C12FDG + EdU-Ki67 + nelle cellule TRATTATE KARPAS422 e WSU-DLCL2 e, in misura minore, nelle cellule OCI-LY1, mentre la linea cellulare SU-DHL6 era resistente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione a Yong Yu dell’Università Johannes Kepler di Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
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