Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen
Summary
Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.
Abstract
Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.
Introduction
Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4. Unter den verschiedenen Arten der Seneszenz sind die am häufigsten beobachteten und gut untersuchten replizierte Seneszenzenz, Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), strahleninduzierte Seneszenz und therapieinduzierte Seneszenz (TIS). OIS ist eine akute zelluläre Reaktion auf genotoxische Schäden, die durch replizierenden Stress verursacht werden, der durch aberrante Onkogenaktivierung erzeugt wird, und kann bis zu einem gewissen Grad das pathologische Fortschreiten von einer präneoplastischen Läsion zu einem ausgewachsenen Tumor verhindern. TIS tritt auf, wenn Tumorzellen durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung gestresstwerden 5,6.
Seneszenz gilt aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als zweischneidiges Schwert in der Pathologie. Es wurde ursprünglich als ein nützlicher tumorunterdrückender Mechanismus beschrieben, um beschädigte Zellen aus dem zirkulierenden Pool von sich teilenden Zellen zu entfernen, die normale Funktion der Organe zu sichern und das Tumorwachstum zu hemmen 7,8,9. Neue Beweise deuten jedoch auf eine dunkle Seite der Seneszenz hin. Seneszente Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokine, bekannt als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP), was zu Fibrose und fehlfunktionellen Organen führt und die Tumorentstehung und -progressionfördert 10. Darüber hinaus durchlaufen seneszente Krebszellen eine epigenetische und Genexpressions-Reprogrammierung parallel zur Chromatin-Remodellierung und Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort (DDR)11,12 und erwerben neue Krebs-Stammzell-Eigenschaften3. Obwohl seneszenzfähige Tumore im Vergleich zu seneszenzunfähigen Tumoren besser auf therapeutische Interventionen ansprechen13, kann die Persistenz seneszenter Zellen zu einer schlechten Langzeitprognose führen, wenn sie nicht effektiv identifiziert und durch senolytische Medikamente eliminiertwerden 5. In jedem Fall ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Seneszenz von erheblichem klinischem Interesse, nicht nur für die Prognose der Therapiebehandlung, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Strategien für seneszente Zellen.
Unabhängig von verschiedenen Auslösern weisen seneszente Zellen einige gemeinsame Merkmale auf, darunter vergrößerte, abgeflachte, mehrkernige Morphologie mit großen Vakuolen, signifikant expandierte Kerne, Bildung von H3K9me3-reichem Seneszenz-assoziiertem Heterochromatin (SAHF) im Zellkern, persistierende Ansammlung von DNA-Schadensmarker-γH2AX-Herden, aktiviertes p53-p21CIP1 und Rb-p16INK4a Zellzyklus-Regulationsmechanismen, stabiler G1-Zellzyklus-Stillstand, massive Induktion von SASP und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal) 14. Da kein einzelner Marker ausreicht, um die Seneszenz zu definieren, wird die enzymatische Färbung für die SA-β-gal-Aktivität, die als Goldstandard für den Seneszenznachweis gilt, normalerweise mit einer immunhistochemischen Färbung für H3K9me3 und Ki67 kombiniert, um TIS15 nachzuweisen. Chemisch-chromogenes SA-β-gal ist jedoch schwer zu quantifizieren. Hier kombinierten wir 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-Galactopyranosid (C 12 FDG) fluoreszenzbasierten SA-β-gal (fSA-β-gal)-Nachweis mit Immunfluoreszenzfärbung für γH2AX und EdU-inkorporierte DNA, um C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszente Zellen mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometersystem zu identifizieren, das die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Diese Methode ermöglicht die schnelle Generierung von hochauflösenden Bildern, die die Positionierung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen, während die schnelle Analyse mehrerer Proben durch den Bau von Standardpipelines lizenziert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67+ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium an Yong Yu von der Johannes Kepler Universität Linz (BERM16108001) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
