治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出
Summary
ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。
Abstract
化学療法薬は、癌細胞に回復不能なDNA損傷を誘発し、アポトーシスまたは早期老化をもたらす可能性がある。アポトーシス細胞死とは異なり、老化は癌細胞の増殖を抑制する根本的に異なる機構である。何十年にもわたる科学的研究により、がん細胞や間質細胞を調節する腫瘍や微小環境における老化がん細胞の複雑な病理学的影響が明らかになってきました。新しい証拠は、老化が癌治療中の強力な予後因子であることを示唆しているため、癌サンプル中の老化細胞の迅速かつ正確な検出が不可欠である。本稿では、がん細胞における治療誘発性老化(TIS)を可視化・検出する方法を提示する。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)細胞株をマフォスファミド(MAF)またはダウノルビシン(DN)で処理し、老化マーカー、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)、DNA合成マーカー5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)、およびDNA損傷マーカーγ-H2AX(γH2AX)について調べた。フローサイトメーターイメージングは、高解像度の単一細胞画像を短時間で生成し、がん細胞の3つのマーカーを同時に視覚化および定量化するのに役立ちます。
Introduction
様々な刺激が細胞老化を誘発し、細胞が安定した細胞周期停止の状態に入る原因となり得る。これらの刺激には、内因性シグナル伝達変化または外因性ストレスが含まれる。内因性シグナルには、進行性テロメア短縮、テロメア構造の変化、エピジェネティック修飾、プロテオスタシス障害、ミトコンドリア機能障害、および癌遺伝子の活性化が含まれる。外因性ストレスには、炎症性および/または組織損傷シグナル、放射線または化学的処置、および栄養欠乏が含まれる1,2,3,4。異なるタイプの老化の中で、最も一般的に見られ、よく研究されているのは、複製性老化、癌遺伝子誘発性老化(OIS)、放射線誘発性老化、および治療誘発性老化(TIS)である。OISは、異常な癌遺伝子活性化によって生じる複製ストレスによって引き起こされる遺伝毒性損傷に対する急性細胞応答であり、腫瘍前病変から本格的な腫瘍への病理学的進行をある程度防ぐことができる。TISは、腫瘍細胞が化学療法薬または電離放射線によってストレスを受けているときに起こります5,6。
老化は、その非常にダイナミックな性質のために病理学において諸刃の剣と考えられている。当初、分裂細胞の循環プールから損傷細胞を除去し、臓器の正常な機能を保護し、腫瘍増殖を阻害する有益な腫瘍抑制機構として記載されていた7,8,9。しかし、新たな証拠は老化の暗い側面を示唆している。老化細胞は、老化関連分泌表現型(SASP)として知られる炎症誘発性サイトカインを分泌し、線維症および機能不全の器官をもたらし、腫瘍の開始および進行を促進する10。さらに、老化癌細胞は、クロマチンリモデリングおよび持続的DNA損傷応答(DDR)11,12の活性化と並行してエピジェネティックおよび遺伝子発現リプログラミングを受け、新たに新しい癌幹細胞特性を獲得する3。老化可能な腫瘍は、老化が不可能な腫瘍と比較して治療介入に対してよりよく応答するが13、老化細胞の持続性は、それらが血清分解薬によって効果的に同定および排除されない場合、長期予後不良につながる可能性がある5。いずれにせよ、老化を評価するための信頼できる方法は、治療治療の予後だけでなく、老化細胞を標的とする新規戦略の開発にとっても、重要な臨床的関心がある。
異なるトリガーにかかわらず、老化細胞は、大きな液胞を有する拡大、扁平化、多核形態、有意に拡張された核、核内のH3K9me3リッチ老化関連ヘテロクロマチン(SAHF)の形成、DNA損傷マーカーγH2AX病巣の持続的な蓄積、活性化p53-p21CIP1およびRb-p16 INK4aを含むいくつかの共通の特徴を示す。 細胞周期調節機構、安定したG1細胞周期停止、SASPの大量誘導、および老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−gal)活性の上昇14。老化を定義するのに十分な単一のマーカーはないため、老化検出のゴールドスタンダードと考えられているSA-β-gal活性の酵素染色は、通常、H3K9me3およびKi67の免疫組織化学染色と組み合わせてTIS15を検出します。しかしながら、化学的発色系SA−β−galは定量化が困難である。ここでは、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-D-ガラクトピラノシド(C12FDG)蛍光ベースのSA-β-gal(fSA-β β-gal)検出とγH2AXおよびEdU組み込みDNAの免疫蛍光染色を組み合わせて、速度、感度、詳細な単一細胞画像とフローサイトメトリーおよび顕微鏡では提供できない空間情報を組み合わせた高度なイメージングフローサイトメーターシステムを使用して、C12 FDG+EdU-γH2AX+老化細胞を同定しました。この方法により、細胞内の蛍光シグナルの位置決めと定量を可能にする高解像度画像の迅速な生成が可能になり、標準パイプラインを構築することで複数のサンプルの迅速な分析がライセンスされます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、明視野イメージングおよびフローサイトメトリーベースの定量化を用いて、化学療法治療時の4つの異なるDLBCL細胞株の老化侵入能力を調べた。単一細胞レベルでは、治療されたKARPAS422およびWSU-DLCL2細胞において主要なC12 FDG+EdU-Ki67+老化集団を検出することに成功し、OCI-LY1細胞においてより少ない程度であったが、SU-DHL6細胞株は治療に対して耐性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ヨハネス・ケプラー大学リンツ校(BERM16108001)からヨン・ユーへの助成金によって支援されました。
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
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