Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T
Summary
Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.
Abstract
A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.
Introduction
A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um domínio de reconhecimento de antígeno geralmente consistindo de um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo monoclonal que é específico para um antígeno associado ao tumor 3,4. Quando um CAR interage com seu antígeno associado ao tumor, as células CAR-T são ativadas, levando a uma resposta antitumoral envolvendo liberação de citocinas, degranulação citolítica, expressão do fator de transcrição e proliferação de células T. Para produzir células CAR-T, o sangue é coletado do paciente para obter suas células T. Os CARs são geneticamente adicionados às células T do paciente usando um vírus. As células CAR-T são cultivadas in vitro e infundidas de volta no paciente 2,3,4,6. A geração bem-sucedida de células CAR-T é determinada pela eficiência de transdução, que descreve o número de células T que são geneticamente modificadas em células CAR-T.
Atualmente, o padrão-ouro para a geração de células CAR-T é a espinoculação de células T ativadas e vírus em placas revestidas de retronectina 7,8. A transdução começa quando as partículas virais se envolvem com a superfície das células T. A retronectina promove a colocalização de vírus e células, aumentando a eficiência de ligação entre as partículas virais e as células, aumentando a transdução 7,8. A retronectina não funciona bem por si só e precisa ser acompanhada de espinoculação, o que aumenta a transferência gênica, concentrando as partículas virais e aumentando a permeabilidade superficial da célula T, permitindo uma infecção viral mais fácil8. Apesar do sucesso da espinoculação em placas revestidas de retronectina, é um processo complexo que requer múltiplos ciclos de rotação e reagentes caros. Portanto, métodos alternativos para a transferência de genes virais que são mais rápidos e mais baratos são altamente desejáveis.
O alginato é um polissacarídeo aniônico natural amplamente utilizado na indústria biomédica devido ao seu baixo custo, bom perfil de segurança e capacidade de formar hidrogéis após a mistura com cátions divalentes 9,10,11,12. O alginato é um polímero compatível com GMP e é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela FDA13. A reticulação do alginato com cátions cria hidrogéis estáveis frequentemente utilizados na cicatrização de feridas, na entrega de pequenas drogas químicas e proteínas e no transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Devido às suas excelentes propriedades gelificantes, o alginato é o material preferido para criar andaimes porosos por liofilização10,17. Essas características do alginato o tornam um candidato atraente para a produção de um andaime que pode mediar a transferência de genes virais de células ativadas.
Descreve-se aqui um protocolo para a confecção de andaimes de alginato macroporoso secos, conhecidos como andaimes de Drydux, que transduziram estaticamente células T por transferência de genes virais17,18. O processo de fabricação desses andaimes é mostrado na Figura 1. Esses andaimes eliminam a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. Os andaimes de alginato macroporoso estimulam a interação de partículas virais e células T para permitir a transferência eficiente de genes em uma única etapa, sem afetar a funcionalidade e a viabilidade das células T modificadas17. Quando seguidos corretamente, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução de pelo menos 80%, simplificando e encurtando o processo de transdução viral.
Figura 1: Esquema e linha do tempo do protocolo. (A) Linha do tempo para fazer os andaimes secos de alginato macroporoso. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite. Os andaimes congelados são liofilizados por 72 h para criar os andaimes Drydux. (B) Cronograma para transdução viral de células ativadas. As células ativadas e o vírus (MOI 2) são semeados no topo do andaime e incubados em meio completo suplementado com IL-7 e IL-15. Os andaimes absorvem a mistura e promovem a transferência de genes virais. O EDTA é usado para dissolver os andaimes e isolar as células transduzidas. Após a lavagem duas vezes com PBS, o pellet celular pode ser usado para análise. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através dos Números de Concessão R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos ao núcleo de citometria de fluxo da NCSU pelo treinamento e orientação na análise da citometria de fluxo. Os esquemas foram criados com Biorender.com
Materials
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | – | – | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | – | – | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | – | – | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | – | – | 1 x 106 TU/mL |
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