نموذج جديد عالي الإنتاجية لجرح جلد الأغنام خارج الجسم الحي لاختبار المضادات الحيوية الناشئة
Summary
يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لإعداد نموذج جلدي مصاب خارج الجسم الحي مصاب بالمكورات العنقودية الذهبية. يحاكي هذا النموذج عالي الإنتاجية العدوى في الجسم الحي بشكل أفضل مقارنة بتقنيات علم الأحياء الدقيقة التقليدية ويقدم للباحثين منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاختبار فعالية مضادات الميكروبات الناشئة.
Abstract
يعد تطوير مضادات الميكروبات عملية مكلفة مع معدلات نجاح منخفضة بشكل متزايد ، مما يجعل المزيد من الاستثمار في أبحاث اكتشاف مضادات الميكروبات أقل جاذبية. يمكن جعل اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات وتسويقها لاحقا أكثر ربحا إذا كان من الممكن تنفيذ نهج الفشل السريع والرخيص في مراحل تحسين الرصاص حيث يتمتع الباحثون بسيطرة أكبر على تصميم الأدوية وصياغتها. في هذه المقالة ، تم وصف إعداد نموذج جلد مصاب بالغنام خارج الجسم الحي مصاب بالمكورات العنقودية الذهبية ، وهو بسيط وفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية وقابل للتكرار. تحاكي الفسيولوجيا البكتيرية في النموذج أنه أثناء العدوى يعتمد الانتشار البكتيري على قدرة العامل الممرض على إتلاف الأنسجة. يتم التحقق من إنشاء عدوى الجرح من خلال زيادة في عدد البكتيريا القابلة للحياة مقارنة باللقاح. يمكن استخدام هذا النموذج كمنصة لاختبار فعالية مضادات الميكروبات الناشئة في مرحلة تحسين الرصاص. يمكن القول إن توافر هذا النموذج سيوفر للباحثين الذين يطورون مضادات الميكروبات نموذجا سريعا ورخيصا ، مما سيساعد على زيادة معدلات النجاح في التجارب اللاحقة على الحيوانات. وسيسهل النموذج أيضا الحد من استخدام الحيوانات وتحسينه لأغراض البحوث، وفي نهاية المطاف يمكن من ترجمة أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة لمضادات الميكروبات الجديدة لالتهابات الجلد والأنسجة الرخوة إلى العيادة.
Introduction
تعد الالتهابات الجلدية قضية عالمية مهمة ، مع تكاليف اقتصادية كبيرة لمقدمي الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم. يلعب تطور مقاومة الأدوية المتعددة وتكوين الأغشية الحيوية بواسطة مسببات الأمراض دورا رئيسيا في انتشار الجروح غير الملتئمة1،2،3،4. نتيجة لذلك ، تعد التهابات الجلد والأنسجة الرخوة أحد الأسباب الأكثر شيوعا لتمديد فترة الاستشفاء وإعادة القبول اللاحقة5. التأخير في التئام الجروح مكلف لكل من المرضى ومقدمي الرعاية الصحية ، حيث تشير بعض التقديرات إلى أن حوالي 6.5 مليون مريض يتأثرون سنويا في الولايات المتحدة. في المملكة المتحدة ، تؤدي الالتهابات الجلدية والمضاعفات المرتبطة بها إلى ما يقرب من 75000 حالة وفاة سنويا2،4،6.
المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) هي ممرض هائل للجرح يتم عزله بشكل متكرر عن جروح المرضى 2,7. زاد معدل ظهور مقاومة الأدوية المتعددة بشكل كبير في 2000s. خلال هذا الوقت ، كان حوالي 60٪ من التهابات الجلد البكتيرية الحادة والتهابات بنية الجلد إيجابية للثقافة لمقاومة الميثيسيلين 1. يشير العدد المتزايد من السلالات المقاومة للأدوية المتعددة بين المكورات العنقودية ، وفي الواقع مسببات الأمراض الأخرى ، خلال العقود الماضية 2 إلى الحاجة الملحة للتطوير السريع للمضادات الحيوية مع طرق جديدة للعمل يمكنها التغلب على المقاومة.
ومع ذلك ، منذ أوائل عام 2000 ، سيطرت على برامج اكتشاف المضادات الحيوية أوقات نمو أطول ومعدلات نجاح منخفضة ، حيث دخلت 17٪ فقط من المضادات الحيوية الجديدة التجارب السريرية في الولايات المتحدة على موافقة السوق8. يشير هذا إلى وجود تباين بين نتائج الاختبارات المختبرية للمضادات الحيوية الناشئة ونتائجها السريرية . يمكن القول أن هذا التباين يرجع إلى حد كبير إلى الاختلافات في فسيولوجيا البكتيريا أثناء العدوى في الجسم الحي وخلال الطرق الميكروبيولوجية التقليدية عند اختبار فعالية المضادات الحيوية في المراحل قبل السريرية في المختبر . لذلك ، هناك حاجة إلى طرق معملية جديدة أكثر تمثيلا لعلم وظائف الأعضاء البكتيرية أثناء العدوى لتحسين معدلات النجاح في برامج اكتشاف المضادات الحيوية.
تشمل الطرق الحالية لدراسة الالتهابات الجلدية دراسات على الحيوانات الحية (مثل الفئران) ، ونماذج الجلد خارج الجسم الحي (مثل الخنازير) ، ونماذج الجلد المهندسة بالأنسجة ثلاثية الأبعاد (مثل الإنسان) 9،10،11،12. يتم تنظيم الدراسات في الحيوانات الحية بشكل صارم ولها إنتاجية منخفضة نسبيا. في النماذج الحيوانية ، تسبب الجروح والعدوى ضائقة كبيرة للحيوانات وتثير مخاوف أخلاقية. تتطلب نماذج الجلد البشري ، خارج الجسم الحي أو الأنسجة المهندسة ، موافقة أخلاقية ، والامتثال للتشريعات المحلية والعالمية (قانون الأنسجة البشرية ، إعلان هلسنكي) ، وهناك صعوبة في الحصول على الأنسجة ، مع بعض الطلبات التي تستغرق سنوات للوفاءبها 13,14. كلا النوعين من النماذج كثيفة العمالة ويتطلبان خبرة كبيرة لضمان النجاح التجريبي. تتطلب بعض نماذج عدوى الجلد خارج الجسم الحي الحالية أقراصا وإضافات ملقحة مسبقا لسرير الجرح لتمكين العدوى. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة بشكل لا يصدق ، إلا أن هناك قيودا في عملية العدوى حيث تحد المواد المضافة من استخدام سرير الجرح كمصدر للمغذيات10،15،16،17. لا يستخدم النموذج الموصوف في هذه الدراسة أي إضافات إلى سرير الجرح ، مما يضمن أن أمراض العدوى وعدد الخلايا القابلة للحياة هي نتيجة للاستخدام المباشر لسرير الجرح كمصدر وحيد للمغذيات.
نظرا للحاجة إلى طرق مختبرية جديدة ، تم تطوير نموذج جديد عالي الإنتاجية خارج الجسم الحي للعدوى الجلدية لاستخدامه في تقييم فعالية المضادات الحيوية الناشئة. تواجه دراسات عدوى الجلد العديد من التحديات – التكاليف المرتفعة ، والمخاوف الأخلاقية ، والنماذج التي لا تظهر صورة كاملة20,21. تسمح نماذج Ex vivo ونماذج 3D explant بتصور أفضل لعملية المرض ويمكن أن يكون للعلاجات تأثير من نموذج أكثر صلة سريريا. هنا ، يتم وصف إعداد نموذج جديد لجلد الأغنام ، وهو بسيط وقابل للتكرار وذو صلة سريريا وله إنتاجية عالية. تم اختيار جلد الأغنام لأن الأغنام هي واحدة من الثدييات الكبيرة التي يشيع استخدامها لنمذجة الاستجابات للعدوى في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فهي متاحة بسهولة من المسالخ ، مما يضمن إمدادا ثابتا بالجلد للبحث ، ولا يتم حرق جثثها ، مما يضمن جودة الأنسجة الجيدة. استخدمت هذه الدراسة S. aureus كممرض نموذجي. ومع ذلك ، فإن النموذج يعمل بشكل جيد مع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تطوير مضادات الميكروبات مشروعا مهما ولكنه مكلف وتقدر تكلفته بحوالي مليار دولار ويستغرق حوالي 15 عاما لإكماله. يتم إجراء أكثر من 90٪ من اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات والدراسات قبل السريرية لفعالية الأدوية المضادة للميكروبات من قبل باحثين أكاديميين وشركات صغيرة إلى متوسطة تضم عادة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا EPSRC (EP / R513313 / 1) على التمويل. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا R.B Elliot and Son Abattoir في كالو ، تشيسترفيلد ، على توفير رؤوس الحملان ولكونها ملائمة للغاية في المراحل الأولى من المشروع ، وكاسيا إيمري لدعمها طوال تطوير هذا البروتوكول ، وفيونا رايت من قسم العدوى والمناعة وأمراض القلب والأوعية الدموية في جامعة شيفيلد لمعالجة عينات الأنسجة وكونها مفيدة بشكل لا يصدق طوال هذا المشروع.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
