새로운 항생제 테스트를 위한 새로운 고처리량 생체 외 난소 피부 상처 모델
Summary
이 프로토콜은 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델을 설정하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 고처리량 모델은 기존 미생물학 기술에 비해 생체 내 감염을 더 잘 시뮬레이션하고 연구자에게 새로운 항균제의 효능을 테스트할 수 있는 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
항균제의 개발은 성공률이 점점 낮아지는 값비싼 과정이므로 항균 발견 연구에 대한 추가 투자가 덜 매력적입니다. 항균 약물 발견 및 후속 상용화는 연구자가 약물 설계 및 제형을 더 잘 제어할 수 있는 리드 최적화 단계 내에서 페일패스트 앤 페일-싸게 접근 방식을 구현할 수 있다면 더 수익성이 높아질 수 있습니다. 이 기사에서는 황색포도상구균에 감염된 생체외 난소 상처 피부 모델의 설정에 대해 설명하며, 이는 간단하고 비용 효율적이며 처리량이 높고 재현 가능합니다. 모델의 박테리아 생리학은 박테리아 증식이 조직을 손상시키는 병원체의 능력에 의존하기 때문에 감염 동안 모방합니다. 상처 감염의 확립은 접종 원에 비해 생존 가능한 박테리아 수의 증가에 의해 확인됩니다. 이 모델은 리드 최적화 단계에서 새로운 항균제의 효능을 테스트하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 이 모델의 가용성은 항균제를 개발하는 연구자들에게 실패-빠른-실패-값싼 모델을 제공하여 후속 동물 실험에서 성공률을 높이는 데 도움이 될 것이라고 주장할 수 있습니다. 이 모델은 또한 연구를 위한 동물 사용의 감소 및 개선을 촉진하고 궁극적으로 피부 및 연조직 감염에 대한 새로운 항균제를 클리닉으로 더 빠르고 비용 효율적으로 번역할 수 있도록 합니다.
Introduction
피부 감염은 전 세계적으로 중요한 문제이며 전 세계 의료 서비스 제공자에게 막대한 경제적 비용이 발생합니다. 병원균에 의한 다제 내성 및 생물막 형성의 발달은 치유되지 않는 상처 1,2,3,4의 유병률에 중요한 역할을합니다. 그 결과, 피부 및 연조직 감염은 장기 입원 및 후속재입원의 가장 일반적인 이유 중 하나입니다5. 상처 치유의 지연은 환자와 의료 제공자 모두에게 비용이 많이 들며, 일부 추정치는 미국에서 매년 약 650 만 명의 환자가 영향을 받는다고 제안합니다. 영국에서는 피부 감염 및 관련 합병증으로 인해 매년 약 75,000 명이 사망합니다 2,4,6.
황색포도상구균(S. aureus)은 환자의 상처 2,7에서 자주 분리되는 강력한 상처 병원체입니다. 다제 내성의 출현률은 2000 년대에 급격히 증가했습니다. 이 기간 동안 급성 세균성 피부 및 피부 구조 감염의 약 60%가 메티실린 내성 S. 아우레우스1에 대해 배양 양성이었습니다. 지난 2 년 동안 포도상 구균 및 실제로 다른 병원균 중 다제 내성 균주의 수가 증가함에 따라 내성을 극복 할 수있는 새로운 작용 방식을 가진 항생제의 신속한 개발이 시급히 필요함을 나타냅니다.
그러나 2000년대 초반부터 항생제 발견 프로그램은 개발 시간이 길어지고 성공률이 낮아져 미국에서 임상 시험에 진입한 새로운 항생제의 17%만이시장 승인을 획득했습니다8. 이는 신종 항생제의 시험관 내 테스트 결과와 임상 결과 간의 차이를 시사합니다. 이러한 불균형은 주로 생체 내 감염 중 및 시험관 내 전임상 단계에서 항생제의 효능을 테스트 할 때 기존의 미생물 학적 방법 동안 박테리아 생리학의 차이 때문이라고 주장 할 수 있습니다. 따라서 항생제 발견 프로그램의 성공률을 높이기 위해 감염 중 박테리아 생리학을보다 잘 대표하는 새로운 실험실 방법이 필요합니다.
피부 감염을 연구하기 위한 현재의 방법은 살아있는 동물(예를 들어, 마우스), 생체외 피부 모델(예를 들어, 돼지), 및 3D 조직-조작된 피부 모델(예를 들어, 인간)에 대한 연구를 포함한다9,10,11,12. 살아있는 동물에 대한 연구는 엄격하게 규제되며 처리량이 상대적으로 낮습니다. 동물 모델에서 상처와 감염은 동물에게 심각한 고통을 유발하고 윤리적 문제를 제기합니다. 생체 외 또는 조직 공학적 인간 피부 모델은 윤리적 승인, 지역 및 글로벌 법률 (인체 조직법, 헬싱키 선언) 준수가 필요하며 조직 획득에 어려움이 있으며 일부 요청은13,14를 이행하는 데 수년이 걸립니다. 두 모델 유형 모두 노동 집약적이며 실험적 성공을 보장하기 위해 상당한 전문 지식이 필요합니다. 일부 현재의 생체 외 피부 감염 모델은 감염을 가능하게 하기 위해 상처 베드에 사전 접종된 디스크와 첨가제가 필요합니다. 이러한 모델은 매우 유용하지만 첨가제가 영양 공급원으로서 상처 침대의 활용을 제한하기 때문에 감염 과정에 한계가 있습니다10,15,16,17. 이 연구에서 설명된 모델은 상처 베드에 첨가제를 사용하지 않으므로 감염 병리 및 생존 가능한 세포 수가 상처 베드를 유일한 영양 공급원으로 직접 활용한 결과입니다.
새로운 실험실 방법의 필요성을 감안할 때, 새로운 항생제의 효능을 평가하는 데 사용하기 위한 피부 감염의 새로운 고처리량 생체 외 난소 모델이 개발되었습니다. 피부 감염 연구는 높은 비용, 윤리적 문제 및 전체 그림을 보여주지 않는 모델20,21과 같은 많은 문제에 직면해 있습니다. 생체 외 모델과 3D 체외이식편 모델을 사용하면 질병 과정을 더 잘 시각화할 수 있으며 치료가 임상적으로 더 관련성이 높은 모델에서 미칠 수 있는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에서, 신규한 양 피부 모델의 설정이 설명되며, 이는 간단하고 재현 가능하며 임상적으로 관련이 있고 높은 처리량을 갖는다. 난소 피부는 생체내에서 감염에 대한 반응을 모델링하기 위해 일반적으로 사용되는 대형 포유동물 중 하나인 양으로 선택되었다. 또한 도축장에서 쉽게 구할 수 있어 연구를 위한 피부를 안정적으로 공급할 수 있으며 시체에 화상이 없어 좋은 조직 품질을 보장합니다. 이 연구는 S. 아우 레 우스를 모범 병원체로 사용했습니다. 그러나이 모델은 다른 미생물과 잘 작동합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
항균제 개발은 중요하지만 비용이 많이 드는 벤처로 약 10억 달러의 비용이 들고 완료하는 데 약 15년이 걸릴 것으로 추정됩니다. 항균제 발견 및 항균제 효능에 대한 전임상 연구의 90% 이상이 학술 연구자 및일반적으로 직원이 50명 미만인 중소기업에 의해 수행됩니다22. 이 팀은 재정적으로 매우 제한되어 있어 번역 연구의 후기 단계에서 납 분자의 실패를 재앙으로 만듭니다. 항…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자금 지원에 대해 EPSRC(EP/R513313/1)에 감사드립니다. 저자는 또한 체스터필드 칼로우에 있는 R.B Elliot과 Son Abattoir에게 어린 양의 머리를 제공하고 프로젝트 초기 단계에서 매우 수용적인 것에 대해 감사하고, 이 프로토콜의 개발 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Kasia Emery, 조직학 샘플을 처리하고 이 프로젝트 전반에 걸쳐 매우 도움이 된 셰필드 대학의 감염, 면역 및 심혈관 질환 부서의 Fiona Wright에게 감사드립니다.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
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