מודל חדשני של פצעי עור Ex Vivo Ovine בתפוקה גבוהה לבדיקת אנטיביוטיקה מתפתחת
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב להגדרת מודל עור פצוע ex vivo ovine הנגוע בסטפילוקוקוס אאורוס. מודל תפוקה גבוהה זה מדמה טוב יותר זיהומים in vivo בהשוואה לטכניקות מיקרוביולוגיה קונבנציונליות ומציג לחוקרים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים.
Abstract
פיתוח של מיקרוביאלים הוא תהליך יקר עם שיעורי הצלחה נמוכים יותר ויותר, מה שהופך את ההשקעה הנוספת במחקר גילוי מיקרוביאלי לפחות אטרקטיבית. גילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות והמסחור שלאחר מכן יכולים להיות משתלמים יותר אם ניתן ליישם גישה של כישלון מהיר ונכשל בזול בשלבי אופטימיזציה של עופרת שבהם לחוקרים יש שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרופות. במאמר זה, ההגדרה של מודל עור פצוע ex vivo ovine נגוע Staphylococcus aureus מתואר, שהוא פשוט, חסכוני, תפוקה גבוהה, וניתן לשחזור. הפיזיולוגיה החיידקית במודל מחקה שבזמן ההדבקה התפשטות חיידקית תלויה ביכולתו של הפתוגן לפגוע ברקמה. הקמת זיהום הפצע מאומתת על ידי עלייה בספירת חיידקים קיימא בהשוואה לאינוקולום. מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים בשלב אופטימיזציה של עופרת. ניתן לטעון כי זמינותו של מודל זה תספק לחוקרים המפתחים חומרים אנטי-מיקרוביאליים מודל של כישלון-מהיר-וכישלון-זול, אשר יסייע להגדיל את שיעורי ההצלחה בניסויים הבאים בבעלי חיים. המודל גם יאפשר הפחתה ועידון של השימוש בבעלי חיים למחקר ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר וחסכוני יותר של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים לזיהומים בעור וברקמות רכות למרפאה.
Introduction
זיהומי עור הם נושא עולמי חשוב, עם עלויות כלכליות גדולות לספקי שירותי בריאות ברחבי העולם. הפיתוח של עמידות רב-תכליתית ויצירת ביופילם על ידי פתוגנים ממלא תפקיד מפתח בשכיחות של פצעים שאינם מחלימים 1,2,3,4. כתוצאה מכך, זיהומים בעור וברקמות רכות הם אחת הסיבות השכיחות יותר לאשפוז ממושך ולאחר מכן לאשפוז חוזר5. עיכובים בריפוי פצעים עולים ביוקר הן למטופלים והן לספקי שירותי הבריאות, כאשר חלק מההערכות גורסות כי כ-6.5 מיליון מטופלים נפגעים מדי שנה בארה”ב. בבריטניה, זיהומי עור וסיבוכים נלווים גורמים לכ-75,000 מקרי מוות בשנה 2,4,6.
סטפילוקוקוס אאורוס (S. aureus) הוא פתוגן פצע אימתני המבודד לעתים קרובות מפצעי מטופלים 2,7. קצב הופעתה של עמידות multidrug גדל באופן דרסטי בשנות ה -2000. במהלך תקופה זו, כ-60% מהזיהומים החריפים בעור ובמבנה העור היו חיוביים לתרבית עבור S. aureus1 העמיד למתיצילין. המספר ההולך וגדל של זנים עמידים למולטי-דרוג בקרב סטפילוקוקים, ואכן פתוגנים אחרים, במהלך 2 העשורים האחרונים מצביע על צורך דחוף בפיתוח מהיר של אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה חדשות שיכולות להתגבר על עמידות.
עם זאת, מאז תחילת שנות ה-2000, תוכניות גילוי אנטיביוטיקה נשלטו על ידי זמני התפתחות ארוכים יותר ושיעורי הצלחה נמוכים, כאשר רק 17% מהאנטיביוטיקה החדשנית שנכנסה לניסויים קליניים בארה”ב השיגה אישור שוק8. זה מצביע על פער בין התוצאות של בדיקות חוץ גופיות של אנטיביוטיקה מתפתחת לבין התוצאות הקליניות שלהן. ניתן לטעון כי פער זה נובע במידה רבה מהבדלים בפיזיולוגיה של חיידקים במהלך זיהומים in vivo ובמהלך שיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות בעת בדיקת היעילות של אנטיביוטיקה בשלבים הפרה-קליניים במבחנה . לכן, יש צורך בשיטות מעבדה חדשניות המייצגות יותר את הפיזיולוגיה של חיידקים במהלך ההדבקה כדי לשפר את שיעורי ההצלחה בתוכניות גילוי אנטיביוטיקה.
השיטות הנוכחיות לחקר זיהומי עור כוללות מחקרים בחיות חיות (למשל, עכברים), מודלים של עור ex vivo (למשל, חזיר), ומודלים תלת-ממדיים של עור מהונדסים על ידי רקמות (למשל, בני אדם)9,10,11,12. מחקרים בבעלי חיים חיים מוסדרים בקפדנות ובעלי תפוקה נמוכה יחסית. במודלים של בעלי חיים, פציעות וזיהומים גורמים למצוקה משמעותית לבעלי החיים ומעוררים חששות אתיים. מודלים של עור אנושי, ex vivo או מהונדסים רקמות, דורשים אישור אתי, עמידה בחקיקה מקומית ועולמית (חוק הרקמות האנושיות, הצהרת הלסינקי), ויש קושי ברכישת רקמות, כאשר חלק מהבקשות לוקחות שנים כדי למלא13,14. שני סוגי המודלים הם עתירי עבודה ודורשים מומחיות משמעותית כדי להבטיח הצלחה ניסיונית. חלק מהמודלים הנוכחיים של זיהום עור ex vivo דורשים דיסקים ותוספים מחוסנים מראש למיטת הפצע כדי לאפשר זיהום; למרות שמודלים אלה שימושיים להפליא, ישנן מגבלות בתהליך ההדבקה שכן תוספים מגבילים את השימוש במיטת הפצע כמקור תזונתי10,15,16,17. המודל המתואר במחקר זה אינו משתמש בתוספים למיטת הפצע, מה שמבטיח כי הפתולוגיה של זיהום וספירת תאים בת קיימא הם תוצאה של ניצול ישיר של מיטת הפצע כמקור ההזנה היחיד.
לאור הצורך בשיטות מעבדה חדשות, פותח מודל ex vivo ovine חדשני בעל תפוקה גבוהה של זיהומי עור לשימוש בהערכת היעילות של אנטיביוטיקה מתפתחת. מחקרים על דלקות עור מתמודדים עם אתגרים רבים – עלויות גבוהות, חששות אתיים ומודלים שאינם מראים תמונה מלאה20,21. מודלים של Ex vivo ומודלים תלת-ממדיים מאפשרים הדמיה טובה יותר של תהליך המחלה וההשפעה שיכולה להיות לטיפולים ממודל רלוונטי יותר מבחינה קלינית. כאן מתוארת ההגדרה של מודל עור שחלות חדשני, שהוא פשוט, ניתן לשחזור, ורלוונטי מבחינה קלינית ובעל תפוקה גבוהה. עור הביצית נבחר מכיוון שכבשים הן אחד היונקים הגדולים המשמשים בדרך כלל למודלים של תגובות לזיהומים in vivo. יתר על כן, הם זמינים בקלות מ abattoirs, הבטחת אספקה קבועה של העור למחקר, ואת הפגרים שלהם הם לא צרוב, מה שמבטיח איכות רקמות טובה. מחקר זה השתמש ב- S. aureus כפתוגן המופתי; עם זאת, המודל עובד היטב עם מיקרואורגניזמים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתוח מיקרוביאלים הוא מיזם חשוב אך יקר, שעלותו מוערכת בכמיליארד דולר ונמשכת כ-15 שנה. מעל 90% מגילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות ומחקרים פרה-קליניים של יעילות תרופות אנטי-מיקרוביאליות מתבצעים על ידי חוקרים אקדמיים וחברות קטנות עד בינוניות עם בדרך כלל פחות מ-50 עובדים22. צוותים אלה מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ל-EPSRC (EP/R513313/1) על המימון. המחברים רוצים להודות גם לר.ב. אליוט וסון אבטויר בקאלואו, צ’סטרפילד, על כך שסיפקו את ראשיהם של הטלאים ועל כך שהיו כל כך נעימים בשלבים המוקדמים של הפרויקט, לקסיה אמרי על תמיכתה לאורך כל פיתוח הפרוטוקול הזה, ולפיונה רייט מהמחלקה לזיהום, חסינות ומחלות לב וכלי דם באוניברסיטת שפילד על עיבוד דגימות ההיסטולוגיה ועל היותם כל כך מועילים להפליא לאורך כל הפרויקט הזה.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
