Ortaya Çıkan Antibiyotikleri Test Etmek için Yeni Bir Yüksek Verimli Ex Vivo Küçükbaş Hayvan Cilt Yara Modeli
Summary
Protokol, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo küçükbaş yaralı cilt modeli oluşturmak için adım adım bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yüksek verimli model, geleneksel mikrobiyoloji tekniklerine kıyasla enfeksiyonları in vivo olarak daha iyi simüle eder ve araştırmacılara ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunar.
Abstract
Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, giderek daha düşük başarı oranlarına sahip pahalı bir süreçtir ve bu da antimikrobiyal keşif araştırmalarına daha fazla yatırım yapmayı daha az çekici hale getirmektedir. Antimikrobiyal ilaç keşfi ve müteakip ticarileştirme, araştırmacıların ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrole sahip oldukları kurşun optimizasyon aşamalarında hızlı ve başarısız ucuz bir yaklaşım uygulanabilirse daha kazançlı hale getirilebilir. Bu makalede, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo ovine yaralı cilt modelinin kurulumu basit, uygun maliyetli, yüksek verim ve tekrarlanabilir olan açıklanmaktadır. Modeldeki bakteriyel fizyoloji, enfeksiyon sırasında bakteriyel proliferasyon olarak patojenin dokuya zarar verme yeteneğine bağlı olduğunu taklit eder. Yara enfeksiyonunun oluşumu, inoküluma kıyasla canlı bakteri sayımlarında bir artış ile doğrulanır. Bu model, kurşun optimizasyonu aşamasında ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için bir platform olarak kullanılabilir. Bu modelin mevcudiyetinin, antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara, sonraki hayvan denemelerinde başarı oranlarını artırmaya yardımcı olacak hızlı ve başarısız ucuz bir model sağlayacağı iddia edilebilir. Model aynı zamanda araştırma için hayvan kullanımının azaltılmasını ve iyileştirilmesini kolaylaştıracak ve sonuçta cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları için yeni antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.
Introduction
Cilt enfeksiyonları, dünyadaki sağlık hizmeti sağlayıcılarına büyük ekonomik maliyetler getiren önemli bir küresel sorundur. Patojenler tarafından çoklu ilaç direncinin ve biyofilm oluşumunun gelişmesi, iyileşmeyen yaraların prevalansında kilit rol oynar 1,2,3,4. Bunun bir sonucu olarak, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları, uzun süreli hastanede yatış ve ardından yeniden kabul için daha yaygın nedenlerden biridir5. Yara iyileşmesindeki gecikmeler hem hasta hem de sağlık hizmeti sağlayıcıları için maliyetlidir ve bazı tahminler ABD’de yılda yaklaşık 6,5 milyon hastanın etkilendiğini göstermektedir. İngiltere’de, cilt enfeksiyonları ve ilişkili komplikasyonlar yılda yaklaşık 75.000 ölümle sonuçlanmaktadır 2.4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) sıklıkla hasta yaralarından izole edilen zorlu bir yara patojenidir 2,7. Çoklu ilaç direncinin ortaya çıkma oranı 2000’li yıllarda büyük ölçüde artmıştır. Bu süre zarfında, akut bakteriyel deri ve cilt yapısı enfeksiyonlarının yaklaşık% 60’ı, metisiline dirençli S. aureus1 için kültür pozitifti. Son 2 on yılda Stafilokoklar ve aslında diğer patojenler arasında çoklu ilaca dirençli suşların sayısının artması, direncin üstesinden gelebilecek yeni etki biçimlerine sahip antibiyotiklerin hızlı bir şekilde geliştirilmesine acil bir ihtiyaç olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, 2000’li yılların başından bu yana, antibiyotik keşif programlarına daha uzun gelişim süreleri ve düşük başarı oranları hakim olmuştur ve ABD’deki klinik çalışmalara giren yeni antibiyotiklerin sadece% 17’si pazar onayını almıştır8. Bu, ortaya çıkan antibiyotiklerin in vitro testlerinden elde edilen sonuçlar ile klinik sonuçları arasında bir eşitsizlik olduğunu göstermektedir. Bu eşitsizliğin büyük ölçüde in vivo enfeksiyonlar sırasında ve in vitro preklinik aşamalarda antibiyotiklerin etkinliğini test ederken geleneksel mikrobiyolojik yöntemler sırasında bakteriyel fizyolojideki farklılıklardan kaynaklandığı iddia edilebilir. Bu nedenle, antibiyotik keşif programlarındaki başarı oranlarını artırmak için enfeksiyon sırasında bakteriyel fizyolojiyi daha iyi temsil eden yeni laboratuvar yöntemlerine ihtiyaç vardır.
Cilt enfeksiyonlarını incelemek için mevcut yöntemler arasında canlı hayvanlar (örneğin, fareler), ex vivo cilt modelleri (örneğin, domuz) ve 3D doku mühendisliği cilt modelleri (örneğin, insan) 9,10,11,12 üzerinde yapılan çalışmalar bulunmaktadır. Canlı hayvanlardaki çalışmalar sıkı bir şekilde düzenlenir ve nispeten düşük verime sahiptir. Hayvan modellerinde, yaralanma ve enfeksiyon hayvanlar için önemli sıkıntılara neden olur ve etik kaygıları gündeme getirir. Ex-vivo veya doku mühendisliği yapılmış insan derisi modelleri, etik onay, yerel ve küresel mevzuata (İnsan Dokusu Yasası, Helsinki Deklarasyonu) uygunluk gerektirir ve bazı taleplerin yerine getirilmesi yıllar süren dokuların elde edilmesinde zorluklar vardır.13,14. Her iki model türü de emek yoğundur ve deneysel başarıyı sağlamak için önemli uzmanlık gerektirir. Bazı mevcut ex vivo cilt enfeksiyonu modelleri, enfeksiyonu sağlamak için yara yatağı için önceden aşılanmış diskler ve katkı maddeleri gerektirir; Bu modeller inanılmaz derecede yararlı olsa da, katkı maddeleri yara yatağının besin kaynağı olarak kullanımını sınırladığı için enfeksiyon sürecinde sınırlamalar vardır10,15,16,17. Bu çalışmada açıklanan model, yara yatağına hiçbir katkı maddesi kullanmamakta, bu da enfeksiyon patolojisinin ve canlı hücre sayımlarının, yara yatağının tek besin kaynağı olarak doğrudan kullanılmasının bir sonucu olmasını sağlamaktadır.
Yeni laboratuvar yöntemlerine duyulan ihtiyaç göz önüne alındığında, ortaya çıkan antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmede kullanılmak üzere cilt enfeksiyonlarının yeni bir yüksek verimli ex vivo küçükbaş modeli geliştirilmiştir. Cilt enfeksiyonu çalışmaları birçok zorlukla karşı karşıyadır: yüksek maliyetler, etik kaygılar ve tam bir resim göstermeyen modeller20,21. Ex vivo modeller ve 3D eksplant modelleri, hastalık sürecinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar ve etki tedavileri klinik olarak daha alakalı bir modelden sahip olabilir. Burada, basit, tekrarlanabilir ve klinik olarak alakalı ve yüksek verime sahip yeni bir küçükbaş hayvan cilt modelinin kurulumu açıklanmaktadır. Koyun, in vivo enfeksiyonlara verilen yanıtları modellemek için yaygın olarak kullanılan büyük memelilerden biri olduğu için küçükbaş hayvan derisi seçilmiştir. Dahası, mezbahalardan kolayca temin edilebilirler, araştırma için sürekli bir cilt kaynağı sağlarlar ve karkasları haşlanmaz, bu da iyi doku kalitesi sağlar. Bu çalışmada örnek patojen olarak S. aureus kullanılmıştır; ancak, model diğer mikroorganizmalarla iyi çalışır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, yaklaşık 1 milyar dolara mal olduğu ve tamamlanması yaklaşık 15 yıl sürdüğü tahmin edilen önemli ama pahalı bir girişimdir. Antimikrobiyal ilaç keşfinin ve antimikrobiyal ilaç etkinliğinin klinik öncesi çalışmalarının% 90’ından fazlası, akademik araştırmacılar ve tipik olarak 50’den az çalışanı olan küçük ve orta ölçekli şirketler tarafından yürütülmektedir22. Bu ekipler finansal olarak çok kısıtlıdır, bu da trans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar EPSRC’ye (EP/R513313/1) finansman için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Calow, Chesterfield’daki R.B Elliot ve Son Mezbaha’ya, kuzu başlarını sağladıkları ve projenin ilk aşamalarında bu kadar uzlaşmacı oldukları için, Kasia Emery’ye bu protokolün geliştirilmesi boyunca verdiği destek için ve Sheffield Üniversitesi Enfeksiyon, Bağışıklık ve Kardiyovasküler Hastalıklar Bölümü’nden Fiona Wright’a histoloji örneklerini işledikleri ve bu proje boyunca inanılmaz derecede yardımcı oldukları için teşekkür etmek istiyorlar.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
