Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylediffusion og samling på polymeroverfyldte lipidmembraner

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Her præsenteres en protokol til at udføre og analysere binding, mobilitet og samling af enkeltmolekyler på kunstige overfyldte lipidmembraner ved hjælp af enkeltmolekyle total intern refleksionsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellulære membraner er meget overfyldte miljøer til biomolekylære reaktioner og signalering. Alligevel anvender de fleste in vitro-eksperimenter , der undersøger proteininteraktion med lipider, nøgne dobbeltlagsmembraner. Sådanne systemer mangler kompleksiteten af trængsel af membranindlejrede proteiner og glycaner og udelukker de tilknyttede volumeneffekter, der opstår på cellulære membranoverflader. Den negativt ladede glasoverflade, hvorpå lipiddobbeltlagene dannes, forhindrer også fri diffusion af transmembranbiomolekyler. Her præsenterer vi en velkarakteriseret polymer-lipidmembran som en efterligning for overfyldte lipidmembraner. Denne protokol anvender polyethylenglycol (PEG) -konjugerede lipider som en generaliseret tilgang til inkorporering af crowders i det understøttede lipiddobbeltlag (SLB). For det første præsenteres en rengøringsprocedure for de mikroskopiske dias og dækslips til udførelse af enkeltmolekyleeksperimenter. Dernæst diskuteres metoder til karakterisering af PEG-SLB'erne og udførelse af enkeltmolekyleeksperimenter af binding, diffusion og samling af biomolekyler ved hjælp af enkeltmolekylesporing og fotoblegning. Endelig viser denne protokol, hvordan man overvåger nanoporesamlingen af bakterielt poredannende toksin cytolysin A (ClyA) på overfyldte lipidmembraner med enkeltmolekylefotoblegningsanalyse. MATLAB-koder med eksempeldatasæt er også inkluderet for at udføre nogle af de almindelige analyser såsom partikelsporing, ekstraktion af diffusiv adfærd og underenhedstælling.

Introduction

Cellulære membraner er meget overfyldte og komplekse systemer1. Molekylær trængsel kan have en betydelig indvirkning på diffusionen af membranbundne enheder som protein og lipider 2,3,4. Tilsvarende påvirkes bimolekylære reaktioner på lipidmembraner som receptordimerisering eller oligomerisering af membrankomplekser af trængsel 5,6,7. Arten, konfigurationen og koncentrationen af crowders kan styre membranbindingen, diffusiviteten og protein-protein-interaktionen på flere måder 8,9. Da det er udfordrende at kontrollere membrantrængsel på cellulære membraner og fortolke dens indflydelse på indlejrede biomolekyler, har forskere forsøgt at etablere alternative in vitro-systemer 10.

En populær tilgang til kunstige overfyldte membraner er doping af dobbeltlagsmembranerne med polymer (såsom polyethylenglycol, PEG)-podede lipider11,12. Under visualiseringen af protein- og lipiddynamik på understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er) beskytter disse polymerer desuden de membranindlejrede komponenter fra det underliggende negativt ladede substrat (såsom glas) ved effektivt at løfte dobbeltlaget væk fra den underliggende understøtning. Ved at variere polymerens størrelse og koncentration kan man kontrollere omfanget af molekylær trængsel samt dens adskillelse fra den underliggende faste støtte13,14. Dette er klart en fordel i forhold til lipid dobbeltlag understøttet på faste substrater uden polymerpuder15,16, hvor transmembranbiomolekyler kan miste deres aktivitet17,18,19. Endnu vigtigere giver det os mulighed for at rekapitulere det overfyldte miljø i cellemembranen in vitro, hvilket er kritisk for mange membranprocesser.

Overfladetransplanterede polymerer på membraner gennemgår også ændringer i deres konfiguration afhængigt af deres podningstæthed12. Ved lave koncentrationer forbliver de i en entropisk oprullet konfiguration, kendt som en svamp, over membranoverfladen. Med stigende koncentration begynder de at interagere og har tendens til at løsne og strække sig, hvilket til sidst giver en tæt børstelignende formation på membranen21. Da overgangen fra svampen til børsteregimet er meget heterogen og manifesterer sig under dårligt karakteriserede forhold i polymeren, er det vigtigt at anvende velkarakteriserede betingelser for trængsel på polymertransplanterede membraner. Sammenlignet med en nylig undersøgelse20 identificerer og rapporterer vi overfyldte membransammensætninger, der opretholder den diffusive transport og aktivitet af transmembranbiomolekyler.

I denne protokol diskuterer vi, hvordan man genererer PEGylated lipidmembraner og giver anbefalinger til PEG-tætheder, der efterligner trængsel i to forskellige regimer af polymerkonfiguration (nemlig svamp og børste). Protokollen beskriver også enkeltmolekylebinding, partikelsporing og fotobleaching dataindsamling og analyse for molekyler indlejret i disse overfyldte membraner. Først beskriver vi de grundige rengøringstrin, samlingen af billedkammeret og genereringen af PEG-SLB'er. For det andet giver vi detaljer om enkeltmolekylebinding, partikelsporing og fotobleaching eksperimenter. For det tredje diskuterer vi i) ekstraktion af de relative bindingsaffiniteter, ii) karakterisering af molekylær diffusion og iii) tælling af underenheder i en proteinsamling fra film af enkeltmolekyler på membranen.

Mens vi karakteriserede dette system med enkeltmolekylebilleddannelse, er protokollen nyttig for alle membranbiofysikere, der er interesserede i at forstå effekten af trængsel på biomolekylære reaktioner på lipidmembraner. Samlet set præsenterer vi en robust pipeline til fremstilling af overfyldte og understøttede lipiddobbeltlag sammen med forskellige enkeltmolekyleassays udført på dem og de tilsvarende analyserutiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengøring af dias og coverslip til enkeltmolekyleeksperimenter

  1. Før samlingen af billedkammeret skal du rengøre og forberede både dækslikker og dias. Bor flere par huller på glasrutsjebanerne ved hjælp af en boremaskine med diamantbelagte bor (0,5-1 mm i diameter). Hvis der anvendes akrylplader, skal du bruge en laserskærer til at lave præcise huller (0,5 mm), som vist i figur 1.
    BEMÆRK: Hvert par huller fungerer som et indløb og udløb til flowudveksling for et individuelt mikrofluidisk kammer. En repræsentativ CAD-fil til huller i et akrylglas er tilgængelig i supplerende kodningsfil 1. Huller boret på glasrutschebaner ender normalt med at være 1,5x-2x større end borets størrelse.
  2. Rengør dias og dæksler med vaskemiddel. Skyl dem grundigt med deioniseret vand. Placer dias og coverslips i en separat glidefarvning (Coplin) krukke med vand og sonikat i en bad sonikator i 30 minutter. For alle sonikeringstrin skal du bruge en 70 W strømindstilling.
  3. Fjern vandet og fyld Coplin-krukken, der indeholder glasrutschebanerne og dækslyngerne med acetone til randen (50-100 ml afhængigt af krukkevolumen). I tilfælde af akrylplader skal du bruge det samme volumen forblandet 50% (v / v) acetoneopløsning, ellers bliver diasene frostige. Ryst Coplin-krukken for at sikre, at alle dias og dækslips er helt nedsænket i opløsningen og sonikerer i en badesonikator i 30 minutter.
  4. Fjern acetonen og kassér den i en affaldsbeholder, hæld methanol i Coplin-glassene (50%, v / v for akrylglas) og soniker i 30 minutter. Både acetone og methanol bruges til at fjerne organiske partikler på diasene.
  5. Skyl rutsjebanerne og dækslerne med rigelige mængder type 1-vand og læg dem i en glas Coplin-krukke. Hæld 1 M KOH-opløsning i krukken og sonikat i 1 time. Til akrylglasene skal du bruge 0,5 M KOH.
  6. Kassér KOH i en uorganisk affaldsbeholder. Skyl krukken med rigeligt vand og læg Coplin-krukkerne i en røghætte til piranha-behandling. Udfør ikke piranha-behandling for akrylglas; Fortsæt direkte til trin 1.9.
    FORSIGTIG: Piranha-behandling skal udføres i en røghætte med passende handsker, sikkerhedsbriller og et forklæde til håndtering af syrer. Piranha-opløsning er et stærkt oxidationsmiddel, og det fjerner eventuelle resterende organiske partikler fra dias og dæksler.
  7. Til fremstilling af piranhaopløsningen hældes forsigtigt et 2/3 volumen svovlsyre (98%, v/v) i et glasbægerglas og fyldes resten med hydrogenperoxid (30%, v/v). Bland opløsningen forsigtigt med en glasstang, hæld den i Coplin-krukken, og lad Coplin-krukken stå i røghætten i mindst 1 time.
  8. Dekanter piranha-opløsningen fra Coplin-krukken i en kasseringsbeholder til syreaffald, der opbevares inde i røghætten. Skyl Coplin-krukken med en rigelig mængde type 1-vand.
  9. Tør dias og dækslips i en blid strøm af nitrogengas og læg dem i en ren Coplin-krukke. De tørrede dias og dækslips er nu klar til plasmabehandling. Tag et par dias og coverslips og læg dem i plasmamaskinen.
  10. Opret et vakuum i kammeret. Drej knappen til radiofrekvensen på 8-12 MHz til generering af plasma i kammeret. En lilla glød inde i kammeret vil indikere dannelsen af et plasma i kammeret.
  11. Udfør plasmabehandlingen i 8-10 min. Slip forsigtigt vakuumet, når du har slukket for plasmaet, og fortsæt til trin 2 til samling af det mikrofluidiske billeddannelseskammer.

2. Samling af det mikrofluidiske kammer

BEMÆRK: Billedkammeret oprettes ved at klemme dobbeltsidet tape mellem en forrenset dæksel og glide fra det foregående trin som beskrevet nedenfor.

  1. Dias samles og dæksel efter plasmabehandlingen som vist i figur 1. Placer glasglasset på et rent silkepapir. Skær det dobbeltsidede bånd i ~2-3 mm brede strimler og placer dem på hver side af et par huller på glasglasset. Brug en pipetspids til at flade båndet ud, ellers vil det forårsage lækage fra den ene kanal til den anden.
    BEMÆRK: Alternativt kan du klippe båndet til hele rutsjebanen ved hjælp af en laser- eller automatiseret plotterskærer (figur 1).
  2. Placer den plasmabehandlede dæksel på det tapede dias for at lukke kammeret. Brug en pipetspids til forsigtigt at trykke dækslikket på de tapede områder for at gøre kanalen vandtæt.
  3. Hvis du bruger glasrutschebaner, skal du forsegle kanterne ved hjælp af epoxyharpiks. Endelig har hvert billedkammer lavet af et dias og coverslip en dimension på 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (længde x bredde x dybde). Opbevar de tilberedte mikrofluidiske billeddannelseskamre i 1-2 uger under udtørrede forhold (helst mellem 10-25 °C).
    BEMÆRK: For de laserskårne bånd, der anvendes med akrylglas, er det ikke nødvendigt at bruge epoxy, da tapekanterne danner en tæt lækagesikker tætning.

3. Fremstilling af understøttede dobbeltlag på glassubstrat ved vesikelfusion

BEMÆRK: Overfyldte understøttede lipiddobbeltlag genereres på væggene i billeddannelseskammeret ved fusion af lipidvesikler fremstillet med doterede PEG-lipider.

  1. Tag et rent glasflaske, helst forrenset ved hjælp af piranha-opløsning. Der tilsættes chloroformopløsning af 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(polyethylenglycol)-2000] (DOPE-PEG2000) ved den ønskede molfraktion af PEG2000-lipider, således at den endelige koncentration efter tilsætning af buffer vil være 3 mM lipider i trin 3.4. Forbered andre membransammensætninger af lipider på samme måde.
  2. Tør chloroformen ud af hætteglasset ved hjælp af en blid strøm af nitrogen med en lille hvirvel, så de tørrede lipider er ensartet belagt på hætteglassets overflade. Sæt hætteglasset i en vakuum udtørring i 1 time. Dette fjerner enhver resterende chloroform i hætteglasset. Der tilsættes 1 ml fosfatbufferet saltvand (PBS), og der inkuberes natten over ved 37 °C.
  3. Forbered små unilamellar vesikler (SUV'er) som beskrevet nedenfor.
    1. Forsigtigt hvirvel i 1-2 minutter efter inkubation natten over, indtil opløsningen bliver uklar og mælkeagtig.
    2. Tag 100 μL af denne opløsning i et lille 500 μL centrifugerør og sonikat i ca. 1 time i en badesonikator (indstillet til en 70 W effektindstilling). Løsningen vil blive klar; hvis ikke, så soniker i yderligere 30 minutter. Dette trin genererer SUV'er på 50-100 nm i diameter.
      BEMÆRK: Hvis du forbereder dig for første gang, skal du karakterisere SUV'erne ved hjælp af dynamisk lysspredning22,23 (DLS) eller en tilsvarende metode.
  4. Tilsæt calciumchlorid (CaCl 2, 3 M lager) til de sonikerede vesikler, således at dets endelige koncentration er 30 mM i lipidopløsningen.
  5. Skær en mikropipettespids til injektion af prøveopløsningen, så den sidder tæt i hullet. Bland lipidopløsningen og injicer gennem et af hullerne i billeddannelseskammeret lavet i trin 2. Tør den overskydende opløsning, der kommer ud af kammeret, af stikkontakten med et rent væv for at forhindre forurening af tilstødende kanaler.
  6. Lad denne samling stå i et befugtet kammer i 90 min. Forbered et befugtningskammer ved at placere et vådt væv i enden af et 50 ml centrifugerør. Placer glideren sidelæns inde i røret med lukkede rørhætter. Blærerne smelter sammen og genererer et ensartet dobbeltlag på glasoverfladen.
  7. Kammeret vaskes grundigt med en rigelig mængde PBS-buffer (ca. 5 gange billeddannelseskammerets volumen). Undgå, at luftbobler kommer ind i kammeret under vask, da dette kan generere defekter i membranen.

4. Mikroskopopsætning og målinger af enkeltpartikelbilleddannelse

BEMÆRK: Enkeltmolekyleeksperimenter udføres på en objektivbaseret total intern refleksionsfluorescens24,25,26 (TIRF) mikroskopopsætning (figur 2). TIRF-billeddannelse giver et bedre signal-støj-forhold til enkeltmolekylebilleddannelse, selvom epi-fluorescensmikroskoper også kan bruges under visse betingelser (især når de fluorescerende biomolekyler kan fjernes fra bulkopløsningen ved vask). Prisme-typen TIRF kan bruges, men måltypen er at foretrække for at lette opsætningen af mikrofluidik27. For TIRF af objektivtypen anbefales et mål med høj numerisk blænde (100x forstørrelse, normalt kommercielt tilgængeligt som et TIRF-mål).

  1. Før du udfører et eksperiment med mobilitet og samling, skal du justere TIRF-mikroskopet for at sikre et optimalt signal-støj-forhold på grund af belysning af det undvigende felt. Under justering skal du holde lasereffekten lav, mellem 100 μW og 1 mW.
    FORSIGTIG: Lasersikkerhedsbriller skal bruges under justeringen af laserstrålen.
    1. For at justere mikroskopet skal du forberede en fluorescerende perleprøve ved at tilføje dem i den mikrofluidiske kanal ved lave koncentrationer (ved ~ 100 pM), således at fluorescerende pletter fra enkeltperler ikke overlapper hinanden i billederne.
    2. Først skal du visualisere perlerne i epifluorescenstilstand. Mens belysningen er i epifluorescenstilstand, skal du flytte M5-spejloversættelsestrinnet (spejlet, der reflekterer laseren til dikroen), således at strålen, der kommer ud af målet, bøjes, indtil den til sidst er i en total intern refleksionskonfiguration.
    3. Kontroller, om TIR-belysning er opnået. Når TIR-undvigelsesfeltet belyser perleprøven, skal det kontrolleres, at kun perlerne på overfladen er synlige, og at fritsvævende perler væk fra overfladen ikke observeres.
  2. I starten af eksperimentet indstilles lasereffekten ved det objektive bagbrændplan til 5-10 mW for at forhindre fotodestruktion (fotobleaching) af fluorophorerne.
  3. Hold diaset på mikroskoptrinnet og fokuser først på den bare membran (uden fluorophorer). Normalt er små spor af urenheder i lipidmembraner tilstrækkelige til at gøre dette. Valgfrit: Inkorporer et lille antal fluorescerende perler eller kvanteprikker (sub picomolar range) under trin 3.1, således at kun to til fem fluorescerende partikler er til stede i synsfeltet for at lette identifikationen af det korrekte fokus.
  4. Prøven (membranproteiner osv.) injiceres ved hjælp af en mikropipette i det PEG-SLB-belagte billeddannelseskammer, der er fremstillet i trin 3.7.
  5. Til måling af enkeltmolekylebindende kinetik skal du bruge en sprøjtepumpe til at strømme de mærkede biomolekyler gennem indløbshullerne ind i det mikrofluidiske kammer (figur 3). Brug en strømningshastighed på 50-500 μL/min.
    1. Start filmanskaffelse, før du tilføjer opløsningen i billedkammeret. Anskaf >5.000 billeder med en billedhastighed på 25-50 billeder/s under kontinuerligt flow, indtil der ikke er yderligere stigning i udseendet af nye pletter på membranoverfladen (Video 1). Følg trinene fra 6.1 for analyse af bindingskinetik.
  6. For enkeltpartikelsporing tilsættes de mærkede biomolekyler i lave koncentrationer (sammenlignet med bindingskonstanten) til kanalen ved hjælp af en mikropipette. Optimer koncentrationen til en tæthed på <0,1 partikler/μm 2, så enkelte partikler sjældent krydser stier (Video 2). Dette sikrer høj kvalitet af spor, der gendannes fra datasættene. Inkuberes om nødvendigt (i tilfælde af dårlig membranbinding af biomolekyler, ~ 10 min) i et befugtningsmiljø og vask kammeret med bufferen.
    BEMÆRK: Vask er nødvendig, hvis bindingen er dårlig på membranen, og de fleste fluorescerende molekyler forbliver i opløsningen. Ellers kan dette forstyrre billeddannelsen og resultere i et dårligt signal-støj-forhold.
  7. Til analyse af enkeltpartikelbane anskaffes 200-500 rammer ved 10-100 rammer / s. Bevar objektivlinsen fokuseret på dobbeltlagsplanet med minimal trindrift i løbet af anskaffelsesintervallet.

5. Billedoptagelse til tælling af underenheder i en proteinsamling

BEMÆRK: Billedoptagelse til estimering af støkiometri kræver kontinuerlig blegning af fluorophorer og påvisning af antallet af trin, indtil der ikke udsendes flere fluoroforer.

  1. Til måling af underenheder tilsættes den relevante koncentration af mærkede biomolekyler (eksempel: se resultater; ClyA blev tilsat ved 25 nM koncentration) til det mikrofluidiske billeddannelseskammer og inkuberes (vaskes om nødvendigt). Inkubere glideren i et befugtningskammer ved den ønskede temperatur i den krævede tid (eksempel: 37 °C og 60 min til samling af ClyA).
  2. Udfør billedoptagelse til fotoblegning med et enkelt molekyle som beskrevet nedenfor.
    1. Vask billedkammeret med en buffer før billeddannelse (om nødvendigt). Placer diaset på mikroskopet, og juster fokus for at visualisere de mærkede molekyler.
    2. Indstil lasereffekten til et niveau, hvor blegningen af fluoroforen sker gradvist (~ 1-5 min). Ideelt set skal fotobleaching-trinhastigheden for hvert samlet biomolekyle holdes >10-20 billeddannelsesrammer fra hinanden. Anskaf billederne, indtil alle molekylerne er helt fotobleget (Video 3).
      BEMÆRK: For at bestemme den samlede varighed af den krævede fotoblegningsbane skal du plotte den gennemsnitlige intensitet af individuelle pletter med antallet af billeddannelsesrammer og bestemme tidskonstanten ved at tilpasse en eksponentiel henfaldsfunktion. Den samlede varighed af erhvervelsen kan indstilles til 5-10 gange tidskonstanten.
  3. Udfør en tidsafhængig samlingsmåling ved at starte filmoptagelse, så snart prøven er introduceret i kammeret, og anskaffe nye fotoblegningsfilm med faste tidsintervaller efter membranbinding fra forskellige segmenter af PEG-SLB.

6. Billed- og dataanalyse

  1. Udfør enkeltpartikelbinding og sporing som beskrevet nedenfor.
    1. Uddrag enkeltpartikelbaner fra de ovenfor erhvervede film, som vist i figur 4. Til at detektere enkelte partikler og spore dem skal du bruge MATLAB-pakken, u-track28 eller Trackmate29, et plugin i ImageJ, som også giver en robust enkeltpartikelsporingsalgoritme. Følg trinnene til opsætning af u-sporanalyse som vist i supplerende fil 1.
      BEMÆRK: De kritiske parametre for sporing af enkeltpartikler er standardafvigelsen for partikelstørrelsen (i pixels) og spaltens lukkelængde. Brug henholdsvis 1 og 0 til disse parametre som de strengeste kriterier for sporing.
    2. For at beregne bindingshastighedskonstanterne skal du først estimere antallet af partikler, der binder til membranoverfladen over tid. Brug MATLAB-filen binding_SPT (supplerende kodningsfil 2) med u-track-outputmappen til at identificere og plotte antallet af partikler, der vises på membranen opnået fra trin 6.1. Tilpas den observerede kinetik til passende kinetiske modeller (eksempel: enkelt eksponentiel pasform til bestemmelse af tidskonstanten, hvis inverse kan henføres til den tilsyneladende hastighedskonstant)30 for at udtrække hastighedskonstanterne (se resultater, figur 5).
    3. Den gennemsnitlige kvadrerede forskydning (MSD) af de diffuserende partikler (såsom DNA-sporstof i PEG-SLB'er, figur 6) angiver diffusionens art. Brug MATLAB-pakken MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) med u-track-outputmappen til at hente MSD-plottet som en funktion af forsinkelsestiden (figur 6B).
    4. For at identificere heterogene diffuserende arter beregnes øjeblikkelige kvadrerede forskydningsfordelinger (ISD) som vist i figur 6C. ISD2, defineret som (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, hvor forsinkelsestid, τ = 2, foretrækkes, da den reducerer støj. Filtrer korte baner med mindre end tre rammer for at reducere støj.
    5. Brug ISD_analyzer (supplerende kodningsfil 2) i MATLAB med u-track-outputtet til at plotte ISD'erne for de sporede partikler (figur 6C).
  2. Udfør enkeltmolekyle fotoblegningsanalyse som beskrevet nedenfor.
    1. For at estimere støkiometrien af membrankomplekserne skal du udføre en fotoblegningsanalyse af de fluorescerende kompleksers tidsafhængige intensiteter (Video 3). Til dette formål skal du anvende en driftskorrektionsalgoritme (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) baseret på autokorrelationen af filmrammer for at udtrække oversættelsesdriften. Dette forudsætter, at de samlede strukturer stort set er ubevægelige under billedoptagelse. Kør MATLAB-pakken Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) for at registrere partikelintensitetstidsspor fra filmene.
    2. Brug MATLAB-koden Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) til at udføre trinregistreringen for intensitetstidssporingerne. Hvis partiklerne ikke er immobile, skal du bruge u-track-pakken til at udtrække placeringen af bevægelige partikler. Dette sæt xy-koordinater kan kortlægges til råfilmene for at udtrække intensitetsværdierne for den bevægelige partikel, da den diffunderer sideværts på membranen. Brug MATLAB-pakken utrack_Int (Supplementary Coding File 2) med output fra u-track-analyse til denne indstilling.
    3. Udfør en korrektion for ufuldstændig mærkning af biomolekylerne med fluorophore-tags for at estimere den korrekte proteinkompleks støkiometri. Bestem mærkningseffektiviteten med et UV-VIS-spektrofotometer ved at måle absorptionen af farvestof og protein for at estimere koncentrationen. Beregn mærkningseffektiviteten som det molære forhold mellem farvestoffet og proteinet.
      BEMÆRK: Nogle farvestoffer absorberes også ved bølgelængder tæt på 280 nm, og derfor skal dette absorptionsbidrag fra farvestoffet tages i betragtning under koncentrationsberegningen.
    4. Udfør en binomial korrektion for at tage højde for fluoroforens ufuldstændige mærkningseffektivitet på følgende måde ved at bruge MATLAB-koden Step_correction (supplerende kodningsfil 2) med dataene opnået fra trintælling i trin 6.2.2. For eksempel for et poredannende toksin som Cytolysin A, som danner en dodecamerisk ringlignende struktur, skal du anvende en binomial korrektion ved hjælp af følgende formel:
      nkEquation 1
      hvor Equation 2 = mærkningseffektivitet, n = antal fotoblegningstrin og s = faktiske tællinger. Brug MATLAB-rutinen Stepcount_immobile til at genvinde de korrigerede oligomere arter. Frekvensen af oligomerer (si) konverteres til massefraktioner (figur 7C; Supplerende kodningsfil 2).
      BEMÆRK: Et sæt analyserede filer, der er registreret, er inkluderet i supplerende kodningsfil 3. MATLAB-koderne i supplerende kodningsfil 2 kan køres med disse datasæt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvågning af bindingen af ClyA-protein på PEGylated membraner
Efter trin 4.5 estimeres bindingskinetikken ved at plotte antallet af partikler, der binder til membranoverfladen over tid (Video 1). Da ClyA-protein binder til en membran med 5 mol% PEG2000 lipider, øges partikeltætheden og når mætning (figur 5). Et eksponentielt henfald, der passer til de bundne partikler (cyancirkler), giver tidskonstanten (τb) for membranbindingen (især de oprindelige tidspunkter [røde cirkler] er ikke egnede i dette tilfælde).

Mobilitet af DNA-sporstof på overfyldte membraner
Vi bruger almindeligvis DNA-sporstoffer (DNA forankret til membranen med et tocopherol), lipofile sporstoffarvestoffer (f.eks. DiI) eller membranproteiner (f.eks. ClyA) til at karakterisere membranen under PEG-medieret trængsel. Lateral diffusion af mærkede spormolekyler (25-100 pM) kan overvåges ved at billeddanne membranen ved partikelbinding. I mangel af nogen PEG-polymer i membranen viser de fleste sporstoffer (især dem, der strækker sig uden for dobbeltlaget) begrænset diffusion på SLB'er (figur 6A). Med små niveauer af PEG2000 i membranen (0,5-2 mol%) løfter dobbeltlaget sig væk fra den underliggende overflade, og spormolekylerne kan diffundere uden begrænsninger. På den anden side observeres ekstrem indeslutning ved en høj koncentration af PEG (20 mol%), hvor PEG-molekyler er i et tæt børsteregime, med en række adfærd vist imellem. MSD-plottene for disse tre betingelser er vist i figur 6B. Baseret på vores karakterisering af POPC/DOPE-PEG2000 dobbeltlagsmembraner anbefaler vi en 1-3 mol% DOPE-PEG2000 fraktion, der fremkalder trængsel i svamperegimet. Over 7,5 mol% PEG2000-lipid observerer vi begyndelsen af børsteregimet, og sammensætninger indtil 25 mol% PEG2000-lipid kan anvendes til at fremkalde trængsel og indeslutning. De mellemliggende 4-7% PEG2000-lipidbetingelser svarende til overgangen mellem de to regimer er dårligt karakteriseret og bør undgås.

Samling af ClyA på overfyldte membraner
Intensitetsbanerne for individuelle diffraktionsbegrænsede pletter af ClyA-protein efter inkubation på den overfyldte membran (figur 7A, B) viser et stort antal forskellige fotoblegningstrin, hvilket tyder på dannelsen af forskellige samlingsmellemprodukter31. ClyA, der er et transmembranprotein, interagerer med den negativt ladede glasoverflade i fravær af PEG og samles meget dårligt. Ved 7,5 mol% PEG2000 lipider blev de samlede komplekser målt og afbildet i figur 7C. Efter at have korrigeret for mærkningseffektiviteten (0,9 i dette tilfælde) viser den endelige fordeling af oligomerer den dodecameriske ClyA-art som den dominerende struktur, i overensstemmelse med strukturelle data32.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for rengøringstrinnene og mikrofluidisk kammersamling. (A) Glasgliderne og dækslikkerne rengøres med sekventiel sonikering i vaskemiddel, acetone, methanol, KOH og piranhaopløsning med flere skylninger efter type 1 ultrarent vand mellem hvert trin. Dias og dækslips tørres derefter med nitrogengas inden plasmabehandling. (B) Det mikrofluidiske billeddannelseskammer samles derefter ved hjælp af et forskåret dobbeltklæbende tape, der binder glideren til dækslippen. *Akrylglas behandles ikke med piranhaopløsning, og acetone, methanol og KOH anvendes i en koncentration på 50 % (v/v) af den, der anvendes til rengøring af dækslip. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af TIRF-mikroskop. En typisk objektiv type TIRF-mikroskopopsætning tilpasset på et omvendt mikroskop vises med væsentlig optik fremhævet. M1-M5 er spejle til styring af laserstrålen. Linserne L1 og L2 bruges til at udvide laserstrålen, og L3-objektivet fokuserer laserstrålen på objektivets bageste brændplan. I1 og I2 er Iris membraner, der bruges til at justere laserstrålen. En lukker bruges til at styre laserstrålebelysningen, hvilket er afgørende for at forhindre unødvendig fotoblegning af fluorescensmolekylerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Opsætning af membranbindende kinetikflow. Til udførelse af bindingseksperimentet anvendes en tynd PTFE-slange (0,022 i ID x 0,042 i OD) til at strømme prøven ved hjælp af en sprøjtepumpe (billede ikke til skala). Enden af slangen er forbundet med billedkammerets udløb ved hjælp af en mikropipettespids. Kasseringen opsamles i et lille mikrotipreservoir, der er tilsluttet stikkontakten, og det indførte volumen er altid større end 10 gange billedkammerets volumen. Indsat figur, der viser tværsnittet af billedkammeret. (billede ikke at skalere) Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Pipeline til analyse fra enkeltpartikelbaner og fotoblegningsfilm. (A) De erhvervede film blev analyseret ved hjælp af u-track i MATLAB for at opnå banerne som (x, y) og intensiteterne (i) for hver partikel, ramme for ramme. Disse baner blev derefter brugt til at beregne øjeblikkelig kvadratisk forskydning (ISD), ISD1 og ISD2. ISD'erne kan derefter plottes som histogrammer for at identificere mobile arter. Alternativt informerer gennemsnitlige kvadrerede forskydningsplotter (MSD), om bevægelsen er gaussisk, begrænset eller superdiffusiv33,34. Skjult Markov Model35 (HMM) analyse kan anvendes til at skelne mellem forskellige diffusive tilstande af en enkelt partikel. (B) Til fotoblegningsanalysen blev filmene først korrigeret for drift i systemet (om nødvendigt), efterfulgt af partikeldetektion eller sporing ved hjælp af u-spor. Bortset fra at estimere intensitetsfordelingen23 (og andre partikelfunktioner), kan intensitetsbanerne analyseres for antallet af fotoblegningstrin ved hjælp af trinsøgningsalgoritmer36,37,38. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Binding af ClyA til understøttede lipidmembraner med 5 mol% DOPE-PEG2000. En typisk bindingskurve opnås efter at have talt antallet af partikler i hver ramme identificeret ved u-spor. Billeddannelse initieres før strømmen af det membranbindende ClyA-protein. En eksponentiel henfaldsfunktion (sort linje), der passer til partikelantal (cyancirkler), bruges til at genvinde tidskonstanten for bindingen af ClyA til membranen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Mobilitet af lipofilt DNA på PEG-lipid dobbeltlagsmembraner . (A) Skematisk for det lipofile DNA-sporstof i POPC/DOPE-PEG2000-membranen er vist. (B) Gennemsnitlige kvadrerede forskydninger beregnet ud fra enkeltpartikelsporing for forskellige PEG-SLB'er vises. I 2 mol% DOPE-PEG2000 viser DNA-sporstof ren brownsk adfærd sammenlignet med hindret mobilitet i fravær af polymeren (stiplet linje er inkluderet til reference). På den anden side afviger det samme DNA-sporstof væk fra ren brownsk diffusion, hvilket indikerer subdiffusiv bevægelse med nedsat mobilitet i nærværelse af 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) ISD2-distribution til diffusion af lipofil DNA-sporstof i to forskellige PEG2000-lipidmembraner sammenlignes med bare SLB'er .

Figure 7
Figur 7: Fotoblegningsspor og samling af ClyA på lipiddobbeltlagsmembraner . (A,B) Repræsentative tidsspor viser fotoblegningstrin af ClyA nanoporekompleks detekteret i trin 6.2.1. til et samlet ClyA-kompleks med henholdsvis 7 og 5 trin. (C) Fotoblegningstrinfordelingen (grå) for ClyA (25 nM) inkuberet på 64,7% POPC: 27,8% Kolesterol: 7,5% DOPE-PEG2000-membran i 60 minutter ved 37 °C vises. Efter korrektion for den ufuldstændige mærkningseffektivitet vises den estimerede massefraktion af forskellige oligomere arter (magenta). Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Binding af ClyA på membranen. Overvågning af Cy3-mærket ClyA-proteinbinding til SLB-membranen indeholdende 5 mol% DOPE-PEG2000. De bundne partikler detekteres (cyancirkler) ved u-spor, og spor plottes for fem efterfølgende positioner i deres bane. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Diffusion af DNA-sporstof på 2 mol% PEG-membranen. En film til Cy3-mærket DNA forankret til lipidmembranen via tocopherol i 2 mol% PEG2000-membranen. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Fotoblegning film. En film af samlede oligomerer af Cy3-mærkede ClyA-molekyler på membranen indeholdende 7,5 mol% DOPE-PEG2000. Større komplekser fremgår af de flere gange højere intensiteter sammenlignet med et enkelt protein såvel som fra de mange fotoblegningstrin, når partikelintensitet observeres over tid under kontinuerlig belysning. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Oplysninger om, hvordan man bruger u-track og forskellige MATLAB-koder i trin 6. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: En repræsentativ CAD-fil (Computer Aided Design) til fremstilling af huller i akrylrutsjebanen og skæretape til hele diaset. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfiler 2: Komprimeret mappe, der indeholder tilknyttede MATLAB-koder, der er nødvendige til billed- og dataanalyse i trin 6. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfiler 3: Eksempeldata til billed- og dataanalyse i trin 6. MATLAB-koderne er også tilgængelige på https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi enkeltmolekyleeksperimenter på understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er), der manifesterer et overfyldt miljø for membranindlejrede biomolekyler. Det overfyldte miljø genererer en ekskluderet volumeneffekt, hvilket fører til forbedring af biomolekylære reaktioner 1,2,39,40. For PEG-lipidsystemet, hvor polymeren primært optager volumenet uden for dobbeltlaget, er denne effekt især udtalt for molekylære arter med store ecto-domæner. Sammenlignet med lipofile farvestoffer kan diffusionen af et stort hydrofilt molekyle indlejret i membranen, såsom receptorer, glycoproteiner og glycolipider, reduceres signifikant. Ved hjælp af fluorescerende sporstof-DNA forankret til membranen via tocopherol (figur 5) kan vi identificere sådanne trængselseffekter.

Separat løfter tilstedeværelsen af PEG i den nederste indlægsseddel også SLB og reducerer interaktionen mellem biomolekylerne og støttesubstratet14,41. Normalt hindrer den negativt ladede overflade af billedglasoverfladen ofte mobilitet og molekylære reaktioner. Derfor er brugen af PEG-lipider til at løfte membranen væk fra glasset fordelagtig, selv når det ikke er med henblik på trængsel. Man skal dog være omhyggelig med at identificere de koncentrationsregimer, der ikke manifesterer molekylær trængsel i disse tilfælde. For proteiner, der strækker sig over større domæner uden for dobbeltlaget, kan det være nødvendigt at anvende et PEG-lipid med højere molekylvægt såsom PEG500042.

Et par nøglepunkter er kritiske for enkeltmolekylebilleddannelsen på SLB-systemer. Streng rengøring af dias og dækslips er kritisk i enkeltmolekyleeksperimenter (trin 1). Billeddannelse af en overflade med urenheder vil resultere i defekter i lipidmembranen. Dette kan resultere i pletter af fluorescerende mærkede biomolekyler på membranoverfladen. Dækningen og ensartetheden af SLB dannet kan verificeres i et separat præparat ved at dope dobbeltlaget med et lipidfarvestof (DiI eller Lissamin Rhodamine DOPE) og billeddanne det under et fluorescensmikroskop. FRAP-analyse kan bruges til at benchmarke den diffusive adfærd samt43,44.

Til membranbindingseksperimenter (trin 4) skal strømningsopsætningen med slangen grundes med buffer for at forhindre indtrængen af luftbobler i kammeret. Højere strømningshastigheder eller tilstedeværelsen af luftbobler vil sprænge membranen, og molekylerne vil binde direkte til dækslippet. Billedoptagelse skal starte, før strømmen starter, da nogle molekyler diffunderer fra slangen og binder til membranen. Fokusering af målet på dobbeltlaget under billeddannelse kan lettes ved at dope dobbeltlaget i en lav koncentration med guldnanopartikler, kvanteprikker eller fluorescerende perler.

I forbindelse med enkeltpartikelsporingsforsøgene bør antallet af partikler på membranen kontrolleres for at undgå et scenarie, hvor sporingen er udfordrende på grund af overdreven overlapning af partikelbanerne. En anden vigtig faktor at overveje under billeddannelsen er laserkraften. En høj lasereffekt vil fotoblege fluoroforerne hurtigt, mens lav intensitet og de tilsvarende langsomme billedoptagelseshastigheder vil forårsage sløring. Optimal lasereffekt bør give en betydelig banelængde (mindst >5 i gennemsnit), samtidig med at symmetriske og tæt på diffraktionsbegrænsede billeder af partikler opretholdes. Et iltrensningssystem kan også bruges til at forlænge fotoblegningen af fluorophorer45. En begrænsning af fotoblegningsanalysen, der præsenteres her, opstår 37,46 i tilfælde af store molekylære samlinger (~ større end 20 underenheder), såsom det nukleare porekompleks47. I sådanne tilfælde kan en Bayesian-baseret tilgang bruges til at udlede underenhedens befolkning48,49,50.

Mærkningen af biomolekyler med fluorophorer er i de fleste tilfælde ikke fuldstændig51. Dette udgør en udfordring ved optælling af underenheder i en klynge med umærkede arter. En binomial korrektion for den sub-par mærkningseffektivitet er normalt en rimelig tilnærmelse, når støkiometrien af den molekylære art er fast. I mange tilfælde kan oligomere arter være heterogene eller dynamisk skiftende, som i en oligomeriseringsproces, der kræver udvikling af nye værktøjer til udvinding af de underliggende distributioner fra fotoblegningsdata.

Samlet set giver denne protokol en pipeline til generering af PEG-SLB'er med anbefalinger til betingelserne for at bruge, udføre og analysere enkeltmolekylebinding og spore og udføre fotoblegningsanalyse for membranbiomolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender professor Benjamin Schuler for at dele udtrykket plasmid for ClyA-protein. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Biokemi udgave 185
Enkeltmolekylediffusion og samling på polymeroverfyldte lipidmembraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter