Summary
在这里，提出了一种使用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜执行和分析单分子在人工拥挤脂质膜上的结合，迁移率和组装的协议。
Abstract
细胞膜是生物分子反应和信号传导的高度拥挤的环境。然而，大多数探测蛋白质与脂质相互作用的 体外 实验都采用裸双层膜。这种系统缺乏膜包埋蛋白和聚糖拥挤的复杂性，并且排除了在细胞膜表面遇到的相关体积效应。此外，形成脂质双层的带负电荷的玻璃表面可防止跨膜生物分子的自由扩散。在这里，我们提出了一种表征良好的聚合物脂质膜作为拥挤脂质膜的模拟物。该协议利用聚乙二醇（PEG）共轭脂质作为将拥挤者掺入支持的脂质双层（SLB）的通用方法。首先，介绍了用于进行单分子实验的显微镜载玻片和盖玻片的清洁程序。接下来，讨论了表征PEG-SLBs的方法，并使用单分子跟踪和光漂白进行生物分子结合，扩散和组装的单分子实验。最后，该协议演示了如何通过单分子光漂白分析监测拥挤脂质膜上细菌孔形成毒素溶细胞素A（ClyA）的纳米孔组装。还包括带有示例数据集的 MATLAB 代码，以执行一些常见分析，例如粒子跟踪、提取扩散行为和亚基计数。
Introduction
细胞膜是高度拥挤和复杂的系统1。分子拥挤会对蛋白质和脂质2，3，4等膜结合实体的扩散产生相当大的影响。同样，脂质膜上的双分子反应如受体二聚化或膜复合物的寡聚化也受到拥挤5，6，7的影响。拥挤器的性质、构型和浓度可以通过多种方式控制膜结合、扩散率和蛋白质-蛋白质相互作用8，9。由于控制细胞膜上的膜拥挤并解释其对嵌入生物分子的影响具有挑战性，因此研究人员试图建立替代体外系统10。
人工拥挤膜的一种流行方法是用聚合物（如聚乙二醇，PEG）接枝脂质11，12掺杂双层膜。在支撑脂质双层（SLB）上蛋白质和脂质动力学的可视化过程中，这些聚合物通过有效地将双层从底层载体上抬起，另外将膜包埋的组分与底层带负电的基底（如玻璃）隔离开来。通过改变聚合物的大小和浓度，可以控制分子拥挤的程度，以及它与底层固体载体的分离13，14。这显然比在没有聚合物垫15，16的固体底物上支撑的脂质双层更具优势，其中跨膜生物分子可以失去其活性17，18，19。更重要的是，它使我们能够在体外概括细胞膜的拥挤环境，这对于许多膜过程至关重要。
膜上的表面接枝聚合物也会根据其接枝密度12而改变其构型。在低浓度下，它们保持在膜表面上方的熵卷曲结构中，称为蘑菇。随着浓度的增加，它们开始相互作用并趋向于展开和延伸，最终在膜上产生密集的刷状形成21。由于从蘑菇到刷状状态的过渡是高度异质的，并且表现为聚合物的表征条件不佳，因此在聚合物接枝膜上使用表征良好的拥挤条件非常重要。与最近的一项研究20相比，我们确定并报告了维持跨膜生物分子扩散运输和活性的拥挤膜组成。
在该协议中，我们讨论了如何生成聚乙二醇化脂质膜，并为模拟两种不同聚合物配置（即蘑菇和刷子）中的拥挤的PEG密度提供了建议。该协议还描述了嵌入这些拥挤膜中的分子的单分子结合，颗粒跟踪和光漂白数据采集和分析。首先，我们描述了彻底的清洁步骤，成像室的组装以及PEG-SLB的生成。其次，我们提供了单分子结合，粒子跟踪和光漂白实验的详细信息。第三，我们讨论i）提取相对结合亲和力，ii）表征分子扩散，以及iii）从膜上的单分子电影中计数蛋白质组装中的亚基。
虽然我们用单分子成像表征了该系统，但该协议对于所有有兴趣了解拥挤对脂质膜生物分子反应的影响的膜生物物理学家都是有用的。总体而言，我们提出了一个强大的管道，用于制造拥挤和支持的脂质双层，以及对其进行的各种单分子测定和相应的分析程序。
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Protocol
1. 清洁单分子实验的载玻片和盖玻片
- 在组装成像室之前，清洁并准备盖玻片和载玻片。使用带有金刚石涂层钻头（直径 0.5-1 毫米）的钻孔机在载玻片上钻多对孔。如果使用亚克力板，请使用激光切割机打精确的孔（0.5毫米），如图 1所示。
注意：每对孔将充当单个微流体室的流量交换的入口和出口。亚克力幻灯片孔的代表性CAD文件可在 补充编码文件1中找到。在载玻片上钻孔通常最终比钻头尺寸大 1.5-2 倍。 - 用清洁剂清洁载玻片和盖玻片。用去离子水彻底冲洗。将载玻片和盖玻片放入装有水的单独载玻片染色（Coplin）罐中，并在浴超声仪中超声处理30分钟。对于所有超声处理步骤，请使用 70 W 功率设置。
- 取出水，用丙酮填充装有载玻片和盖玻片的 Coplin 罐（50-100 mL，具体取决于罐子体积）。对于亚克力板，请使用相同体积的预混合50%（v / v）丙酮溶液，否则载玻片会变冷。摇动Coplin罐，确保所有载玻片和盖玻片完全浸入溶液中，并在浴超声仪中超声处理30分钟。
- 取出丙酮并将其丢弃在废物容器中，将甲醇倒入Coplin罐中（50%，丙烯酸载玻片为v / v），超声处理30分钟。丙酮和甲醇都用于去除载玻片上的有机颗粒。
- 用大量的 1 型水冲洗载玻片和盖玻片，并将它们放入玻璃 Coplin 罐中。将1M KOH溶液倒入罐中并超声处理1小时。对于亚克力幻灯片，请使用 0.5 M 的 KOH。
- 将KOH丢弃在无机废物容器中。用大量水冲洗罐子，然后将科普林罐子放入通风橱中进行食人鱼治疗。不要对亚克力幻灯片进行食人鱼处理;直接进入步骤 1.9。
注意：食人鱼处理应在通风橱中进行，戴上适当的手套、安全眼镜和用于处理酸的围裙。食人鱼溶液是一种强氧化剂，它可以去除载玻片和盖玻片上残留的有机颗粒。 - 为了制备食人鱼溶液，将2/3体积的硫酸（98%，v / v）轻轻倒入玻璃烧杯中，其余部分填充过氧化氢（30%，v / v）。用玻璃棒小心地混合溶液，将其倒入科普林罐中，然后将科普林罐留在通风橱中至少1小时。
- 将科普林罐中的食人鱼溶液倒入废弃容器中，用于存放在通风橱内的酸性废物。用大量的 1 型水冲洗科普林罐。
- 在温和的氮气流中干燥载玻片和盖玻片，然后将它们放入干净的Coplin罐中。干燥的载玻片和盖玻片现在已准备好进行等离子体处理。取一对载玻片和盖玻片，将它们放入等离子机中。
- 在腔室中产生真空。将旋钮转到 8-12 MHz 的射频以在腔室中产生等离子体。腔室内的紫色光芒将表明腔室内等离子体的形成。
- 进行等离子体处理8-10分钟。关闭等离子体后轻轻释放真空，然后继续执行步骤2以组装微流体成像室。
2. 微流体室的组装
注意：成像室是通过将双面胶带夹在预先清洁的盖玻片和上一步的载玻片之间创建的，如下所述。
- 等离子处理后组装载玻片和盖玻片，如图 1所示。将载玻片放在干净的薄纸上。将双面胶带切成~2-3毫米宽的条带，并将它们放在载玻片上一对孔的每一侧。使用移液器吸头将胶带压平，否则会导致从一个通道泄漏到另一个通道。
注：或者，使用激光或自动绘图仪切割机切割整个载玻片的胶带（图1）。 - 将等离子处理的盖玻片放在压胶载玻片上以关闭腔室。使用移液器吸头将盖玻片轻轻按压到胶带区域，使通道防水。
- 如果使用载玻片，请使用环氧树脂密封边缘。最后，由载玻片和盖玻片制成的每个成像室的尺寸为10 mm x 2 mm x 0.1 mm（长x宽x深）。将制备的微流体成像室在干燥条件下（优选在10-25°C之间）储存1-2周。
注意：对于与亚克力载玻片一起使用的激光切割胶带，没有必要使用环氧树脂，因为胶带边缘形成紧密的防漏密封。
3. 通过囊泡融合在玻璃基板上制作支撑双层
注意：通过用掺杂的 PEG-脂质制备的脂质囊泡的融合，在成像室壁上产生拥挤的支撑脂质双层。
- 取一个干净的玻璃小瓶，最好使用食人鱼溶液预先清洁。以所需的PEG2000脂质摩尔分数加入1-棕榈酰基-2-油酰基甘油-3-磷酸胆碱（POPC）和1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（DOPE-PEG2000）的氯仿溶液，使得加入缓冲液后的最终浓度在步骤3.4中为3mM脂质。类似地制备脂质的其它膜组合物。
- 使用带有小漩涡的温和氮气流从小瓶中干燥氯仿，使干燥的脂质均匀地涂覆在小瓶表面上。将小瓶放入真空干燥器中1小时。这将去除玻璃小瓶中任何残留的氯仿。加入1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在37°C孵育过夜。
- 如下所述准备小的单层囊泡（SUV）。
- 孵育过夜后轻轻涡旋1-2分钟，直到溶液变浑浊和乳白色。
- 在小型 500 μL 离心管中取 100 μL 该溶液，并在浴超声仪（设置为 70 W 功率设置）中超声处理约 1 小时。解决方案将变得清晰;如果没有，则再超声处理 30 分钟。此步骤将生成直径为 50-100 nm 的 SUV。
注意：如果是第一次准备，请使用动态光散射22，23 （DLS） 或等效方法表征 SUV。
- 向超声处理的囊泡中加入氯化钙（CaCl2， 3 M储备液），使其最终浓度在脂质溶液中为30 mM。
- 切开微量移液器吸头以注入样品溶液，使其紧紧地贴合在孔中。混合脂质溶液并通过步骤2中制成的成像室中的一个孔注入。用干净的纸巾擦拭从出口流出的多余溶液，以防止污染相邻通道。
- 将此组件放在加湿室中90分钟。通过在 50 mL 离心管的末端放置湿纸巾来准备加湿室。将载玻片侧向放在管内，管盖关闭。囊泡将融合并在玻璃表面上产生均匀的双层。
- 用大量的PBS缓冲液（大约是成像室体积的5倍）彻底清洗腔室。防止气泡在洗涤时进入腔室，因为这会在膜中产生缺陷。
4. 显微镜设置和单粒子成像测量
注意：单分子实验是在基于物镜的全内反射荧光24，25，26（TIRF）显微镜装置上进行的（图2）。TIRF成像为单分子成像提供了更好的信噪比，尽管落射荧光显微镜也可以在某些条件下使用（特别是当荧光生物分子可以通过洗涤从本体溶液中去除时）。可以使用棱镜型TIRF，但物镜型更可取，以便于设置微流体27。对于物镜型TIRF，建议使用高数值孔径物镜（100倍放大倍率，通常作为TIRF物镜市售）。
- 在进行任何迁移率和组装实验之前，请对准TIRF显微镜，以确保由于倏逝场的照明而获得最佳信噪比。在对准过程中，将激光功率保持在 100 μW 和 1 mW 之间的低功率。
注意：在激光束对准期间应使用激光安全眼镜。- 为了对准显微镜，通过将荧光珠样品以低浓度（~100 pM）添加到微流体通道中来制备荧光珠样品，以使单个珠子的荧光斑点不会在图像中重叠。
- 首先，在落射荧光模式下可视化磁珠。当照明处于落射荧光模式时，移动M5镜平移台（将激光反射到二向色性的镜子），使从物镜出来的光束弯曲，直到最终处于全内反射配置。
- 验证是否已实现 TIR 照明。当TIR倏逝场照亮磁珠样品时，检查是否只有表面上的磁珠可见，并且没有观察到远离表面的自由漂浮磁珠。
- 在实验开始时，将物镜后焦平面处的激光功率设置为5-10 mW，以防止荧光团的光破坏（光漂白）。
- 将载玻片放在显微镜载物台上，首先聚焦在裸膜（没有任何荧光团）上。通常，脂质膜中的微量杂质就足以做到这一点。可选：在步骤3.1中加入少量荧光珠或量子点（亚皮摩尔范围），使得视野中仅存在两到五个荧光颗粒，以便于识别正确的焦点。
- 使用微量移液器将样品（膜蛋白等）注入步骤3.7中制造的PEG-SLB涂层成像室中。
- 为了测量单分子结合动力学，使用注射泵将标记的生物分子通过入口孔流入微流体室（图3）。使用50-500μL/min的流速。
- 在将溶液加入成像室之前开始短片采集。在连续流动下以 25-50 帧/秒的帧速率获取 >5，000 帧，直到膜表面上新斑点的出现不再增加（视频 1）。要分析结合动力学，请按照 6.1 中的步骤操作。
- 对于单颗粒跟踪，使用微量移液器将低浓度（与结合常数相比）的标记生物分子添加到通道中。将浓度优化至<0.1颗粒/ μm 2的密度，以便单个颗粒很少交叉路径（视频2）。这确保了从数据集中恢复的轨迹的高保真度。如果需要，在加湿环境中孵育（在生物分子膜结合不良的情况下，~10分钟），并用缓冲液洗涤腔室。
注意：如果膜上的结合力差并且大部分荧光分子仍保留在溶液中，则需要洗涤。否则，这可能会干扰成像并导致信噪比差。 - 对于单粒子轨迹分析，以 10-100 帧/秒的速度获取 200-500 帧。在采集间隔期间，保持物镜聚焦在双层平面上，载物镜漂移最小。
5. 用于计数蛋白质组装中亚基的图像采集
注意：用于估计化学计量的图像采集需要连续漂白荧光团并检测步骤数，直到不再有荧光团发出荧光。
- 为了测量亚基，添加标记生物分子的相关浓度（例如：见结果;以25nM浓度加入ClyA）到微流体成像室中并孵育（必要时洗涤）。将载玻片在所需温度下的加湿室中孵育所需的时间（例如：37°C和ClyA组装60分钟）。
- 如下所述执行单分子光漂白的图像采集。
- 成像前用缓冲液清洗成像室（如有必要）。将载玻片放在显微镜上并调整焦点以可视化标记的分子。
- 将激光功率设置为荧光团逐渐漂白的水平（~1-5分钟）。理想情况下，对于每个组装的生物分子，将光漂白步速率保持>10-20成像帧。获取图像，直到所有分子完全光漂白 （视频3）。
注意：要确定所需光漂白轨迹的总持续时间，请用成像帧数绘制单个斑点的平均强度，并通过拟合指数衰减函数来确定时间常数。采集的总持续时间可以设置为时间常数的 5-10 倍。
- 通过在将样品引入腔室后立即开始电影采集，并在从PEG-SLB的不同片段结合膜后以固定的时间间隔采集新的光漂白膜，执行随时间变化的组装测量。
6. 图像和数据分析
- 执行单颗粒结合和跟踪，如下所述。
- 从上面采集的电影中提取单粒子轨迹，如图 4所示。要检测单个粒子并跟踪它们，请使用 MATLAB 包 u-track28 或 Trackmate29，这是 ImageJ 中的一个插件，它还提供了强大的单粒子跟踪算法。按照 补充文件 1 中所示的步骤设置 U-track 分析。
注意：单颗粒跟踪的关键参数是颗粒尺寸（以像素为单位）和间隙闭合长度的标准偏差。分别使用 1 和 0 作为最严格的跟踪标准。 - 要计算结合速率常数，首先估计随时间与膜表面结合的颗粒数量。将 MATLAB 文件binding_SPT（补充编码文件 2）与 u-track 输出文件夹一起使用，以识别并绘制从步骤 6.1 获得的膜上出现的颗粒数。将观察到的动力学拟合到适当的动力学模型（例如：单指数拟合以确定时间常数，其逆函数可以分配给表观速率常数）30 以提取速率常数（参见结果， 图5）。
- 扩散颗粒（例如PEG-SLB中的DNA示踪剂， 图6）的均方位移（MSD）表明扩散的性质。将 MATLAB 包MSD_ISD（补充编码文件 2）与 u-track 输出文件夹一起使用，获取 MSD 图作为滞后时间的函数（图 6B）。
- 要识别异质扩散物质，请计算瞬时平方位移（ISD）分布，如图6C所示。ISD2，定义为 （X t+τ - X t）2 + （Yt+τ− Yt）2，其中滞后时间 τ = 2 是首选，因为它可以降低噪声。滤除少于三帧的短轨迹以减少噪声。
- 使用 MATLAB 中的 ISD_analyzer（补充编码文件 2）和 u 轨道输出来绘制跟踪粒子的 ISD（图 6C）。
- 从上面采集的电影中提取单粒子轨迹，如图 4所示。要检测单个粒子并跟踪它们，请使用 MATLAB 包 u-track28 或 Trackmate29，这是 ImageJ 中的一个插件，它还提供了强大的单粒子跟踪算法。按照 补充文件 1 中所示的步骤设置 U-track 分析。
- 如下所述进行单分子光漂白分析。
- 为了估计膜复合物的化学计量，对荧光复合物的时间依赖性强度进行光漂白分析（视频3）。为此，应用基于电影帧自相关的漂移校正算法（drift_correct_images， 补充编码文件2）来提取平移漂移。这假设组装的结构在图像采集过程中基本上是固定的。运行 MATLAB 包Extract_traces_1C（补充编码文件 2）以检测电影中的粒子强度时间轨迹。
- 使用 MATLAB 代码Stepcount_immobile（补充编码文件 2）对强度时间轨迹执行阶跃检测。如果粒子不是静止的，请使用 u-track 包提取移动粒子的位置。这组xy坐标可以映射到原始电影，以提取移动粒子在膜上横向扩散时的强度值。将 MATLAB 包utrack_Int（补充编码文件 2）与此选项的 u-track 分析输出一起使用。
- 对带有荧光团标签的生物分子标记不完整进行校正，以估计正确的蛋白质复合物化学计量。使用紫外-可见分光光度计通过测量染料和蛋白质的吸收来估计浓度，从而确定标记效率。将标记效率计算为染料与蛋白质的摩尔比。
注意：一些染料也会在接近280nm的波长处吸收，因此，在浓度计算过程中应考虑染料的这种吸收贡献。 - 通过使用 MATLAB 代码Step_correction（补充编码文件 2）和从步骤 6.2.2 中的步骤计数中获得的数据，通过以下方式执行二项式校正以解释荧光团的不完整标记效率。例如，对于形成十二碳环状结构的溶细胞素A等孔形成毒素，请使用以下公式应用二项式校正：
恩·
其中
= 标记效率，n = 光漂白步骤数，s = 实际计数。使用 MATLAB 例程Stepcount_immobile来恢复校正后的低聚物质。将低聚物的频率（si）转换为质量分数（图7C; 补充编码文件 2）。
注意：补充编码文件 3 中包含一组跟踪分析的文件。 补充编码文件 2 中的 MATLAB 代码可以使用这些数据集运行。
= 标记效率，n = 光漂白步骤数，s = 实际计数。使用 MATLAB 例程Stepcount_immobile来恢复校正后的低聚物质。将低聚物的频率（si）转换为质量分数（图7C; 补充编码文件 2）。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
监测ClyA蛋白在聚乙二醇化膜上的结合
在步骤4.5之后，通过绘制随时间与膜表面结合的颗粒数量来估计结合动力学（视频1）。当ClyA蛋白与具有5摩尔%PEG2000脂质的膜结合时，颗粒密度增加并达到饱和（图5）。与结合颗粒（青色圆圈）的指数衰减拟合给出了膜结合的时间常数（τb）（值得注意的是，在这种情况下，初始时间点[红色圆圈]不适合）。
DNA示踪剂在拥挤膜上的迁移率
我们通常使用DNA示踪剂（用生育酚锚定在膜上的DNA），亲脂性示踪剂染料（例如DiI）或膜蛋白（例如ClyA）来表征PEG介导的拥挤下的膜。标记示踪分子（25-100 pM）的横向扩散可以通过在颗粒结合时对膜进行成像来监测。在膜中没有任何PEG聚合物的情况下，大多数示踪剂（尤其是那些延伸到双层外的示踪剂）在SLB上显示出有限的扩散（图6A）。当膜中PEG2000含量小（0.5-2摩尔%）时，双层从下层表面抬起，示踪分子可以不受限制地扩散。另一方面，在高浓度的PEG（20mol%）下观察到极端限制，其中PEG分子处于密集的刷状状态，两者之间表现出各种行为。这三种条件下的MSD图如图 6B所示。根据我们对POPC/DOPE-PEG2000双层膜的表征，我们建议使用1-3摩尔%的涂料-PEG2000部分，以诱导蘑菇状态中的拥挤。在7.5摩尔%的PEG2000-脂质以上，我们观察刷子状态的开始，并且可以使用直到25摩尔%的PEG2000-脂质的组合物来诱导拥挤和限制。对应于两种方案之间过渡的4-7%PEG2000脂质条件的特征较差，应避免。
ClyA在拥挤的膜上的组装
在拥挤的膜上孵育后，ClyA蛋白的单个衍射极限斑点的强度轨迹（图7A，B）显示出大量不同的光漂白步骤，表明形成了各种组装中间体31。ClyA是一种跨膜蛋白，在没有PEG的情况下与带负电荷的玻璃表面相互作用，并且组装得非常差。在7.5mol%的PEG2000脂质下，测量组装的配合物，并绘制在图7C中。在校正标记效率（本例中为0.9）后，低聚物的最终分布显示十二碳酸ClyA物种作为主导结构，与结构数据一致32。
图 1：清洁步骤和微流体室组件的示意图。 （A）玻璃载玻片和盖玻片在洗涤剂，丙酮，甲醇，KOH和食人鱼溶液中依次超声处理，每个步骤之间用1型超纯水进行多次冲洗。然后在等离子体处理之前用氮气干燥载玻片和盖玻片。（B）然后使用预切割的双面胶带组装微流体成像室，该胶带将载玻片粘合到盖玻片上。*亚克力载玻片未用食人鱼溶液处理，丙酮、甲醇和KOH的浓度为盖玻片清洁的50%（v/v）。请点击此处查看此图的大图。
图2：TIRF显微镜设置。 图中显示了在倒置显微镜上采用的典型物镜型TIRF显微镜设置，其中突出显示了基本光学元件。M1–M5是用于引导激光束的反射镜。透镜L1和L2用于扩展激光束，L3透镜将激光束聚焦到物镜的后焦平面上。I1和I2是用于对准激光束的虹膜。快门用于控制激光束照明，这对于防止荧光分子不必要的光漂白至关重要。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：膜结合动力学流动设置。 为了进行结合实验，使用细PTFE管（内径0.022 x 外径0.042）在注射泵的帮助动样品（图像未按比例）。管子的末端在微量移液器吸头的帮助下连接到成像室出口。丢弃物收集在插入出口的小微尖端储液器中，引入的体积始终大于成像室体积的10倍。插图显示了成像室的横截面。（图像不按比例缩放）请点击此处查看此图的大图。
图 4：用于分析单粒子轨迹和光漂白电影的管道。 （A）使用MATLAB中的u-track分析采集的电影，以逐帧获得每个粒子的轨迹（x，y）和强度（i）。然后使用这些轨迹来计算瞬时平方位移（ISD），ISD1和ISD2。然后可以将ISD绘制为直方图以识别移动物种。或者，均方位移 （MSD） 图告知运动是高斯、约束还是超扩散33，34。隐马尔可夫模型35（HMM）分析可用于区分单个粒子的不同扩散状态。（B）对于光漂白分析，首先校正电影中的漂移（如有必要），然后使用u-track进行粒子检测或跟踪。除了估计强度分布23（和其他粒子特征）外，还可以使用寻步算法36，37，38分析光漂白步骤的强度轨迹。请点击此处查看此图的大图。
图 5：用 5 mol% DOPE-PEG2000 将 ClyA 与支持的脂质膜结合。在计算由u-track标识的每个帧中的粒子数量后，获得典型的结合曲线。在膜结合的ClyA蛋白流动之前开始成像。拟合粒子数（青色圆圈）的指数衰变函数（黑线）用于恢复ClyA与膜结合的时间常数。请点击此处查看此图的大图。
图 6：亲脂性 DNA 在 PEG-脂质双层膜上的迁移率。 （A） 显示了 POPC/DOPE-PEG2000 膜中亲脂性 DNA 示踪剂的示意图。（B） 显示了根据不同 PEG-SLB 的单粒子跟踪计算得出的平均平方位移。在 2 摩尔% DOPE-PEG2000 中，与缺乏聚合物时的受阻迁移相比，DNA 示踪剂显示出纯布朗行为（包括虚线以供参考）。另一方面，相同的DNA示踪剂偏离了纯布朗扩散，表明在存在20摩尔%DOPE-PEG2000的情况下，亚扩散运动和迁移率降低。（C）将亲脂性DNA示踪剂在两种不同PEG2000脂质膜中扩散的ISD2分布与裸SLB进行比较。 请点击此处查看此图的大图。
图7：光漂白迹线和ClyA在脂质双层膜上的组装 。 （A，B）代表性时间曲线显示了在步骤6.2.1中检测到的ClyA纳米孔复合物的光漂白步骤。分别具有 7 个和 5 个步骤的组装 ClyA 复合体。（C）显示了在64.7%POPC：27.8%胆固醇：7.5%DOPE-PEG2000膜上在37°C下孵育60分钟的ClyA（25nM）的光漂白步骤分布（灰色）。校正不完全标记效率后，显示了各种低聚物质（洋红色）的估计质量分数。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：ClyA在膜上的结合。 监测 Cy3 标记的 ClyA 蛋白与含有 5 摩尔% DOPE-PEG2000 的 SLB 膜的结合。通过 u 轨迹检测束缚粒子（青色圆圈），并绘制轨迹在其轨迹中的五个后续位置。 请点击此处下载此视频。
视频2：DNA示踪剂在2摩尔%PEG膜上的扩散。 Cy3标记的DNA通过2摩尔%PEG2000膜中的生育酚锚定在脂质膜上的电影。 请点击此处下载此视频。
视频3：光漂白电影。 Cy3标记的ClyA分子在含有7.5摩尔%DOPE-PEG2000的膜上组装的低聚物的电影。与单一蛋白质相比，强度高出几倍，以及在连续照明下随时间观察颗粒强度时，从多个光漂白步骤中可以明显看出更大的复合物。 请点击此处下载此视频。
补充文件 1：有关如何在步骤 6 中使用 u-track 和不同 MATLAB 代码的信息。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件1：一个代表性的计算机辅助设计（CAD）文件，用于在亚克力幻灯片上打孔并为整个幻灯片切割胶带。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 2：包含步骤 6 中图像和数据分析所需的相关 MATLAB 代码的压缩文件夹。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件 3：步骤 6 中用于图像和数据分析的示例数据。MATLAB 代码也可在 https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis 获得。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们展示了在支持的脂质双层（SLB）上的单分子实验，这些实验表现出膜嵌入生物分子的拥挤环境。拥挤的环境产生排除体积效应，导致生物分子反应的增强1，2，39，40。对于PEG-脂质系统，其中聚合物主要占据双层外的体积，这种效应对于具有大外结构域的分子物种尤其明显。因此，与亲脂性染料相比，嵌入膜中的大亲水分子（例如受体、糖蛋白和糖脂）的扩散可以显着减少。使用通过生育酚锚定在膜上的荧光示踪剂DNA（图5），我们可以识别这种拥挤效应。
另外，底部小叶中PEG的存在也提升了SLB并减少了生物分子与支撑底物14，41的相互作用。通常，成像玻璃表面的带负电荷的表面经常阻碍迁移率和分子反应。因此，即使不是为了拥挤的目的，使用PEG-脂质将膜从玻璃上抬起也是有利的。然而，必须注意确定在这些情况下不表现出分子拥挤的浓度制度。对于在双层外延伸较大结构域的蛋白质，可能需要使用更高分子量的PEG-脂质，例如PEG5000442。
几个关键点对于SLB系统上的单分子成像至关重要。在单分子实验中，玻片和盖玻片的严格清洁至关重要（步骤1）。用杂质对表面进行成像将导致脂质膜缺陷。这可能导致膜表面出现荧光标记的生物分子斑块。通过用脂质染料（DiI或Lissamine Rhodamine DOPE）掺杂双层并在荧光显微镜下成像，可以在单独的制备中验证所形成的SLB的覆盖范围和均匀性。FRAP分析也可用于对扩散行为进行基准测试43，44。
对于膜结合实验（步骤4），管道的流动装置应涂有缓冲液，以防止气泡进入腔室。较高的流速或气泡的存在会使膜破裂，分子将直接与盖玻片结合。图像采集应在流动开始之前开始，因为一些分子从管道扩散并结合到膜上。通过在低浓度下用金纳米颗粒、量子点或荧光珠掺杂双层，可以促进在成像过程中将物镜聚焦在双层上。
对于单粒子跟踪实验，应控制膜上的颗粒数量，以避免由于粒子轨迹过度重叠而导致跟踪具有挑战性的情况。成像过程中要考虑的另一个重要因素是激光功率。高激光功率会快速光漂白荧光团，而低强度和相应的慢图像采集速率会导致模糊。最佳激光功率应产生显着的轨迹长度（平均至少>5），同时保持对称且接近衍射极限的粒子图像。除氧系统也可用于延长荧光团的光漂白45。这里介绍的光漂白分析的局限性出现在大分子组装体（~大于20个亚基）的情况下，例如核孔复合物47。在这种情况下，可以使用基于贝叶斯的方法推断亚单位群体48，49，50。
在大多数情况下，用荧光团标记生物分子是不完整的51。这给计算具有未标记物种的簇中的亚基带来了挑战。当分子种类的化学计量是固定的时，低于标准的标记效率的二项式校正通常是一个合理的近似值。在许多情况下，低聚物质可能是异质的或动态变化的，例如在寡聚化过程中，需要开发新的工具来从光漂白数据中提取潜在的分布。
总体而言，该协议提供了生成PEG-SLB的管道，并针对使用，执行和分析单分子结合的条件以及跟踪和执行膜生物分子的光漂白分析提供了建议。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Benjamin Schuler教授分享了ClyA蛋白的表达质粒。这项工作得到了人类前沿科学计划（RGP0047-2020）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 - 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
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