Summary
여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
세포막은 생체 분자 반응 및 신호 전달을 위해 매우 밀집된 환경입니다. 그러나 지질과 단백질 상호 작용을 조사하는 대부분의 시험관 내 실험은 네이키드 이중층 막을 사용합니다. 이러한 시스템은 막-포매된 단백질 및 글리칸에 의한 군집의 복잡성이 부족하고 세포막 표면에서 발생하는 관련 부피 효과를 배제합니다. 또한, 지질 이중층이 형성되는 음전하를 띤 유리 표면은 막 횡단 생체 분자의 자유 확산을 방지합니다. 여기에서, 우리는 붐비는 지질 막에 대한 모방으로서 잘 특성화 된 중합체 - 지질 막을 제시한다. 이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 공액 지질을 크라우더를 지지된 지질 이중층(SLB)에 통합하기 위한 일반화된 접근 방식으로 활용합니다. 먼저, 단일 분자 실험을 수행하기 위한 현미경 슬라이드 및 커버슬립의 세척 절차가 제시된다. 다음으로, PEG-SLB를 특성화하고 단일 분자 추적 및 광퇴색을 사용하여 생체 분자의 결합, 확산 및 조립의 단일 분자 실험을 수행하는 방법에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 단일 분자 광퇴색 분석을 통해 붐비는 지질막에서 박테리아 기공 형성 독소 Cytolysin A(ClyA)의 나노기공 어셈블리를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 예제 데이터셋이 포함된 MATLAB 코드도 포함되어 입자 추적, 확산 거동 추출, 소단위 계수와 같은 일반적인 분석을 수행할 수 있습니다.
Introduction
세포막은 매우 밀집되어 있고 복잡한 시스템입니다1. 분자 군집은 단백질 및 지질 2,3,4와 같은 막 결합 개체의 확산에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 유사하게, 수용체 이량체화 또는 막 복합체의 올리고머화와 같은 지질막에 대한 이분자 반응은 군집 5,6,7의 영향을 받습니다. 크라우더의 특성, 구성 및 농도는여러 가지 방법으로 막 결합, 확산성 및 단백질-단백질 상호작용을 제어할 수 있습니다8,9. 세포막의 막 밀집을 제어하고 임베디드 생체 분자에 미치는 영향을 해석하는 것이 어렵 기 때문에 연구자들은 대체 시험관 내 시스템10을 구축하려고 시도했습니다.
인공 군집 막에 대한 대중적인 접근법은 이중층 막을 중합체 (폴리에틸렌 글리콜, PEG와 같은)-접목 된 지질11,12로 도핑하는 것이다. 지지된 지질 이중층(SLB)에서 단백질 및 지질 역학을 시각화하는 동안 이러한 폴리머는 이중층을 기본 지지체에서 효과적으로 들어 올려 기본 음전하를 띤 기판(예: 유리)에서 막 내장 구성 요소를 추가로 보호합니다. 중합체의 크기 및 농도를 변화시킴으로써, 분자 군집의 정도뿐만 아니라 하부 고체 지지체로부터의 분리를 제어 할 수있다(13,14). 이는 막횡단 생체분자가 활성을 잃을 수 있는 폴리머 쿠션(15,16)이 없는 고체 기판 상에 지지된 지질 이중층(17,18,19)에 비해 명백히 이점이다. 더 중요한 것은 시험관 내에서 세포막의 혼잡한 환경을 요약할 수 있다는 것인데, 이는 많은 막 공정에 중요합니다.
멤브레인 상의 표면 그래프팅된 중합체는 또한 이들의 그라프팅 밀도에 따라 이들의 구성에 변화를 겪는다12. 낮은 농도에서는 막 표면 위에 버섯으로 알려진 엔트로피 코일 모양으로 남아 있습니다. 농도가 증가함에 따라, 이들은 상호작용하기 시작하고 풀리고 확장되는 경향이 있으며, 최종적으로 멤브레인(21) 상에 조밀한 브러시-형상 형성을 산출한다. 버섯에서 브러시 정권으로의 전이는 매우 이질적이며 고분자의 특성화 된 조건에서 나타나기 때문에 고분자 접목 막에 밀집하기 위해 잘 특성화 된 조건을 사용하는 것이 중요합니다. 최근 연구20과 비교하여, 우리는 막 횡단 생체 분자의 확산 수송 및 활성을 유지하는 혼잡 한 막 조성을 확인하고보고합니다.
이 프로토콜에서는 PEG화 지질 막을 생성하는 방법에 대해 논의하고 폴리머 구성의 두 가지 다른 정권(즉, 버섯과 브러시)에서 군집을 모방하는 PEG 밀도에 대한 권장 사항을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 이러한 밀집된 막에 내장된 분자에 대한 단일 분자 결합, 입자 추적, 광퇴색 데이터 수집 및 분석을 설명합니다. 먼저 철저한 세척 단계, 이미징 챔버 조립 및 PEG-SLB 생성에 대해 설명합니다. 둘째, 단일 분자 결합, 입자 추적 및 광퇴색 실험에 대한 세부 정보를 제공합니다. 셋째, i) 상대적 결합 친화도 추출, ii) 분자 확산 특성화, iii) 막상의 단일 분자 영화에서 단백질 어셈블리의 서브 유닛 계수에 대해 논의합니다.
이 시스템을 단일 분자 이미징으로 특성화했지만, 이 프로토콜은 지질막에 대한 생체 분자 반응에 대한 군집의 영향을 이해하는 데 관심이 있는 모든 막 생물물리학자에게 유용합니다. 전반적으로, 우리는 혼잡하고 지지된 지질 이중층을 만들기 위한 강력한 파이프라인과 함께 이에 대해 수행된 다양한 단일 분자 분석 및 해당 분석 루틴을 제시합니다.
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Protocol
1. 단일 분자 실험을 위한 슬라이드 및 커버슬립 청소
- 이미징 챔버를 조립하기 전에 커버슬립과 슬라이드를 모두 청소하고 준비하십시오. 다이아몬드 코팅 드릴 비트(직경 0.5-1mm)가 있는 드릴링 머신을 사용하여 유리 슬라이드에 여러 쌍의 구멍을 뚫습니다. 아크릴 시트를 사용하는 경우 그림 1과 같이 레이저 커터를 사용하여 정밀한 구멍 (0.5mm)을 만듭니다.
참고: 각 구멍 쌍은 개별 미세유체 챔버의 흐름 교환을 위한 입구 및 출구 역할을 합니다. 아크릴 슬라이드의 구멍에 대한 대표적인 CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에서 사용할 수 있습니다. 유리 슬라이드에 뚫린 구멍은 일반적으로 드릴 비트 크기보다 1.5x-2x 더 커집니다. - 슬라이드와 커버 슬립을 세제로 청소하십시오. 탈 이온수로 철저히 헹굽니다. 슬라이드와 커버 슬립을 별도의 슬라이드 염색 (Coplin) 병에 물로 넣고 30 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 초음파 처리합니다. 모든 초음파 처리 단계에 대해 70W 전원 설정을 사용하십시오.
- 물을 제거하고 유리 슬라이드와 커버 슬립이 들어있는 Coplin 병에 아세톤을 가장자리까지 채 웁니다 (병 부피에 따라 50-100mL). 아크릴 시트의 경우 동일한 양의 미리 혼합 된 50 % (v / v) 아세톤 용액을 사용하지 않으면 슬라이드가 서리가 내립니다. Coplin 항아리를 흔들어 모든 슬라이드와 커버 슬립이 용액에 완전히 잠기고 30 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 초음파 처리합니다.
- 아세톤을 제거하고 폐기물 용기에 버리고 메탄올을 코플린 병 (50 %, 아크릴 슬라이드의 경우 v / v)에 붓고 30 분 동안 초음파 처리합니다. 아세톤과 메탄올은 모두 슬라이드에서 유기 입자를 제거하는 데 사용됩니다.
- 슬라이드와 커버슬립을 다량의 유형 1 물로 헹구고 유리 코플린 병에 넣습니다. 1M KOH 용액을 항아리에 붓고 1 시간 동안 초음파 처리합니다. 아크릴 슬라이드의 경우 0.5M의 KOH를 사용하십시오.
- KOH는 무기 폐기물 용기에 폐기하십시오. 항아리를 다량의 물로 헹구고 피라냐 처리를 위해 Coplin 병을 흄 후드에 넣으십시오. 아크릴 슬라이드에 피라냐 처리를 수행하지 마십시오. 1.9단계로 바로 이동합니다.
주의 : 피라냐 처리는 적절한 장갑, 보안경 및 산 취급 용 앞치마가있는 흄 후드에서 수행해야합니다. 피라냐 용액은 강력한 산화제이며 슬라이드와 커버 슬립에서 남은 유기 입자를 제거합니다. - 피라냐 용액을 준비하기 위해 2/3 부피의 황산 (98 %, v / v)을 유리 비커에 부드럽게 붓고 나머지는 과산화수소 (30 %, v / v)로 채 웁니다. 용액을 유리 막대와 조심스럽게 섞어 코플린 병에 붓고 코플린 병을 흄 후드에 최소 1시간 동안 그대로 두십시오.
- Coplin 병에서 피라냐 용액을 흄 후드 내부에 보관된 산성 폐기물을 버리는 용기에 담습니다. Coplin 병을 다량의 유형 1 물로 헹굽니다.
- 부드러운 질소 가스 흐름으로 슬라이드와 커버 슬립을 말리고 깨끗한 코플린 병에 넣으십시오. 건조된 슬라이드와 커버슬립은 이제 플라즈마 처리를 위한 준비가 되었습니다. 한 쌍의 슬라이드와 커버 슬립을 플라즈마 기계에 넣으십시오.
- 챔버에 진공을 만듭니다. 챔버에서 플라즈마를 생성하기 위해 손잡이를 8-12MHz의 무선 주파수로 돌립니다. 챔버 내부의 보라색 광선은 챔버에 플라즈마가 형성되었음을 나타냅니다.
- 8-10 분 동안 플라즈마 처리를 수행하십시오. 플라즈마를 끈 후 진공을 부드럽게 해제하고 미세유체 이미징 챔버를 조립하기 위한 단계 2로 진행합니다.
2. 미세유체 챔버의 조립
알림: 이미징 챔버는 아래 설명된 대로 사전 청소된 커버슬립과 이전 단계의 슬라이드 사이에 양면 테이프를 끼워 만듭니다.
- 그림 1과 같이 플라즈마 처리 후 슬라이드와 커버슬립을 조립합니다. 유리 슬라이드를 깨끗한 티슈 페이퍼에 놓습니다. 양면 테이프를 ~2-3mm 너비의 스트립으로 자르고 유리 슬라이드에 있는 한 쌍의 구멍 양쪽에 놓습니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 평평하게 하지 않으면 한 채널에서 다른 채널로 누출이 발생합니다.
주: 또는 레이저 또는 자동 플로터 커터를 사용하여 전체 슬라이드의 테이프를 자릅니다(그림 1). - 플라즈마 처리된 커버슬립을 테이프로 붙인 슬라이드에 놓아 챔버를 닫습니다. 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 테이프로 붙인 부분에 부드럽게 눌러 채널을 방수 처리합니다.
- 유리 슬라이드를 사용하는 경우 에폭시 수지를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오. 마지막으로, 슬라이드와 커버슬립으로 만들어진 각 이미징 챔버의 치수는 10mm x 2mm x 0.1mm(길이 x 너비 x 깊이)입니다. 준비된 미세유체 이미징 챔버를 건조된 조건(바람직하게는 10-25°C)에서 1-2주 동안 보관한다.
알림: 아크릴 슬라이드와 함께 사용되는 레이저 절단 테이프의 경우 테이프 가장자리가 단단한 누출 방지 씰을 형성하므로 에폭시를 사용할 필요가 없습니다.
3. 소포 융합에 의해 유리 기판에지지 된 이중층 만들기
참고: 붐비는 지지된 지질 이중층은 도핑된 PEG-지질로 제조된 지질 소포의 융합에 의해 이미징 챔버의 벽에 생성됩니다.
- 깨끗한 유리 병을 가져 가고, 피라냐 용액을 사용하여 사전 청소하는 것이 좋습니다. 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DOPE-PEG2000)의 클로로포름 용액을 완충액 첨가 후 최종 농도가 단계 3.4에서 3mM 지질이 되도록 PEG2000 지질의 원하는 몰 분율에 첨가한다. 유사하게 지질의 다른 막 조성물을 제조한다.
- 건조된 지질이 바이알 표면에 균일하게 코팅되도록 작은 소용돌이와 함께 부드러운 질소 흐름을 사용하여 바이알에서 클로로포름을 건조시킵니다. 바이알을 진공 데시케이터에 1시간 동안 넣습니다. 이렇게 하면 유리 바이알에 남아 있는 클로로포름이 제거됩니다. 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 아래 설명 된대로 작은 단층 소포 (SUV)를 준비하십시오.
- 밤새 배양 한 후 용액이 탁하고 유백색이 될 때까지 1-2 분 동안 부드럽게 와류하십시오.
- 작은 500 μL 원심 분리기 튜브에서이 용액 100 μL를 취하고 목욕 초음파 처리기 (70 W 전원 설정으로 설정)에서 약 1 시간 동안 초음파 처리합니다. 해결책이 명확해질 것입니다. 그렇지 않은 경우 추가 30 분 동안 초음파 처리하십시오. 이 단계는 직경 50-100nm의 SUV를 생성합니다.
알림: 처음 준비하는 경우 동적 광산란22,23(DLS) 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 SUV를 특성화하십시오.
- 염화칼슘 (CaCl2, 3 M 스톡)을 초음파 처리 된 소포에 첨가하여 최종 농도가 지질 용액에서 30 mM이되도록한다.
- 샘플 용액을 주입하기위한 마이크로 피펫 팁을 구멍에 단단히 고정시킵니다. 지질 용액을 혼합하고 단계 2에서 만든 이미징 챔버의 구멍 중 하나를 통해 주입합니다. 인접한 채널의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 티슈로 배출구에서 챔버에서 나오는 초과 용액을 닦으십시오.
- 이 어셈블리를 가습 챔버에 90분 동안 그대로 두십시오. 50mL 원심분리 튜브 끝에 물티슈를 놓아 가습 챔버를 준비합니다. 튜브 캡을 닫은 상태에서 슬라이드를 튜브 내부에 옆으로 놓습니다. 소포는 융합되어 유리 표면에 균일 한 이중층을 생성합니다.
- 충분한 양의 PBS 버퍼(이미징 챔버 부피의 약 5배)로 챔버를 철저히 세척합니다. 세척하는 동안 챔버에 기포가 들어가는 것을 방지하면 멤브레인에 결함이 발생할 수 있습니다.
4. 현미경 설정 및 단일 입자 이미징 측정
참고: 단일 분자 실험은 대물렌즈 기반 전반사 형광24,25,26(TIRF) 현미경 설정에서 수행됩니다(그림 2). TIRF 이미징은 단일 분자 이미징에 대해 더 나은 신호 대 잡음비를 제공하지만 에피 형광 현미경은 특정 조건에서도 사용할 수 있습니다 (특히 형광 생체 분자를 세척하여 벌크 용액에서 제거 할 수있는 경우). 프리즘형 TIRF가 사용될 수 있지만, 미세유체공학(27)의 설정의 용이성을 위해 대물-형태가 바람직하다. 대물렌즈형 TIRF의 경우 높은 개구수 대물렌즈(100x 배율, 일반적으로 TIRF 대물렌즈로 시판됨)를 권장합니다.
- 이동성 및 조립에 대한 실험을 수행하기 전에 TIRF 현미경을 정렬하여 소멸 필드에 의한 조명으로 인한 최적의 신호 대 잡음비를 보장하십시오. 정렬하는 동안 레이저 출력을 100μW에서 1mW 사이로 낮게 유지하십시오.
주의 : 레이저 빔을 정렬하는 동안 레이저 보안경을 사용해야합니다.- 현미경을 정렬하려면 단일 비드의 형광 반점이 이미지에서 겹치지 않도록 저농도(~100pM)의 미세유체 채널에 형광 비드 샘플을 추가하여 준비합니다.
- 먼저, 비드를 에피형광 모드로 시각화합니다. 조명이 에피형광 모드에 있는 동안 M5 미러 병진 스테이지(레이저를 다이크로익으로 반사하는 미러)를 움직여 대물렌즈에서 나오는 빔이 결국 전체 내부 반사 구성이 될 때까지 구부러지도록 합니다.
- TIR 조명이 달성되었는지 확인합니다. TIR 소멸 필드가 비드 샘플을 비추는 경우 표면의 비드만 보이고 표면에서 떨어진 자유 부동 비드가 관찰되지 않는지 확인합니다.
- 실험 시작 시 대물렌즈 후면 초점면의 레이저 출력을 5-10mW로 설정하여 형광단의 광파괴(광퇴색)를 방지합니다.
- 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 먼저 형광단이 없는 베어 멤브레인에 초점을 맞춥니다. 일반적으로 지질막의 작은 불순물이이를 수행하기에 충분합니다. 선택 사항: 3.1단계 동안 소수의 형광 비드 또는 양자점(sub picomolar 범위)을 통합하여 올바른 초점을 쉽게 식별할 수 있도록 시야에 2-5개의 형광 입자만 존재하도록 합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 시료(멤브레인-단백질 등)를 단계 3.7에서 만든 PEG-SLB 코팅 이미징 챔버에 주입합니다.
- 단일 분자 결합 역학을 측정하려면 주사기 펌프를 사용하여 라벨이 부착된 생체 분자를 입구 구멍을 통해 미세유체 챔버로 흐르게 합니다(그림 3). 50-500 μL / min의 유속을 사용하십시오.
- 용액을 이미징 챔버에 추가하기 전에 동영상 획득을 시작하십시오. 멤브레인 표면에 새로운 반점의 모양이 더 이상 증가하지 않을 때까지 연속 흐름에서 25-50프레임/s의 프레임 속도로 >5,000프레임을 획득합니다(비디오 1). 결합 동역학을 분석하려면 6.1의 단계를 따르십시오.
- 단일 입자 추적을 위해 마이크로피펫을 사용하여 낮은 농도(결합 상수와 비교하여)의 표지된 생체 분자를 채널에 추가합니다. 농도를 <0.1 particles/μm2 의 밀도로 최적화하여 개별 입자가 경로를 거의 교차하지 않도록 합니다(비디오 2). 이렇게 하면 데이터 세트에서 복구된 추적의 높은 충실도가 보장됩니다. 필요한 경우 (생체 분자에 의한 막 결합이 불량한 경우 ~ 10 분) 가습 환경에서 배양하고 완충액으로 챔버를 세척하십시오.
참고: 멤브레인의 결합이 불량하고 대부분의 형광 분자가 용액에 남아 있는 경우 세척이 필요합니다. 그렇지 않으면 이미징을 방해하고 신호 대 잡음비가 저하될 수 있습니다. - 단일 입자 궤적 분석의 경우 10-100프레임/초로 200-500프레임을 획득합니다. 획득 간격 동안 최소한의 스테이지 드리프트로 이중층 평면에 초점을 맞춘 대물 렌즈를 유지합니다.
5. 단백질 어셈블리에서 서브유닛 계수를 위한 이미지 획득
참고: 화학량론을 추정하기 위한 이미지 획득은 형광단의 지속적인 표백과 더 이상 형광단이 형광을 방출하지 않을 때까지 단계 수를 감지해야 합니다.
- 소단위를 측정하려면 표지된 생체 분자의 관련 농도를 추가합니다(예: 결과 참조; ClyA)를 25 nM 농도로 첨가하고, 배양한다(필요한 경우 세척). 슬라이드를 필요한 시간 동안 원하는 온도로 가습 챔버에서 인큐베이션한다(예: ClyA의 조립을 위한 37°C 및 60분).
- 아래 설명된 대로 단일 분자 광퇴색을 위한 이미지 획득을 수행합니다.
- 이미징하기 전에 버퍼로 이미징 챔버를 세척하십시오(필요한 경우). 슬라이드를 현미경에 놓고 초점을 조정하여 라벨링된 분자를 시각화합니다.
- 레이저 출력을 형광단의 표백이 점진적으로 발생하는 수준(~1-5분)으로 설정합니다. 이상적으로는 조립된 각 생체 분자에 대해 광퇴색 단계 속도를 >10-20 이미징 프레임 간격으로 유지하십시오. 모든 분자가 완전히 광표백될 때까지 이미지를 획득합니다 (비디오 3).
참고: 필요한 광퇴색 궤적의 총 지속 시간을 결정하려면 이미징 프레임 수와 함께 개별 지점의 평균 강도를 플로팅하고 지수 감쇠 함수를 피팅하여 시간 상수를 결정합니다. 총 획득 기간은 시간 상수의 5-10 배로 설정할 수 있습니다.
- 샘플이 챔버에 도입되는 즉시 동영상 획득을 시작하고 PEG-SLB의 다른 세그먼트에서 막 결합 후 고정된 시간 간격으로 새로운 광퇴색 영상을 획득하여 시간 종속적 어셈블리 측정을 수행합니다.
6. 이미지 및 데이터 분석
- 아래 설명된 대로 단일 입자 결합 및 추적을 수행합니다.
- 그림 4와 같이 위에서 획득한 동영상에서 단일 입자 궤적을 추출합니다. 단일 입자를 검출하고 추적하려면 MATLAB 패키지, u-track28 또는 강력한 단일 입자 추적 알고리즘을 제공하는 ImageJ의 플러그인인 Trackmate29를 사용하십시오. 보충 파일 1에 표시된 대로 u-트랙 해석을 설정하는 단계를 따릅니다.
참고: 단일 입자 추적의 중요한 매개변수는 입자 크기(픽셀 단위)의 표준 편차와 간격 닫힘 길이입니다. 이러한 매개 변수에 대해 각각 1과 0을 가장 엄격한 추적 기준으로 사용합니다. - 결합 속도 상수를 계산하려면 먼저 시간 경과에 따라 멤브레인 표면에 결합하는 입자의 수를 추정하십시오. MATLAB 파일 binding_SPT(보조 코딩 파일 2)을 u-track 출력 폴더와 함께 사용하여 6.1단계에서 얻은 멤브레인에 나타나는 입자의 수를 식별하고 플로팅합니다. 관찰된 동역학을 적절한 동역학 모델에 피팅합니다(예: 시간 상수를 결정하기 위한 단일 지수 피팅, 그 역수는 겉보기 속도 상수에 할당될 수 있음)30 속도 상수를 추출합니다(결과 참조, 그림 5).
- 확산 입자의 평균 제곱 변위(MSD)(예: PEG-SLB의 DNA 추적자, 그림 6)는 확산의 특성을 나타냅니다. MATLAB 패키지 MSD_ISD(보조 코딩 파일 2)를 u-track 출력 폴더와 함께 사용하여 지연 시간의 함수로 MSD 플롯을 얻습니다(그림 6B).
- 이종 확산 종을 식별하려면 그림 6C와 같이 순간 제곱 변위(ISD) 분포를 계산하십시오. ISD2, (X t+τ - X t)2 + (Y t+τ− Y t)2로 정의되며, 여기서 지연 시간 τ = 2는 잡음을 감소시키기 때문에 선호된다. 3프레임 미만의 짧은 궤적을 필터링하여 노이즈를 줄입니다.
- 추적된 입자의 ISD를 플로팅하려면 MATLAB에서 u-트랙 출력값과 함께 ISD_analyzer(보조 코딩 파일 2)을 사용합니다(그림 6C).
- 그림 4와 같이 위에서 획득한 동영상에서 단일 입자 궤적을 추출합니다. 단일 입자를 검출하고 추적하려면 MATLAB 패키지, u-track28 또는 강력한 단일 입자 추적 알고리즘을 제공하는 ImageJ의 플러그인인 Trackmate29를 사용하십시오. 보충 파일 1에 표시된 대로 u-트랙 해석을 설정하는 단계를 따릅니다.
- 아래 설명된 대로 단일 분자 광퇴색 분석을 수행합니다.
- 막 복합체의 화학량론을 추정하려면 형광 복합체의 시간 의존적 강도에 대한 광퇴색 분석을 수행합니다(비디오 3). 이를 위해 동영상 프레임의 자기 상관을 기반으로 드리프트 보정 알고리즘(drift_correct_images, 보조 코딩 파일 2)을 적용하여 이동 드리프트를 추출합니다. 이것은 조립된 구조가 이미지 획득 중에 크게 움직이지 않는다고 가정합니다. MATLAB 패키지 Extract_traces_1C(보조 코딩 파일 2)를 실행하여 동영상에서 입자 강도 시간 추적을 감지합니다.
- MATLAB 코드 Stepcount_immobile(보조 코딩 파일 2)를 사용하여 강도 시간 추적에 대한 계단 감지를 수행합니다. 입자가 움직이지 않는 경우 u-트랙 패키지를 사용하여 움직이는 입자의 위치를 추출합니다. 이 xy 좌표 세트는 원시 동영상에 매핑하여 멤브레인에서 측면으로 확산되는 움직이는 입자의 강도 값을 추출할 수 있습니다. 이 옵션에 대한 MATLAB 패키지 utrack_Int(보조 코딩 파일 2)를 u-트랙 분석의 출력값과 함께 사용하십시오.
- 형광단 태그가 있는 생체 분자의 불완전한 라벨링에 대한 보정을 수행하여 정확한 단백질 복합 화학량론을 추정합니다. UV-VIS 분광 광도계로 염료와 단백질의 흡수를 측정하여 라벨링 효율을 결정하여 농도를 추정합니다. 단백질에 대한 염료의 몰비로 라벨링 효율을 계산하십시오.
참고: 일부 염료는 280nm에 가까운 파장에서도 흡수되므로 농도 계산 중에 염료에 의한 이러한 흡수 기여도를 고려해야 합니다. - 6.2.2단계의 카운팅 단계에서 얻은 데이터와 함께 MATLAB 코드 Step_correction(보충 코딩 파일 2)을 사용하여 다음과 같은 방식으로 형광단의 불완전한 라벨링 효율을 설명하기 위해 이항 보정을 수행합니다. 예를 들어, 도데카머 고리 같은 구조를 형성하는 Cytolysin A와 같은 기공 형성 독소의 경우 다음 공식을 사용하여 이항 보정을 적용합니다.
엔케이
여기서
= 라벨링 효율, n = 광퇴색 단계 수, s = 실제 카운트. MATLAB 루틴 Stepcount_immobile 사용하여 수정된 올리고머 종을 복구합니다. 올리고머의 주파수(si)를 질량 분율로 변환(도 7C; 보충 코딩 파일 2).
참고: 분석된 사용자 추적 파일 집합은 보조 코딩 파일 3에 포함되어 있습니다. 보조 코딩 파일 2의 MATLAB 코드는 이러한 데이터 세트로 실행할 수 있습니다.
= 라벨링 효율, n = 광퇴색 단계 수, s = 실제 카운트. MATLAB 루틴 Stepcount_immobile 사용하여 수정된 올리고머 종을 복구합니다. 올리고머의 주파수(si)를 질량 분율로 변환(도 7C; 보충 코딩 파일 2).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG화된 막에서 ClyA 단백질의 결합 모니터링
단계 4.5 후, 결합 동역학은 시간 경과에 따라 막 표면에 결합하는 입자의 수를 플로팅하여 추정됩니다 (비디오 1). ClyA 단백질이 5mol% PEG2000 지질로 막에 결합하면 입자 밀도가 증가하고 포화 상태에 도달합니다(그림 5). 결합 된 입자 (청록색 원)에 맞는 지수 붕괴는 막 결합에 대한 시간 상수 (τb)를 제공합니다 (특히이 경우 초기 시점 [빨간색 원]은 적합하지 않음).
붐비는 막에서 DNA 추적자의 이동성
우리는 일반적으로 DNA 추적자(토코페롤로 막에 고정된 DNA), 친유성 추적자 염료(예: DiI) 또는 막 단백질(예: ClyA)을 사용하여 PEG 매개 군집 하에서 막을 특성화합니다. 표지된 추적 분자(25–100 pM)의 측면 확산은 입자 결합 시 멤브레인을 이미징하여 모니터링할 수 있습니다. 멤브레인에 PEG 폴리머가 없는 경우 대부분의 트레이서(특히 이중층 외부로 확장되는 트레이서)는 SLB에서 제한된 확산을 표시합니다(그림 6A). 멤브레인에 PEG2000 수준이 낮으면(0.5–2몰%) 이중층이 기본 표면에서 멀어지고 추적 분자가 제약 없이 확산될 수 있습니다. 반면에, PEG 분자가 조밀 한 브러시 정권에 있고 그 사이에 다양한 행동이 나타나는 고농도의 PEG (20 mol %)에서 극도의 감금이 관찰됩니다. 이러한 세 가지 조건에 대한 MSD 플롯은 그림 6B에 나와 있습니다. POPC / DOPE-PEG2000 이중층 막의 특성화를 기반으로 버섯 정권에서 밀집을 유도하는 1-3 mol % DOPE-PEG2000 분획을 권장합니다. 7.5몰% 이상의 PEG2000-지질은 솔 정권의 개시를 관찰하고, 조성물은 25몰% PEG2000-지질이 군집 및 감금을 유도하기 위해 사용될 수 있을 때까지 관찰한다. 두 정권 사이의 전이에 해당하는 개입 4-7 % PEG2000- 지질 조건은 특성화되지 않으므로 피해야합니다.
붐비는 막에 ClyA 조립
붐비는 막 (그림 7A, B)에서 배양 한 후 ClyA 단백질의 개별 회절 제한 반점의 강도 궤적은 많은 수의 뚜렷한 광 표백 단계를 나타내며, 이는 다양한 조립 중간체(31)의 형성을 시사한다. 막 횡단 단백질 인 ClyA는 PEG가없는 상태에서 음전하를 띤 유리 표면과 상호 작용하며 매우 열악하게 조립됩니다. 7.5몰% PEG2000 지질에서, 조립된 복합체를 측정하고, 도 7C에 플롯팅하였다. 표지 효율(이 경우 0.9)을 보정한 후, 올리고머의 최종 분포는 구조 데이터(32)와 일치하는 도데카머 ClyA 종을 우성 구조로서 표시한다.
그림 1: 세척 단계 및 미세유체 챔버 어셈블리에 대한 개략도. (A) 유리 슬라이드와 커버 슬립은 세제, 아세톤, 메탄올, KOH 및 피라냐 용액에서 순차적 초음파 처리로 세척되며, 각 단계 사이에 유형 1 초순수로 여러 번 헹굼됩니다. 그런 다음 슬라이드와 커버슬립을 플라즈마 처리 전에 질소 가스로 건조시킵니다. (b) 미세유체 이미징 챔버는 슬라이드를 커버슬립에 묶는 미리 절단된 양면 접착 테이프를 사용하여 조립된다. * 아크릴 슬라이드는 피라냐 용액으로 처리되지 않으며 아세톤, 메탄올 및 KOH는 커버 슬립 청소에 사용되는 농도의 50 % (v / v) 농도로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TIRF 현미경 설정. 도립 현미경에 적용된 일반적인 대물렌즈 유형 TIRF 현미경 설정은 필수 광학 장치가 강조 표시된 상태로 표시됩니다. M1–M5는 레이저 빔을 조종하는 거울입니다. 렌즈 L1 및 L2는 레이저 빔을 확장하는 데 사용되며 L3 렌즈는 레이저 빔을 대물 렌즈의 후면 초점면에 집중시킵니다. I1 및 I2는 레이저 빔을 정렬하는 데 사용되는 조리개 다이어프램입니다. 셔터는 레이저 빔 조명을 제어하는 데 사용되며, 형광 분자의 불필요한 광퇴색을 방지하는 데 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 멤브레인 결합 역학 흐름 설정. 결합 실험을 수행하기 위해 얇은 PTFE 튜브 (0.022 in ID x 0.042in OD)를 사용하여 주사기 펌프 (스케일이 아닌 이미지)를 사용하여 샘플을 흐르게합니다. 튜브의 끝은 마이크로 피펫 팁의 도움으로 이미징 챔버 배출구에 연결됩니다. 폐기는 배출구에 연결된 작은 마이크로팁 저장소에 수집되며, 도입된 부피는 항상 이미징 챔버 부피의 10배 이상입니다. 이미징 챔버의 단면을 보여주는 삽입 그림. (크기를 조정하지 않는 이미지) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 입자 궤적 및 광퇴색 영화의 분석을 위한 파이프라인. (A) 획득한 동영상을 MATLAB에서 u-트랙을 사용하여 분석하여 궤적을 (x, y)로 구하고 각 입자의 강도(i)를 프레임별로 구했습니다. 그런 다음 이러한 궤적을 사용하여 순간 제곱 변위(ISD), ISD1 및 ISD2를 계산했습니다. 그런 다음 ISD를 히스토그램으로 표시하여 이동 종을 식별할 수 있습니다. 또는 평균 제곱 변위(MSD) 플롯은 모션이 가우스인지, 제한된 것인지 또는 초확산33,34인지 알려줍니다. 히든 마르코프 모델35(HMM) 분석은 단일 입자의 상이한 확산 상태를 구별하기 위해 사용될 수 있다. (B) 광퇴색 분석을 위해 먼저 시스템의 드리프트에 대해 동영상을 보정한 다음(필요한 경우) u-트랙을 사용하여 입자 감지 또는 추적했습니다. 강도 분포(23)(및 다른 입자 특징)를 추정하는 것 외에도, 강도 궤적은 스텝-검출 알고리즘(36,37,38)을 사용하여 광퇴색 단계의 수에 대해 분석될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5몰% DOPE-PEG2000으로 지지된 지질막에 대한 ClyA의 결합. 일반적인 결합 곡선은 u-트랙으로 식별된 각 프레임의 입자 수를 계산한 후에 얻어집니다. 영상화는 막 결합 ClyA 단백질의 유동 전에 개시된다. 입자 수 (청록색 원)에 맞는 지수 붕괴 함수 (검은 색 선)는 ClyA를 막에 결합하기위한 시간 상수를 복구하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PEG-지질 이중층 막에서 친유성 DNA의 이동성. (A) POPC / DOPE-PEG2000 멤브레인의 친 유성 DNA 추적자에 대한 개략도가 표시됩니다. (B) 상이한 PEG-SLB에 대한 단일 입자 추적으로부터 계산된 평균 제곱 변위가 도시된다. 2 mol% DOPE-PEG2000에서, DNA 추적자는 중합체의 부재 하에서 방해된 이동성과 비교하여 순수한 브라운 거동을 나타낸다(점선은 참고를 위해 포함됨). 다른 한편으로, 동일한 DNA 추적자는 순수한 브라운 확산에서 벗어나 20 mol % DOPE-PEG2000의 존재 하에서 감소 된 이동성을 갖는 아 확산 운동을 나타냅니다. (C) 2개의 상이한 PEG2000 지질 막에서 친유성 DNA 추적자의 확산을 위한 ISD2 분포는 베어 SLB와 비교된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 광표백 흔적과 지질 이중층 막에서의 ClyA 조립. (A,B) 대표적인 시간 추적은 단계 6.2.1에서 검출된 ClyA 나노포어 복합체의 광퇴색 단계를 보여줍니다. 각각 7 단계 및 5 단계로 조립 된 ClyA 복합체의 경우. (c) 37°C에서 60분 동안 64.7% POPC:27.8% 콜레스테롤:7.5% DOPE-PEG2000 멤브레인 상에서 배양된 ClyA(25 nM)에 대한 광표백 단계 분포(회색)가 도시되어 있다. 불완전한 라벨링 효율을 보정한 후, 다양한 올리고머 종(마젠타)의 추정된 질량 분율이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 멤브레인에 ClyA의 결합. 5 mol% DOPE-PEG2000을 함유하는 SLB 멤브레인에 결합하는 Cy3-표지된 ClyA 단백질 모니터링. 결합 된 입자는 u- 트랙에 의해 검출되고 (청록색 원) 트랙은 궤적의 5 개 후속 위치에 대해 플롯됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 2몰% PEG 막에 DNA 추적자의 확산. 2 mol% PEG2000 막에서 토코페롤을 통해 지질막에 고정된 Cy3 표지된 DNA에 대한 영화. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: 광표백 동영상. 7.5 mol% DOPE-PEG2000을 함유하는 멤브레인 상에 Cy3-표지된 ClyA 분자의 조립된 올리고머의 필름. 더 큰 복합체는 단일 단백질에 비해 몇 배 더 높은 강도뿐만 아니라 연속 조명 하에서 시간이 지남에 따라 입자 강도가 관찰되는 여러 광퇴색 단계에서 분명합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 6단계에서 u-트랙과 다양한 MATLAB 코드를 사용하는 방법에 대한 정보입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 아크릴 슬라이드에 구멍을 뚫고 전체 슬라이드의 테이프를 자르기 위한 대표적인 CAD(컴퓨터 지원 설계) 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 코딩 파일 2: 6단계에서 이미지 및 데이터 분석에 필요한 관련 MATLAB 코드가 포함된 압축 폴더입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 3: 단계 6의 이미지 및 데이터 분석을 위한 샘플 데이터. MATLAB 코드는 https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis 에서도 구할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 막에 내장된 생체 분자에 대해 혼잡한 환경을 나타내는 지지된 지질 이중층(SLB)에 대한 단일 분자 실험을 시연합니다. 혼잡 한 환경은 배제 된 부피 효과를 생성하여 생체 분자 반응 1,2,39,40의 향상으로 이어집니다. 폴리머가 주로 이중층 외부의 부피를 차지하는 PEG- 지질 시스템의 경우,이 효과는 특히 큰 엑토 도메인을 갖는 분자 종에서 두드러진다. 따라서, 친 유성 염료에 비해, 수용체, 당 단백질 및 당지질과 같은 막에 내장 된 큰 친수성 분자의 확산이 현저히 감소 될 수있다. 토코페롤을 통해 막에 고정된 형광 추적자 DNA를 사용하여(그림 5), 우리는 이러한 군집 효과를 식별할 수 있습니다.
별도로, 하부 전단지에 PEG의 존재는 또한 SLB를 들어 올리고 생체 분자와 지지 기판(14, 41)의 상호작용을 감소시킨다. 일반적으로 이미징 유리 표면의 음전하를 띤 표면은 이동성과 분자 반응을 자주 방해합니다. 따라서, PEG 지질을 사용하여 막이 유리로부터 떨어져 나가는 것은 군집을 목적으로 하지 않는 경우에도 유리하다. 그러나 이러한 경우 분자 밀집을 나타내지 않는 농도 체계를 식별하는 데주의를 기울여야합니다. 이중층 외부로 더 큰 도메인을 확장하는 단백질의 경우, PEG5000과 같은 고 분자량 PEG- 지질의 사용이 필요할 수 있습니다(42).
SLB 시스템의 단일 분자 이미징에 중요한 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 슬라이드와 커버슬립의 엄격한 청소는 단일 분자 실험에서 매우 중요합니다(1단계). 불순물이 있는 표면을 이미징하면 지질막에 결함이 발생합니다. 이로 인해 멤브레인 표면에 형광 표지 된 생체 분자 패치가 생길 수 있습니다. 형성된 SLB의 적용 범위와 균일성은 이중층을 지질 염료(DiI 또는 Lissamine Rhodamine DOPE)로 도핑하고 형광 현미경으로 이미징하여 별도의 준비로 확인할 수 있습니다. FRAP 분석은 확산 거동을 벤치마킹하는 데에도 사용할 수 있습니다43,44.
멤브레인 결합 실험(4단계)의 경우, 튜브를 사용한 흐름 설정은 기포가 챔버로 들어가는 것을 방지하기 위해 버퍼로 프라이밍되어야 합니다. 더 높은 유속 또는 기포의 존재는 멤브레인을 파열시키고 분자는 커버 슬립에 직접 결합합니다. 이미지 획득은 일부 분자가 튜브에서 확산되어 멤브레인에 결합할 때 흐름이 시작되기 전에 시작되어야 합니다. 이미징 중에 이중층에 대물렌즈를 집중시키는 것은 금 나노입자, 양자점 또는 형광 비드로 이중층을 저농도로 도핑함으로써 촉진될 수 있습니다.
단일 입자 추적 실험의 경우 입자 궤적의 과도한 겹침으로 인해 추적이 어려운 시나리오를 피하기 위해 멤브레인의 입자 수를 제어해야 합니다. 이미징 중에 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 레이저 출력입니다. 높은 레이저 출력은 형광단을 빠르게 포토 블리칭하는 반면, 낮은 강도와 그에 상응하는 느린 이미지 획득 속도는 흐림을 유발합니다. 최적의 레이저 출력은 상당한 궤적 길이(평균 최소 >5)를 생성하면서 대칭적이고 회절 제한 입자 이미지에 가깝게 유지해야 합니다. 산소 소거 시스템은 또한 형광단(45)의 광퇴색을 연장시키는데 사용될 수 있다. 여기에 제시된 광퇴색 분석의 한계는 핵 기공 복합체 (47)와 같은 큰 분자 어셈블리 (~ 20 서브 유닛 이상)의 경우37,46이 발생합니다. 이러한 경우 베이지안 기반 접근 방식을 사용하여 하위 단위 모집단48,49,50을 추론할 수 있습니다.
대부분의 경우 형광단을 가진 생체 분자의 표지는 완전하지 않습니다51. 이것은 레이블이 지정되지 않은 종이있는 클러스터에서 하위 단위를 계산하는 데 어려움을 겪습니다. 서브 파 라벨링 효율에 대한 이항 보정은 일반적으로 분자 종의 화학 양 론이 고정 될 때 합리적인 근사치입니다. 많은 경우, 올리고머 종은 올리고머화 공정에서와 같이 이질적이거나 동적으로 변할 수 있으며, 광표백 데이터에서 기본 분포를 추출하기 위한 새로운 도구의 개발이 필요합니다.
전반적으로 이 프로토콜은 단일 분자 결합을 사용, 수행 및 분석하고 막 생체 분자에 대한 광퇴색 분석을 추적 및 수행하기 위한 조건에 대한 권장 사항과 함께 PEG-SLB를 생성하기 위한 파이프라인을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 ClyA 단백질에 대한 발현 플라스미드를 공유한 Benjamin Schuler 교수를 인정합니다. 이 작업은 휴먼 프론티어 과학 프로그램(RGP0047-2020)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 - 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
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