Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Abstract

Cellulaire membranen zijn zeer drukke omgevingen voor biomoleculaire reacties en signalering. Toch gebruiken de meeste in vitro experimenten die de eiwitinteractie met lipiden onderzoeken naakte dubbellaagse membranen. Dergelijke systemen missen de complexiteit van verdringing door membraan-ingebedde eiwitten en glycanen en sluiten de bijbehorende volume-effecten uit die worden aangetroffen op cellulaire membraanoppervlakken. Ook voorkomt het negatief geladen glasoppervlak waarop de lipide bilayers worden gevormd de vrije diffusie van transmembraanbiomoleculen. Hier presenteren we een goed gekarakteriseerd polymeer-lipidemembraan als een nabootsing voor drukke lipidemembranen. Dit protocol maakt gebruik van polyethyleenglycol (PEG) -geconjugeerde lipiden als een gegeneraliseerde benadering voor het opnemen van crowders in de ondersteunde lipide bilayer (SLB). Eerst wordt een reinigingsprocedure van de microscopische dia's en coverslips gepresenteerd voor het uitvoeren van experimenten met één molecuul. Vervolgens worden methoden besproken voor het karakteriseren van de PEG-SLBs en het uitvoeren van experimenten met één molecuul van de binding, diffusie en assemblage van biomoleculen met behulp van single-molecule tracking en fotobleaching. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de nanoporiënassemblage van bacterieel porievormend toxine Cytolysine A (ClyA) op overvolle lipidemembranen kan worden gevolgd met fotobleachingsanalyse met één molecuul. MATLAB-codes met voorbeeldgegevenssets zijn ook opgenomen om enkele van de gemeenschappelijke analyses uit te voeren, zoals het volgen van deeltjes, het extraheren van diffusief gedrag en het tellen van subeenheden.

Introduction

Celmembranen zijn zeer drukke en complexe systemen1. Moleculaire verdringing kan een aanzienlijke impact hebben op de diffusie van membraangebonden entiteiten zoals eiwitten en lipiden 2,3,4. Evenzo worden bimoleculaire reacties op lipidembranen zoals receptordimerisatie of de oligomerisatie van membraancomplexen beïnvloed door verdringing 5,6,7. De aard, configuratie en concentratie van crowders kunnen de membraanbinding, diffusiviteit en eiwit-eiwitinteractie op verschillende manieren regelen 8,9. Omdat het beheersen van membraanverdringing op cellulaire membranen en het interpreteren van de invloed ervan op ingebedde biomoleculen een uitdaging is, hebben onderzoekers geprobeerd alternatieve in vitro systemen op te zetten10.

Een populaire benadering voor kunstmatige overvolle membranen is het dopen van de dubbellaagse membranen met polymeer (zoals polyethyleenglycol, PEG)-getransplanteerde lipiden11,12. Tijdens de visualisatie van eiwit- en lipidedynamiek op ondersteunde lipide bilayers (SLB's), beschermen deze polymeren bovendien de in het membraan ingebedde componenten van het onderliggende negatief geladen substraat (zoals glas) door de bilayer effectief weg te tillen van de onderliggende ondersteuning. Door de grootte en concentratie van het polymeer te variëren, kan men de mate van moleculaire verdringing regelen, evenals de scheiding van de onderliggende vaste steun13,14. Dit is duidelijk een voordeel ten opzichte van lipide bilayers ondersteund op vaste substraten zonder polymeerkussens 15,16, waar transmembraanbiomoleculen hun activiteit kunnen verliezen 17,18,19. Wat nog belangrijker is, het stelt ons in staat om de drukke omgeving van het celmembraan in vitro samen te vatten, wat van cruciaal belang is voor veel membraanprocessen.

Oppervlakte-geënte polymeren op membranen ondergaan ook veranderingen in hun configuratie, afhankelijk van hun entdichtheid12. Bij lage concentraties blijven ze in een entropisch opgerolde configuratie, bekend als een paddenstoel, boven het membraanoppervlak. Met toenemende concentratie beginnen ze te interageren en hebben ze de neiging om zich los te maken en uit te breiden, wat uiteindelijk een dichte borstelachtige formatie op het membraan oplevert21. Omdat de overgang van de paddenstoel naar het borstelregime zeer heterogeen is en zich manifesteert in slecht gekarakteriseerde omstandigheden van het polymeer, is het belangrijk om goed gekarakteriseerde omstandigheden te gebruiken voor verdringing op polymeergeënte membranen. Vergeleken met een recente studie20, identificeren en rapporteren we drukke membraansamenstellingen die het diffusieve transport en de activiteit van transmembraanbiomoleculen handhaven.

In dit protocol bespreken we hoe we PEGylated lipidemembranen kunnen genereren en geven we aanbevelingen voor PEG-dichtheden die verdringing nabootsen in twee verschillende regimes van polymeerconfiguratie (namelijk paddenstoel en borstel). Het protocol beschrijft ook single-molecule binding, particle tracking en photobleaching data-acquisitie en -analyse voor moleculen ingebed in deze overvolle membranen. Eerst beschrijven we de grondige reinigingsstappen, de assemblage van de beeldkamer en de generatie PEG-SB's. Ten tweede geven we details voor de single-molecule binding, deeltjes tracking en fotobleaching experimenten. Ten derde bespreken we i) het extraheren van de relatieve bindingsaffiniteiten, ii) het karakteriseren van moleculaire diffusie en iii) het tellen van subeenheden in een eiwitassemblage uit films van afzonderlijke moleculen op het membraan.

Hoewel we dit systeem hebben gekarakteriseerd met beeldvorming met één molecuul, is het protocol nuttig voor alle membraanbiofysici die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van het effect van drukte op biomoleculaire reacties op lipidembranen. Over het algemeen presenteren we een robuuste pijplijn voor het maken van drukke en ondersteunde lipide bilayers, samen met verschillende single-molecule assays die op hen zijn uitgevoerd en de bijbehorende analyseroutines.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reiniging van de dia en coverslip voor experimenten met één molecuul

  1. Maak vóór de montage van de beeldkamer zowel de coverslips als de dia's schoon en bereid ze voor. Boor meerdere paar gaten op de glasglijbanen met behulp van een boormachine met diamantgecoate boren (0,5-1 mm in diameter). Als acrylplaten worden gebruikt, gebruik dan een lasersnijder om precieze gaten (0,5 mm) te maken, zoals weergegeven in figuur 1.
    OPMERKING: Elk paar gaten zal fungeren als een in- en uitlaat voor stroomuitwisseling voor een individuele microfluïdische kamer. Een representatief CAD-bestand voor gaten in een acrylplaat is beschikbaar in Aanvullend coderingsbestand 1. Gaten geboord op glazen platen zijn meestal 1,5x-2x groter dan de boorgrootte.
  2. Reinig de dia's en coverslips met afwasmiddel. Spoel ze grondig af met gedeïoniseerd water. Plaats de dia's en coverslips in een aparte pot met water (Slide Staining) (Coplin) en soniceer gedurende 30 minuten in een bad sonicator. Gebruik voor alle ultrasoonapparaatstappen een vermogensinstelling van 70 W.
  3. Verwijder het water en vul de Coplin-pot met de glazen dia's en coverslips met aceton tot de rand (50-100 ml afhankelijk van het potvolume). Gebruik in het geval van acrylplaten hetzelfde volume voorgemengde 50% (v / v) acetonoplossing, anders worden de dia's ijzig. Schud de Coplin-pot om ervoor te zorgen dat alle dia's en coverslips volledig in de oplossing zijn ondergedompeld en soniceer gedurende 30 minuten in een badsonicator.
  4. Verwijder de aceton en gooi het weg in een afvalcontainer, giet methanol in de Coplin-potten (50%, v / v voor acrylglaasjes) en soniceer gedurende 30 minuten. Zowel aceton als methanol worden gebruikt om organische deeltjes op de dia's te verwijderen.
  5. Spoel de dia's en coverslips af met overvloedige hoeveelheden type 1 water en plaats ze in een glazen Coplin-pot. Giet 1 M KOH-oplossing in de pot en soniceer gedurende 1 uur. Gebruik voor de acrylplaten 0,5 M KOH.
  6. Gooi de KOH weg in een anorganische afvalcontainer. Spoel de pot af met veel water en plaats de Coplin potten in een zuurkast voor piranha behandeling. Voer geen piranha-behandeling uit voor acrylglaasjes; ga direct verder met stap 1.9.
    LET OP: Piranha-behandeling moet worden uitgevoerd in een zuurkast met de juiste handschoenen, een veiligheidsbril en een schort voor het hanteren van zuren. Piranha-oplossing is een sterk oxidatiemiddel en verwijdert alle overgebleven organische deeltjes van de dia's en coverslips.
  7. Giet voor het bereiden van de piranha-oplossing voorzichtig een 2/3 volume zwavelzuur (98%, v/v) in een glazen bekerglas en vul de rest met waterstofperoxide (30%, v/v). Meng de oplossing voorzichtig met een glazen staaf, giet deze in de Coplin-pot en laat de Coplin-pot minstens 1 uur in de zuurkast staan.
  8. Decanteer de piranha-oplossing uit de Coplin-pot in een weggooicontainer voor zuur afval dat in de zuurkast wordt bewaard. Spoel de Coplin pot af met een overvloedige hoeveelheid type 1 water.
  9. Droog de dia's en deklagen in een zachte stroom stikstofgas en plaats ze in een schone Coplin-pot. De gedroogde dia's en coverslips zijn nu klaar voor plasmabehandeling. Neem een paar dia's en coverslips en plaats ze in de plasmamachine.
  10. Creëer een vacuüm in de kamer. Draai de knop naar de radiofrequentie van 8-12 MHz voor het genereren van plasma in de kamer. Een paarse gloed in de kamer geeft de vorming van een plasma in de kamer aan.
  11. Voer de plasmabehandeling uit gedurende 8-10 minuten. Laat het vacuüm voorzichtig los na het uitschakelen van het plasma en ga verder met stap 2 voor het assembleren van de microfluïdische beeldvormingskamer.

2. Montage van de microfluïdische kamer

OPMERKING: De beeldkamer wordt gemaakt door dubbelzijdige tape tussen een vooraf gereinigde coverslip en schuif van de vorige stap te plaatsen, zoals hieronder beschreven.

  1. Monteer de dia's en coverslip na de plasmabehandeling zoals weergegeven in figuur 1. Plaats de glasschuif op een schoon vloeipapier. Snijd de dubbelzijdige tape in ~2-3 mm brede stroken en plaats ze aan elke kant van een paar gaten op de glazen glijbaan. Gebruik een pipetpunt om de tape af te vlakken, anders veroorzaakt deze lekkage van het ene kanaal naar het andere.
    OPMERKING: U kunt de tape ook voor de hele dia knippen met behulp van een laser of geautomatiseerde plottersnijder (figuur 1).
  2. Plaats de met plasma behandelde coverslip op de afgeplakte schuif om de kamer te sluiten. Gebruik een pipetpunt om de coverslip voorzichtig op de getapete gebieden te drukken om het kanaal waterdicht te maken.
  3. Als u glasglijbanen gebruikt, sluit u de randen af met epoxyhars. Ten slotte heeft elke beeldkamer gemaakt van een dia en coverslip een afmeting van 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (lengte x breedte x diepte). Bewaar de voorbereide microfluïdische beeldvormingskamers gedurende 1-2 weken in uitgedroogde omstandigheden (bij voorkeur tussen 10-25 °C).
    OPMERKING: Voor de lasergesneden tapes die worden gebruikt met acrylplaten, is het niet nodig om epoxy te gebruiken, omdat de taperanden een strakke lekvrije afdichting vormen.

3. Het maken van ondersteunde dubbellagen op glassubstraat door blaasjesfusie

OPMERKING: Overvolle ondersteunde lipide bilayers worden gegenereerd op de wanden van de beeldvormingskamer door de fusie van lipide blaasjes bereid met gedopeerde PEG-lipiden.

  1. Neem een schone glazen injectieflacon, bij voorkeur voorgezuiverd met piranha-oplossing. Voeg chloroformoplossing van 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[amino(polyethyleenglycol)-2000] (DOPE-PEG2000) toe aan de gewenste molfractie van PEG2000-lipiden, zodat de uiteindelijke concentratie na toevoeging van buffer 3 mM lipiden in stap 3.4 zal zijn. Bereid andere membraansamenstellingen van lipiden op dezelfde manier voor.
  2. Droog de chloroform uit de injectieflacon met behulp van een zachte stroom stikstof met een kleine werveling, zodat de gedroogde lipiden gelijkmatig op het oppervlak van de injectieflacon worden gecoat. Plaats de injectieflacon gedurende 1 uur in een vacuümdesiccator. Dit verwijdert eventuele resterende chloroform in de glazen injectieflacon. Voeg 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en incubeer een nacht bij 37 °C.
  3. Bereid kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) zoals hieronder beschreven.
    1. Vortex voorzichtig gedurende 1-2 minuten na nachtelijke incubatie totdat de oplossing troebel en melkachtig wordt.
    2. Neem 100 μL van deze oplossing in een kleine centrifugebuis van 500 μL en soniceer gedurende ongeveer 1 uur in een badsonicator (ingesteld op een vermogensinstelling van 70 W). De oplossing zal duidelijk worden; zo niet, soniceer dan nog eens 30 minuten. Deze stap genereert SUV's met een diameter van 50-100 nm.
      OPMERKING: Als u zich voor de eerste keer voorbereidt, karakteriseert u de SUV's met behulp van dynamic light scattering 22,23 (DLS) of een gelijkwaardige methode.
  4. Voeg calciumchloride (CaCl2, 3 M bouillon) toe aan de gesonificeerde blaasjes, zodat de uiteindelijke concentratie 30 mM in de lipideoplossing is.
  5. Snijd een micropipettetip voor het injecteren van de monsteroplossing, zodat deze goed in het gat past. Meng de lipideoplossing en injecteer door een van de gaten in de beeldkamer die in stap 2 zijn gemaakt. Veeg de overtollige oplossing die uit de kamer uit de uitlaat komt met een schone tissue om de vervuiling van aangrenzende kanalen te voorkomen.
  6. Laat deze assemblage gedurende 90 minuten in een bevochtigde kamer staan. Bereid een bevochtigingskamer voor door een nat weefsel aan het einde van een centrifugebuis van 50 ml te plaatsen. Plaats de schuif zijwaarts in de buis met gesloten buisdoppen. De blaasjes zullen fuseren en een uniforme dubbellaag op het glasoppervlak genereren.
  7. Was de kamer grondig met een overvloedige hoeveelheid PBS-buffer (ongeveer 5 keer het volume van de beeldkamer). Voorkom het binnendringen van luchtbellen in de kamer tijdens het wassen, omdat dit defecten in het membraan kan veroorzaken.

4. Microscoopopstelling en beeldvormingsmetingen met één deeltjes

OPMERKING: Experimenten met één molecuul worden uitgevoerd op een objectieve totale interne reflectiefluorescentie 24,25,26 (TIRF) microscoopopopstelling (figuur 2). TIRF-beeldvorming biedt een betere signaal-ruisverhouding voor beeldvorming met één molecuul, hoewel epifluorescentiemicroscopen ook onder bepaalde omstandigheden kunnen worden gebruikt (vooral wanneer de fluorescerende biomoleculen uit de bulkoplossing kunnen worden verwijderd door te wassen). Het prisma-type TIRF kan worden gebruikt, maar het objectieve type heeft de voorkeur voor het gemak van het opzetten van microfluïdica27. Voor objectief-type TIRF wordt een hoog numeriek diafragmaobjectief (100x vergroting, meestal in de handel verkrijgbaar als TIRF-objectief) aanbevolen.

  1. Voordat u een experiment op het gebied van mobiliteit en assemblage uitvoert, moet u de TIRF-microscoop uitlijnen om een optimale signaal-ruisverhouding te garanderen als gevolg van verlichting door het evanescente veld. Houd tijdens de uitlijning het laservermogen laag, tussen 100 μW en 1 mW.
    LET OP: Laserveiligheidsbrillen moeten worden gebruikt tijdens het uitlijnen van de laserstraal.
    1. Om de microscoop uit te lijnen, bereidt u een fluorescerend kraalmonster door ze in het microfluïdische kanaal toe te voegen bij lage concentraties (bij ~ 100 pM), zodat fluorescerende vlekken van enkele kralen elkaar niet overlappen in de afbeeldingen.
    2. Visualiseer eerst de kralen in de epifluorescentiemodus. Terwijl de verlichting in epifluorescentiemodus is, verplaatst u de M5-spiegelvertalingsfase (de spiegel die de laser naar de dichroïsche reflecteert) zodanig dat de straal die uit het objectief komt, buigt totdat deze zich uiteindelijk in een totale interne reflectieconfiguratie bevindt.
    3. Controleer of de TIR-verlichting is bereikt. Wanneer het TIR-evanescentveld het kraalmonster verlicht, controleer dan of alleen de kralen op het oppervlak zichtbaar zijn en of vrij zwevende kralen weg van het oppervlak niet worden waargenomen.
  2. Stel aan het begin van het experiment het laservermogen op het objectief achterste brandpuntsvlak in op 5-10 mW om fotovernietiging (fotobleaching) van de fluoroforen te voorkomen.
  3. Houd de dia op het microscoopstadium en focus eerst op het kale membraan (zonder fluoroforen). Meestal zijn kleine sporen van onzuiverheden in lipidembranen voldoende om dit te doen. Optioneel: Neem tijdens stap 3.1 een klein aantal fluorescerende kralen of quantum dots (sub picomolair bereik) op, zodat er slechts twee tot vijf fluorescerende deeltjes in het gezichtsveld aanwezig zijn om het identificeren van de juiste focus te vergemakkelijken.
  4. Injecteer het monster (membraaneiwitten, enz.) met behulp van een micropipette in de PEG-SLB-gecoate beeldkamer gemaakt in stap 3.7.
  5. Voor het meten van de bindingskinetiek met één molecuul gebruikt u een spuitpomp om de gelabelde biomoleculen door de inlaatgaten naar de microfluïdische kamer te laten stromen (figuur 3). Gebruik een debiet van 50-500 μL/min.
    1. Start de filmacquisitie voordat u de oplossing aan de beeldkamer toevoegt. Verkrijg >5.000 frames met een framesnelheid van 25-50 frames/s onder continue stroom totdat er geen verdere toename is in het verschijnen van nieuwe vlekken op het membraanoppervlak (video 1). Voor de analyse van bindingskinetiek volgt u de stappen uit 6.1.
  6. Voor het volgen van enkele deeltjes voegt u de gelabelde biomoleculen in lage concentraties (vergeleken met de bindingsconstante) toe aan het kanaal met behulp van een micropipette. Optimaliseer de concentratie tot een dichtheid van <0,1 deeltjes/μm2 , zodat individuele deeltjes elkaar zelden kruisen (video 2). Dit zorgt voor de hoge betrouwbaarheid van tracks die uit de datasets worden hersteld. Incubeer indien nodig (in geval van slechte membraanbinding door biomoleculen, ~ 10 min) in een bevochtigingsomgeving en was de kamer met de buffer.
    OPMERKING: Wassen is nodig als de binding slecht is op het membraan en de meeste fluorescerende moleculen in de oplossing blijven. Anders kan dit de beeldvorming verstoren en resulteren in een slechte signaal-ruisverhouding.
  7. Voor trajectanalyse met één deeltjes verwerft u 200-500 frames met 10-100 frames / s. Houd de objectieflens scherp op het dubbellaagse vlak met minimale podiumdrift tijdens het acquisitie-interval.

5. Beeldacquisitie voor het tellen van subeenheden in een eiwitassemblage

OPMERKING: Beeldacquisitie voor het schatten van stoichiometrie vereist continu bleken van fluoroforen en het detecteren van het aantal stappen totdat er geen fluoroforen meer fluorescentie uitzenden.

  1. Voeg voor het meten van subeenheden de relevante concentratie van gelabelde biomoleculen toe (voorbeeld: zie resultaten; ClyA werd toegevoegd met een concentratie van 25 nM) aan de microfluïdische beeldvormingskamer en incubeerde (indien nodig wassen). Incubeer de glijbaan in een bevochtigingskamer op de gewenste temperatuur gedurende de vereiste hoeveelheid tijd (bijvoorbeeld: 37 °C en 60 minuten voor de assemblage van ClyA).
  2. Voer beeldacquisitie uit voor fotobleaching met één molecuul zoals hieronder beschreven.
    1. Was de beeldkamer met een buffer voordat u gaat beeldvormen (indien nodig). Plaats de dia op de microscoop en pas de focus aan om de gelabelde moleculen te visualiseren.
    2. Stel het laservermogen in op een niveau waarop het bleken van de fluorofoor geleidelijk optreedt (~ 1-5 min). Idealiter, voor elk geassembleerd biomolecuul, houd de fotobleachingstapsnelheid >10-20 beeldvormende frames uit elkaar. Verkrijg de beelden totdat alle moleculen volledig fotobleached zijn (video 3).
      OPMERKING: Om de totale duur van het vereiste fotobleachingstraject te bepalen, plott u de gemiddelde intensiteit van individuele vlekken met het aantal beeldframes en bepaalt u de tijdconstante door een exponentiële vervalfunctie aan te passen. De totale duur van de overname kan worden ingesteld op 5-10 keer de tijdconstante.
  3. Voer een tijdsafhankelijke assemblagemeting uit door filmacquisitie te starten zodra het monster in de kamer wordt geïntroduceerd en nieuwe fotobleachingfilms te verkrijgen met vaste tijdsintervallen na membraanbinding van verschillende segmenten van de PEG-SLB.

6. Beeld- en data-analyse

  1. Voer binding en tracking van één deeltje uit zoals hieronder beschreven.
    1. Extraheer trajecten met één deeltje uit de hierboven verkregen films, zoals weergegeven in figuur 4. Voor het detecteren van afzonderlijke deeltjes en het volgen ervan, gebruikt u het MATLAB-pakket, u-track28, of de Trackmate29, een plug-in in ImageJ, die ook een robuust algoritme voor het volgen van enkele deeltjes biedt. Volg de stappen voor het instellen van u-track analyse zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1.
      OPMERKING: De kritische parameters voor het volgen van enkele deeltjes zijn de standaarddeviatie van de deeltjesgrootte (in pixels) en de lengte van de openingsluiting. Gebruik respectievelijk 1 en 0 voor deze parameters als de strengste criteria voor tracking.
    2. Om de bindingssnelheidsconstanten te berekenen, moet u eerst het aantal deeltjes schatten dat zich in de loop van de tijd aan het membraanoppervlak bindt. Gebruik het MATLAB-bestand binding_SPT (Supplementary Coding File 2) met de u-track uitvoermap om het aantal deeltjes dat op het membraan verschijnt te identificeren en te plotten, verkregen uit stap 6.1. Pas de waargenomen kinetiek aan de juiste kinetische modellen aan (bijvoorbeeld: enkele exponentiële fit om de tijdconstante te bepalen, waarvan de inverse kan worden toegewezen aan de schijnbare snelheidsconstante)30 om de snelheidsconstanten te extraheren (zie resultaten, figuur 5).
    3. De mean-squared displacement (MSD) van de diffuserende deeltjes (zoals DNA-tracer in PEG-SLBs, figuur 6) geeft de aard van diffusie aan. Gebruik het MATLAB-pakket MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) met de u-track uitvoermap om de MSD-plot te verkrijgen als functie van de vertragingstijd (figuur 6B).
    4. Om heterogene diffuserende soorten te identificeren, berekent u de isd-verdelingen (instantane squared displacement) zoals weergegeven in figuur 6C. ISD2, gedefinieerd als (Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ− Yt)2, waarbij vertragingstijd, τ = 2, de voorkeur heeft omdat het geluid vermindert. Filter korte trajecten uit met minder dan drie frames om ruis te verminderen.
    5. Gebruik ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) in MATLAB met de u-track output om de ISD's van de gevolgde deeltjes te plotten (figuur 6C).
  2. Voer fotobleachinganalyses met één molecuul uit zoals hieronder beschreven.
    1. Om de stoichiometrie van de membraancomplexen te schatten, voert u een fotobleachinganalyse uit op de tijdsafhankelijke intensiteiten van de fluorescerende complexen (video 3). Pas hiervoor een driftcorrectiealgoritme (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) toe op basis van de autocorrelatie van filmframes om de vertaaldrift te extraheren. Dit veronderstelt dat de geassembleerde structuren grotendeels immobiel zijn tijdens beeldacquisitie. Voer het MATLAB-pakket uit Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) om tijdsporen van deeltjesintensiteit uit de films te detecteren.
    2. Gebruik de MATLAB-code Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) om de stapdetectie voor de intensiteitstijdsporen uit te voeren. Als de deeltjes niet onbeweeglijk zijn, gebruik dan het u-track pakket om de locatie van bewegende deeltjes te extraheren. Deze set xy-coördinaten kan worden toegewezen aan de onbewerkte films om de intensiteitswaarden van het bewegende deeltje te extraheren terwijl het zijdelings op het membraan diffundeert. Gebruik het MATLAB-pakket utrack_Int (Supplementary Coding File 2) met de uitvoer van u-track analyse voor deze optie.
    3. Voer een correctie uit voor onvolledige etikettering van de biomoleculen met fluorofoortags om de juiste eiwitcomplexstoichiometrie te schatten. Bepaal de etiketteringsefficiëntie met een UV-VIS-spectrofotometer door de absorptie van kleurstof en eiwit te meten om de concentratie te schatten. Bereken de etiketteringsefficiëntie als de molaire verhouding van de kleurstof tot het eiwit.
      OPMERKING: Sommige kleurstoffen absorberen ook bij golflengten in de buurt van 280 nm, en daarom moet deze absorptiebijdrage van de kleurstof worden meegenomen bij de berekening van de concentratie.
    4. Voer een binomiale correctie uit om rekening te houden met de onvolledige etiketteringsefficiëntie van de fluorofoor op de volgende manier door de MATLAB-code Step_correction (Supplementary Coding File 2) te gebruiken met de gegevens die zijn verkregen uit staptelling in stap 6.2.2. Bijvoorbeeld, voor een porievormend toxine zoals Cytolysine A, dat een dodecamerische ringachtige structuur vormt, past u een binomiale correctie toe met behulp van de volgende formule:
      nkEquation 1
      waarbij Equation 2 = etiketteringsefficiëntie, n = aantal fotobleachingstappen en s = werkelijke tellingen. Gebruik de MATLAB-routine Stepcount_immobile om de gecorrigeerde oligomere soorten te herstellen. De frequentie van oligomeren (si) omzetten in massafracties (figuur 7C; Aanvullend coderingsbestand 2).
      OPMERKING: Een set van u-track geanalyseerde bestanden zijn opgenomen in Aanvullende codering Bestand 3. De MATLAB-codes in Supplementary Coding File 2 kunnen met deze datasets worden uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monitoring van de binding van ClyA-eiwit op PEGylated membranen
Na stap 4.5 wordt de bindingskinetiek geschat door het aantal deeltjes dat in de loop van de tijd aan het membraanoppervlak bindt uit te zetten (video 1). Naarmate ClyA-eiwit zich bindt aan een membraan met 5 mol% PEG2000-lipiden, neemt de deeltjesdichtheid toe en bereikt verzadiging (figuur 5). Een exponentieel verval dat past bij de gebonden deeltjes (cyaancirkels) geeft de tijdconstante (τb) voor de membraanbinding (met name de initiële tijdspunten [rode cirkels] zijn in dit geval niet geschikt).

Mobiliteit van DNA-tracer op overvolle membranen
We gebruiken vaak DNA-tracers (DNA verankerd aan het membraan met een tocoferol), lipofiele tracerkleurstoffen (bijv. DiI) of membraaneiwitten (bijv. ClyA) om het membraan te karakteriseren onder PEG-gemedieerde crowding. Laterale diffusie van gelabelde tracermoleculen (25-100 pM) kan worden gevolgd door het membraan bij deeltjesbinding in beeld te brengen. Bij afwezigheid van een PEG-polymeer in het membraan vertonen de meeste tracers (vooral die zich buiten de dubbellaags uitstrekken) beperkte diffusie op SWB's (figuur 6A). Met kleine niveaus van PEG2000 in het membraan (0,5-2 mol%), lift de bilayer weg van het onderliggende oppervlak en kunnen de tracermoleculen zonder beperkingen diffunderen. Aan de andere kant wordt extreme opsluiting waargenomen bij een hoge concentratie PEG (20 mol%), waarbij PEG-moleculen zich in een dicht borstelregime bevinden, met een verscheidenheid aan gedragingen ertussenin. Msd-plots voor deze drie aandoeningen zijn weergegeven in figuur 6B. Op basis van onze karakterisering van POPC/DOPE-PEG2000 dubbellaagse membranen, raden we een 1-3 mol% DOPE-PEG2000 fractie aan die verdringing in het paddenstoelregime induceert. Boven 7,5 mol% PEG2000-lipide observeren we het begin van het borstelregime en samenstellingen tot 25 mol% PEG2000-lipide kunnen worden gebruikt om drukte en opsluiting te induceren. De tussenliggende 4-7% PEG2000-lipide condities die overeenkomen met de overgang tussen de twee regimes zijn slecht gekarakteriseerd en moeten worden vermeden.

Assemblage van ClyA op overvolle membranen
De intensiteitstrajecten van individuele diffractie-beperkte vlekken van ClyA-eiwit na incubatie op het overvolle membraan (figuur 7A, B) tonen een groot aantal verschillende fotobleachingstappen, wat de vorming van verschillende assemblage-tussenproducten suggereert31. ClyA, een transmembraaneiwit, interageert met het negatief geladen glasoppervlak in afwezigheid van PEG en zal zeer slecht assembleren. Bij 7,5 mol% PEG2000 lipiden werden de geassembleerde complexen gemeten en uitgezet in figuur 7C. Na correctie voor de etiketteringsefficiëntie (0,9 in dit geval) toont de uiteindelijke verdeling van oligomeren de dodecamerische ClyA-soort als de dominante structuur, in overeenstemming met structurele gegevens32.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch voor de reinigingsstappen en microfluïdische kamerassemblage. (A) De glasglaasjes en de coverslips worden gereinigd met sequentiële ultrasoonapparaat in wasmiddel, aceton, methanol, KOH en piranha-oplossing, met meerdere spoelingen door type 1 ultrapuur water tussen elke stap. De dia's en coverslips worden vervolgens gedroogd met stikstofgas voor plasmabehandeling. (B) De microfluïdische beeldvormingskamer wordt vervolgens geassembleerd met behulp van een voorgesneden dubbelzijdig plakband dat de dia aan de coverslip bindt. * Acrylglaasjes worden niet behandeld met piranha-oplossing en de aceton, methanol en KOH worden gebruikt in een concentratie van 50% (v / v) van die welke wordt gebruikt voor het reinigen van coverslip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: TIRF microscoop opstelling. Een typische tirf-microscoopopopstelling van het objectieve type, aangepast aan een omgekeerde microscoop, wordt getoond met essentiële optica gemarkeerd. M1-M5 zijn spiegels om de laserstraal te sturen. Lenzen L1 en L2 worden gebruikt om de laserstraal uit te breiden en de L3-lens richt de laserstraal op het achterste brandpuntsvlak van de objectieflens. I1 en I2 zijn de Iris-diafragma's die worden gebruikt om de laserstraal uit te lijnen. Een sluiter wordt gebruikt om de laserstraalverlichting te regelen, cruciaal voor het voorkomen van onnodige fotobleaching van de fluorescentiemoleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Membraanbinding kinetica flow setup. Voor het uitvoeren van het bindingsexperiment wordt een dunne PTFE-buis (0,022 in ID x 0,042 in OD) gebruikt om het monster te laten stromen met behulp van een spuitpomp (afbeelding niet op schaal). Het uiteinde van de buis is verbonden met de uitgang van de beeldkamer met behulp van een micropipettepunt. De afdanking wordt verzameld in een klein microtipreservoir dat op het stopcontact is aangesloten en het geïntroduceerde volume is altijd groter dan 10 keer het volume van de beeldkamer. Inzetfiguur met dwarsdoorsnede van de beeldkamer. (afbeelding niet op schaal) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Pijplijn voor analyse van trajecten met één deeltjes en fotobleachingfilms. (A) De verworven films werden geanalyseerd met behulp van u-track in MATLAB om de trajecten als (x, y) en de intensiteiten (i) van elk deeltje, frame voor frame, te verkrijgen. Deze trajecten werden vervolgens gebruikt om momentane vierkante verplaatsing (ISD), ISD1 en ISD2 te berekenen. De ISD's kunnen vervolgens worden uitgezet als histogrammen om mobiele soorten te identificeren. Als alternatief geven de gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) plots aan of de beweging Gaussisch, beperkt of superdiffusiefis 33,34. Verborgen Markov Model35 (HMM) analyse kan worden gebruikt om verschillende diffusieve toestanden van een enkel deeltje te onderscheiden. (B) Voor de analyse van de fotobleaching werden de films eerst gecorrigeerd voor drift in het systeem (indien nodig), gevolgd door deeltjesdetectie of tracking met behulp van u-track. Afgezien van het schatten van de intensiteitsverdeling23 (en andere deeltjeskenmerken), kunnen de intensiteitstrajecten worden geanalyseerd voor het aantal fotobleachingstappen met behulp van stapzoekalgoritmen 36,37,38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Binding van ClyA aan ondersteunde lipidembranen met 5 mol% DOPE-PEG2000. Een typische bindingscurve wordt verkregen na het tellen van het aantal deeltjes in elk frame geïdentificeerd door u-track. Beeldvorming wordt gestart vóór de stroom van het membraanbindende ClyA-eiwit. Een exponentiële vervalfunctie (zwarte lijn) passend bij deeltjesaantallen (cyaancirkels) wordt gebruikt om de tijdconstante voor de binding van ClyA aan het membraan te herstellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Mobiliteit van lipofiel DNA op PEG-lipide dubbellaagse membranen. (A) Schematisch voor de lipofiele DNA-tracer in het POPC/DOPE-PEG2000-membraan wordt getoond. (B) Gemiddelde kwadraatverplaatsingen berekend op basis van de single-particle tracking voor verschillende PEG-SLB's worden weergegeven. In 2 mol% DOPE-PEG2000 vertoont DNA-tracer zuiver Browniaans gedrag in vergelijking met belemmerde mobiliteit in afwezigheid van het polymeer (stippellijn is opgenomen ter referentie). Aan de andere kant wijkt dezelfde DNA-tracer af van pure Brownse diffusie, wat duidt op subdiffusieve beweging met verminderde mobiliteit in de aanwezigheid van 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) De ISD2-verdeling voor de diffusie van lipofiele DNA-tracer in twee verschillende PEG2000-lipidemembranen wordt vergeleken met kale SRB's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Fotobleachingssporen en de assemblage van ClyA op lipide dubbellaagse membranen. (A,B) Representatieve tijdsporen tonen fotobleachingstappen van ClyA nanoporiëncomplex gedetecteerd in stap 6.2.1. voor een geassembleerd ClyA-complex met respectievelijk 7 en 5 stappen. (C) De fotobleaching stapverdeling (grijs) voor ClyA (25 nM) geïncubeerd op 64,7% POPC: 27,8% Cholesterol: 7,5% DOPE-PEG2000 membraan gedurende 60 minuten bij 37 °C wordt getoond. Na correctie voor de onvolledige etiketteringsefficiëntie wordt de geschatte massafractie van verschillende oligomere soorten (magenta) weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Binding van ClyA op het membraan. Monitoring van Cy3-gelabeld ClyA-eiwit dat bindt aan het SLB-membraan dat 5 mol% DOPE-PEG2000 bevat. De gebonden deeltjes worden gedetecteerd (cyaancirkels) door u-track en sporen worden uitgezet voor vijf opeenvolgende posities in hun traject. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Diffusie van DNA-tracer op het 2 mol% PEG-membraan. Een film voor Cy3-gelabeld DNA verankerd aan het lipidemembraan via tocoferol in het 2 mol% PEG2000-membraan. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Fotobleaching film. Een film van geassembleerde oligomeren van Cy3-gelabelde ClyA-moleculen op het membraan met 7,5 mol% DOPE-PEG2000. Grotere complexen zijn duidelijk uit de vele malen hogere intensiteiten in vergelijking met een enkel eiwit, evenals uit de meerdere fotobleachingstappen wanneer de deeltjesintensiteit in de loop van de tijd wordt waargenomen onder continue verlichting. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Informatie over het gebruik van u-track en verschillende MATLAB-codes in stap 6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: Een representatief CAD-bestand (computer-aided design) voor het maken van gaten in de acrylplaat en snijtape voor de hele dia. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende coderingsbestanden 2: Gecomprimeerde map met bijbehorende MATLAB-codes die nodig zijn voor afbeeldings- en gegevensanalyse in stap 6. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende coderingsbestanden 3: Voorbeeldgegevens voor afbeeldings- en gegevensanalyse in stap 6. De MATLAB-codes zijn ook verkrijgbaar bij https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier demonstreren we experimenten met één molecuul op ondersteunde lipide bilayers (SLB's) die een drukke omgeving manifesteren voor membraan-ingebedde biomoleculen. De drukke omgeving genereert een uitgesloten volume-effect, wat leidt tot de versterking van biomoleculaire reacties 1,2,39,40. Voor het PEG-lipidensysteem, waarbij het polymeer voornamelijk het volume buiten de dubbellaag inneemt, is dit effect vooral uitgesproken voor moleculaire soorten met grote ecto-domeinen. Daarom kan, in vergelijking met lipofiele kleurstoffen, de diffusie van een groot hydrofiel molecuul ingebed in het membraan, zoals receptoren, glycoproteïnen en glycolipiden, aanzienlijk worden verminderd. Met behulp van fluorescerend tracer-DNA verankerd aan het membraan via tocoferol (figuur 5), kunnen we dergelijke verdringingseffecten identificeren.

Afzonderlijk tilt de aanwezigheid van PEG in de onderste folder ook de SLB op en vermindert de interactie van de biomoleculen met het steunsubstraat14,41. Meestal belemmert het negatief geladen oppervlak van het beeldvormende glasoppervlak vaak de mobiliteit en moleculaire reacties. Daarom is het gebruik van PEG-lipiden om het membraan van het glas weg te tillen voordelig, zelfs als het niet voor drukte is. Er moet echter voor worden gezorgd dat de concentratieregimes worden geïdentificeerd die in die gevallen geen moleculaire verdringing vertonen. Voor eiwitten die grotere domeinen buiten de bilayer uitbreiden, kan het gebruik van een PEG-lipide met een hoger molecuulgewicht zoals PEG5000 nodig zijn42.

Een paar belangrijke punten zijn van cruciaal belang voor de beeldvorming van één molecuul op SLB-systemen. Rigoureuze reiniging van de dia's en coverslips is van cruciaal belang in experimenten met één molecuul (stap 1). Het in beeld brengen van een oppervlak met onzuiverheden zal resulteren in defecten in het lipidemembraan. Dit kan resulteren in vlekken van fluorescerend gelabelde biomoleculen op het membraanoppervlak. De dekking en uniformiteit van SLB-gevormde kan in een afzonderlijk preparaat worden geverifieerd door de dubbellaag te dopen met een lipidekleurstof (DiI of Lissamine Rhodamine DOPE) en deze in beeld te brengen onder een fluorescentiemicroscoop. FRAP-analyse kan worden gebruikt om het diffusieve gedrag te benchmarken, evenals 43,44.

Voor membraanbindingsexperimenten (stap 4) moet de stroomopstelling met de buis worden geprimed met buffer om te voorkomen dat luchtbellen in de kamer terechtkomen. Hogere stroomsnelheden of de aanwezigheid van luchtbellen zullen het membraan scheuren en de moleculen zullen zich rechtstreeks aan de coverslip binden. Beeldacquisitie moet beginnen voordat de stroom begint, omdat sommige moleculen uit de buis diffunderen en aan het membraan binden. Het richten van het doel op de bilayer tijdens beeldvorming kan worden vergemakkelijkt door de bilayer in een lage concentratie te dopen met gouden nanodeeltjes, quantum dots of fluorescerende kralen.

Voor de experimenten met het volgen van enkele deeltjes moet het aantal deeltjes op het membraan worden gecontroleerd om een scenario te voorkomen waarin het volgen een uitdaging is vanwege overmatige overlap van de deeltjestrajecten. Een andere belangrijke factor om rekening mee te houden tijdens de beeldvorming is het laservermogen. Een hoog laservermogen zal de fluoroforen snel fotograferen, terwijl een lage intensiteit en de bijbehorende langzame beeldacquisitiesnelheden vervaging zullen veroorzaken. Optimaal laservermogen moet een aanzienlijke trajectlengte opleveren (gemiddeld ten minste >5) met behoud van symmetrische en dicht bij diffractie beperkte beelden van deeltjes. Een zuurstofopruimingssysteem kan ook worden gebruikt om de fotobleaching van fluoroforen te verlengen45. Een beperking van de hier gepresenteerde fotobleachinganalyse doet zich voor37,46 in het geval van grote moleculaire assemblages (~ groter dan 20 subeenheden), zoals het nucleaire poriecomplex47. In dergelijke gevallen kan een bayesiaanse benadering worden gebruikt om de subeenheidpopulatie48,49,50 af te leiden.

De etikettering van biomoleculen met fluoroforen is in de meeste gevallen niet volledig51. Dit vormt een uitdaging bij het tellen van subeenheden in een cluster met niet-gelabelde soorten. Een binomiale correctie voor de ondermaatse etiketteringsefficiëntie is meestal een redelijke benadering wanneer de stoichiometrie van de moleculaire soort is vastgesteld. In veel gevallen kunnen oligomere soorten heterogeen of dynamisch veranderen, zoals in een oligomerisatieproces, waarvoor nieuwe hulpmiddelen nodig zijn voor het extraheren van de onderliggende distributies uit fotobleachinggegevens.

Over het algemeen biedt dit protocol een pijplijn voor het genereren van PEG-SLBs, met aanbevelingen voor de voorwaarden om single-molecule binding te gebruiken, uit te voeren en te analyseren, en het volgen en uitvoeren van fotobleachinganalyse voor membraanbiomoleculen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen prof. Benjamin Schuler voor het delen van de uitdrukking plasmide voor ClyA-eiwit. Dit werk werd ondersteund door human frontier science program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Biochemie nummer 185
Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter