Обнаружение целей на основе аптамеров, чему способствует 3-ступенчатая G-квадруплексная изотермическая реакция экспоненциального усиления

Summary

Настоящий протокол демонстрирует использование быстрого 3-ступенчатого анализа экспоненциального усиления на основе аптамеров для обнаружения целей. Подготовка образцов, усиление сигнала и проявление цвета рассматриваются для реализации этой системы для распознавания присутствия теофиллина по сравнению с присутствием кофеина.

Abstract

Аптамеры представляют собой молекулы распознавания мишеней, которые связываются с высоким сродством и специфичностью. Эти характеристики могут быть использованы для управления другими молекулами, способными генерировать сигналы. Для системы, описанной в настоящем описании, распознавание мишени через аптамерный домен, Stem II модифицированного рибозима молоткоголового типа, активирует саморасщепляющийся рибозим путем стабилизации первоначально неструктурированной конструкции. Цис-расщепляющая РНК действует на стыке Stem III и Stem I, создавая два продукта расщепления. Более длинное произведение расщепления запускает изотермическую реакцию экспоненциального усиления (EXPAR) двух подобных каталитически активных G-квадруплексов. Эти результирующие продукты амплификации катализируют восстановление пероксидазы, которое связано с восстановлением колориметрического субстрата с выходом, который может быть обнаружен невооруженным глазом. Система, состоящая из 3 частей, описанная в настоящем исследовании, улучшает методы обнаружения, такие как иммуноферментные анализы (ИФА), производя визуально обнаруживаемый сигнал, указывающий на присутствие всего 0,5 мкМ теофиллина всего за 15 минут.

Introduction

Аптамеры обычно представляют собой одноцепочечную ДНК или РНК, отобранную в ходе эволюционного процесса с высоким сродством и специфичностью связывания с желаемыми мишенями¹. В дополнение к связывающей способности, аптамеры могут быть связаны и управлять мотивами с функциями сигнала-вывода^2,3, усиливая указанный сигнал и улучшая чувствительность системы. Система G-квадруплексной изотермической реакции экспоненциального усиления (GQ-EXPAR) представляет собой трехчастную систему (рис. 1), которая развивает визуальный сигнал при добавлении последовательных компонентов в один реакционный сосуд для получения визуального выхода⁴. Эта система позволяет обнаруживать конкретную мишень, в данном случае теофиллин, в данном образце в течение 15 минут, используя оптимизированный рабочий процесс, чтобы обеспечить быстрое и специфическое обнаружение интересующей цели. Этот метод следует рассматривать для образцов, где конкретное количественное определение целевой концентрации является меньшей проблемой, чем высокая специфичность ответа за короткий промежуток времени.

Аллостерический рибопереключатель, молекула РНК (рибозим), которая подвергается саморасщеплению, производит начальный сигнал. Эта конструкция основана на рибозиме-молотке с аптамерным доменом, введенным в Stem II в качестве регулятора активности расщепления. Его функция саморасщепления активируется, когда его аптамерный домен стабилизируется при связывании с мишенью⁵. В противном случае коммутатор неактивен в исходном состоянии.

Последующая реакция экспоненциальной амплификации (EXPAR) использует высвобождение саморасщепляющейся цепи РНК с первой стадии для запуска изотермической реакции амплификации⁶. Продукт амплификации EXPAR обладает пероксидазной активностью⁷, выступая в качестве основы для последней стадии системы. Когда некоторые субстраты окисляются в сочетании с распадом перекиси, они производят флуоресцентный выход, который можно измерить на различных приборах. Другие распространенные субстраты могут быть заменены для получения цветного продукта для визуального обнаружения. EXPAR и пероксидазная активность его продуктов амплификации действуют как 2-ступенчатый усилитель сигнала, повышая чувствительность к более высоким уровням по сравнению с традиционными стратегиями ^7,8.

Обнаружение теофиллина по сравнению с кофеином используется в качестве примера специфичности этой платформы обнаружения, поскольку они различаются только одной метильной группой (рис. 2). Эта демонстрация системы дает колориметрический выход для визуального обнаружения теофиллина не менее 500 нМ.

Protocol

См. Дополнительную таблицу 1 (таблица настройки реакции) для подготовки пробирки, включая конкретные объемы и концентрации компонентов реакции. В демонстрируемом здесь протоколе используется предварительно собранный комплект платформы обнаружения, как описано в таблице материалов. Все компоненты должны храниться на льду, если не указано иное.

1. Приготовление рибозима

ПРИМЕЧАНИЕ: Основным компонентом обнаружения является аллостерический (регулируемый аптамером) рибозим, распознающий теофиллин (см. Дополнительную таблицу 2).

1. Соберите 5 ЕД Т4-полинуклеотидкиназы (0,5 мкл, см. Таблицу материалов) в ПЦР-пробирку, которая будет использоваться для активации продуктов расщепления рибозима.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот компонент добавляется первым, чтобы пользователь мог видеть правильное дозирование фермента.
2. Добавьте 1 мкл предварительно подготовленного 5-кратного рибозимного буфера (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца (пробирку для ПЦР).
3. В целях визуальной демонстрации специфичности добавьте 1,5 мкл 2 мМ теофиллина (мишень) или 2 мМ кофеина (контроль) (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца в качестве испытуемых образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для построения стандартной кривой рекомендуется начинать с 3,125 мМ аналита и тестировать пятикратные разведения до 0,001 мМ.
4. Тщательно перемешайте каждую пробирку с образцом, пипетируя 5-10 раз.
5. Добавьте 2 мкл 600 нМ РНК, содержащей аптамерный домен, специфичный для мишени (см. Таблицу материалов), в каждую пробирку с образцом, чтобы получить конечную концентрацию 240 нМ в 5 мкл тестового раствора, затем быстро перемешайте пипеткой и поместите на холодный блок, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: важно изначально подготовить все реакции без рибозима, так как реакция саморасщепления начнется сразу же, когда рибозим соединится с рибозимным буфером, и может привести к значительному фону.
6. После того, как все реакционные пробирки подготовлены, инкубируйте каждый образец (5 мкл) при комнатной температуре (23 ° C) в течение ровно 3 минут с помощью таймера. Немедленно верните пробирки с образцами в лед (4 °C) после инкубации.

2. GQ-EXPAR

1. Добавьте 3,5 мкл смеси фермента никаза-полимеразы (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемые концентрации ферментов зависят от последовательностей распознавания, типов ферментов и температур реакции, комбинация которых была определена эмпирически.
2. Добавьте 31,5 мкл реакционной смеси EXPAR, содержащей матрицу, нуклеотиды и реакционный буфер (см. Таблицу материалов), в каждую пробирку для образца и пипетку для смешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации компонентов оптимизируются на основе ферментов и последовательностей полимеразных продуктов.
3. После того, как все образцы подготовлены, инкубируйте каждый подготовленный образец (40 мкл) при 55 ° C в течение ровно 5 минут с помощью таймера. Если есть возможность, инкубируйте на термоциклере, хотя нагретая крышка не нужна.
4. Немедленно верните пробирки с образцом в лед (4 °C) после этапа инкубации.

3. Проявка цвета

1. Добавьте 2 мкл раствора гемина (25 мкМ, см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
2. Добавьте 58 мкл коммерчески доступного раствора ТМБ (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте.
3. Инкубируют реакцию развития цвета (100 мкл) при комнатной температуре в течение не менее 3 мин и до 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Развитие цвета можно остановить, добавив 20 мкл 2 М серной кислоты.
4. Качественно считайте образцы на глаз или количественно оцените результаты с помощью считывателя абсорбционных пластин на длине волны 450 нм, если реакции развития цвета остановлены с помощью серной кислоты.

Representative Results

Платформа обнаружения, изображенная на рисунке 1 , преобразует распознавание аптамерных мишеней в визуально отчетливые различия между препаратами образца (мишенью и немишенью, рис. 2) за короткий промежуток времени. Аллостерический рибозим, идентифицированный Soukup et ^al.5 , послужил отправной точкой для создания менее шумной последовательности с реакцией на мишень по контрольным и отрицательным образцам. Оптимизированная конструкция была способна распознавать всего лишь 500 нМ теофиллина за 30 минут (рис. 3) - препараты образцов, подвергшиеся воздействию мишени, дают синий цвет на этапе 3, в то время как образцы, не содержащие мишени, остаются бесцветными. При необходимости эти результаты могут быть количественно оценены путем сначала остановки реакции развития цвета, как описано на шаге 3.4, а затем считывания поглощения полученного продукта при 450 нм для измерения начальной концентрации присутствующей мишени. Типичные результаты этого процесса представлены в таблице 1, которая может быть подогнана к нелинейной регрессии для количественной оценки концентрации мишени, присутствующей в исходном образце (рис. 4).

Рисунок 1: Система GQ-EXPAR. Механизмы системы обнаружения и усиления сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Аптамерная мишень и контрмишень. Молекулярная структура теофиллина (мишень) и кофеина (контрцелевой контроль) как демонстрация специфичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Визуальные результаты GQ-EXPAR. Репрезентативные результаты системы для определения различных концентраций теофиллина через 3 мин и 30 мин развития цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативная стандартная кривая теофиллина. Стандартная кривая системного сигнала, измеренная на А450 после 30 мин проявления цвета. Исходные данные представлены в таблице 1, N = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

[Теофиллин] (мМ)	Испытание 1 (A450)	Испытание 2 (A450)	Испытание 3 (A450)	Средний (А450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Нет рибозима	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Таблица 1: Репрезентативные необработанные данные стандартной кривой теофиллина. Результаты работы системы для определения различных концентраций теофиллина после 30 мин развития цвета. Также оценивались образцы норрибозима, N = 3.

Дополнительная таблица 1: Настройка GQ-EXPAR. Сводные данные об объемах реагента GQ-EXPAR и порядке добавления, как описано в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Олигонуклеотидные последовательности GQ-EXPAR. Последовательности молекул ДНК и РНК, используемые в реакциях обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Представленный здесь способ использует преимущества перехода между первоначально неупорядоченной вторичной структурой в аллостерическом рибозиме и дополнительной стабильностью, обеспечиваемой связыванием мишени с аптамерным доменом для активации цис-расщепляющего молоткоголового рибозима. Стабильность рибозима была скорректирована, чтобы свести к минимуму каталитическую активность в отсутствие мишени, позволяя связыванию мишени восстанавливать активную структуру. Кроме того, необходимо позаботиться о том, чтобы сбалансировать буферы нескольких ферментов, необходимых для облегчения EXPAR и развития цвета. Наконец, учитывая, что это 3-ступенчатая система, сочетание времени инкубации и температуры наряду с концентрациями компонентов реакции означало, что максимизация сигнала при минимизации шума была непростой задачей.

Во время приготовления рибозима (стадия 1) связывание мишени с аптамерным доменом стабилизирует структуру саморасщепляющегося рибозима. Несмотря на это, рибозим будет способен расщепляться после введения в рибозимный буфер даже при отсутствии мишени. Таким образом, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал, жизненно важно держать реакции на льду до тех пор, пока они не будут готовы к определенной инкубации. Успешное связывание мишени с аптамерным доменом и результирующее событие расщепления приводят к образованию двух продуктов расщепления, как показано на рисунке 1, стадия 1: короткий сегмент ствола I и вновь обнаженный сегмент ствола III с концевым циклическим фосфатом⁸. Полинуклеотидкиназа Т4, присутствующая в смеси образцов, удаляет циклический фосфат из продукта расщепления Stem III, который действует как праймер для реакции амплификации на стадии 2. Концентрации и объемы реагентов, используемых в этой системе, были оптимизированы на основе экспериментов по оценке фонового сигнала по сравнению с удельным откликом⁴ , и их необходимо будет оптимизировать, начиная с любых точечных изменений. Кроме того, теофиллин 3,125 мМ рекомендуется в качестве самой высокой концентрации для построения стандартной кривой, поскольку развитие цвета, полученное в результате этого образца, близко к максимальному возможному поглощению при 450 нм (рис. 4). Нелинейная регрессия по обыкновенным наименьшим квадратам используется для определения стандартной кривой для этой подготовки системы GQ-EXPAR.

GQ-EXPAR, проведенный на шаге 2, использует две матрицы ДНК: одну, которая праймируется продуктом расщепления Stem III и производит G-квадруплекс, и другую, которая праймируется G-квадруплексом и производит G-квадруплекс. Первая реакция более важна, чем вторая, так как перевод продукта расщепления Stem III в G-квадруплексы необходим для получения колориметрического выхода, в то время как самоусиление G-квадруплекса увеличивает сигнал, который уже присутствует. ДНК-полимераза Bst 2.0 осуществляет изотермическую амплификацию и обладает активностью смещения цепи, в то время как Nt. BstNBI никаза расщепляется перед последовательностью G-квадруплекса, позволяя Bst 2.0 вытеснять ранее сгенерированный продукт и производить больше ампликона G-квадруплекса. Буфер также поставляет K⁺, что позволяет продукту усиления складываться в активную форму G-квадруплекса. Разные никазы имеют разные последовательности распознавания для связывания и разрезания, а специфические ферменты будут иметь разную эффективность резки; Изменение последовательности в месте распознавания/зазубрины потребует изменения Nickase и повторной оптимизации шага 2.

На этапе 3 G-квадруплексы могут функционировать как ДНК-ферменты с пероксидазной активностью, особенно когда они связаны с гемином⁷. Восстановление перекиси сочетается с окислением подложки, такой как TMB, для получения обнаруживаемого сигнала для визуализации или количественной оценки.

Ключевым ограничением в этой системе является шум, который может генерировать аллостерический рибозим. Хотя активная, саморасщепляющаяся структура нестабильна в отсутствие мишени (в данном случае теофиллина), РНК имеет возможность отбирать различные конфигурации и может непреднамеренно получить доступ к активной конфигурации⁴. Это, в сочетании с усилением сигнала, обнаруженного на стадиях 2 и 3, может генерировать ложноположительный сигнал. Таким образом, жизненно важно максимально снизить активность системы за счет оптимизации количества РНК, буфера и ферментов, а также минимизации времени инкубации и температур, чтобы ограничить производство событий расщепления РНК, которые не опосредованы мишенью.

Несмотря на сложность оптимизации рабочего процесса GQ-EXPAR, система может быть достаточно универсальной после создания. Различные аллостерические рибозимы, управляемые аптамером, уже идентифицированы⁹ и могут быть оптимизированы для желаемой функциональности⁵. Также был достигнут прогресс в разработке аллостерических ДНК-ферментов, модулированных аптамерами¹⁰, расширяя химические составы, которые могут быть интегрированы в эту платформу. Эти варианты изменения системы распознавания целей не были оценены и будут в центре внимания будущих исследований. Кроме того, ключевые компоненты системы могут быть заменены эквивалентными материалами с различными требованиями к активности, такими как более низкие температуры инкубации для полимеразы или различные последовательности распознавания для никазы. Гибкость и модульность этой системы позволяют ей адаптироваться к широкому диапазону входов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.