Summary
本文提出了一种新型培养基质的制造方案，每mm2具有数百个微容器，其中可以使用高分辨率显微镜培养和观察类器官。还详细介绍了细胞接种和免疫染色方案。
Abstract
目前，不同分辨率尺度的大量三维（3D）器官型培养物（类器官）的表征受到标准成像方法的限制。该协议描述了一种制备微加工类器官培养芯片的方法，该方法可在用户友好的仪器上实现多尺度，3D实时成像，需要最少的操作，并且能够达到300个类器官/ h的成像通量。这些培养芯片与空气物镜和浸没物镜（空气、水、油和硅）以及各种常见显微镜（例如转盘、点扫描仪共聚焦、广视场和明场）兼容。此外，它们可以与光片模式一起使用，例如单物镜、单平面照明显微镜（SPIM）技术（soSPIM）。
此处描述的方案给出了制备微加工培养芯片以及类器官培养和染色的详细步骤。只需要很短的时间就可以熟悉，消耗品和设备可以在正常的生物实验室中轻松找到。在这里，3D成像功能将仅使用商业标准显微镜（例如，用于3D重建的转盘和用于常规监测的宽视场显微镜）进行演示。
Introduction
在器官型3D细胞培养物（以下简称类器官）中，干细胞分化并自组织成与真实器官具有强烈形态和功能相似性的空间结构。类器官为研究人类生物学和体外发育提供了有价值的模型1，2，3。越来越多的模型正在开发中，这些模型可以模仿肝脏，大脑，肾脏，肺和许多其他器官2，4，5。类器官的分化是通过在精确的时间序列中添加可溶性生长因子和细胞外基质来指导的。然而，与器官形成鲜明对比的是，类器官的发育是相当异质的。
除了众多生物学挑战6，7之外，类器官培养在细胞培养方法、转录组学表征和成像方面也带来了技术挑战。体内器官发育发生在生物环境中，导致细胞排列的高度刻板的自组织。任何表型改变都可以用作诊断患病状态的代理。相比之下，类器官在与细胞培养条件兼容的最小受控微环境中体外发育，导致每个个体类器官的发育路径和形状形成存在很大差异。
最近的一项研究8表明，类器官形状（表型描述符）的定量成像与一些遗传标记的评估相结合，可以定义表型发育景观。可以说，将类器官中基因组表达的多样性与其表型行为联系起来的能力是释放器官型培养物全部潜力的重要一步。因此，它乞求开发专用的高内涵成像方法，允许在3D9，10中表征亚细胞，多细胞和全类器官尺度的类器官特征。
我们开发了一种多功能高内涵筛选（HCS）平台，允许简化类器官培养（从分离的人胚胎干细胞[hESCs]，人诱导多能干细胞[hIPSC]或原代细胞到3D，多细胞，分化的类器官）和快速，非侵入性的3D成像。它集成了下一代微型化3D细胞培养设备，称为JeWells芯片（以下简称 芯片 ），其中包含数千个排列良好的微孔，两侧是45°镜，可通过单物镜光片显微镜进行快速，3D，高分辨率成像11。该系统与任何标准的商用倒置显微镜兼容，可在 <1 小时内以亚细胞分辨率对 300 个类器官进行 3D 成像。
细胞培养装置的微细加工从现有的微结构模具开始，该模具包含数百个微金字塔（图1A），其方形底座和相对于底座45°的侧壁。 图1C 显示了这种结构的电子显微镜（EM）图像。模具本身由聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）制成，可以使用标准的软光刻程序制成具有相应特征（作为型腔）的主模具（此处未显示）的复制铸件。主模具可以通过不同的程序生产。用于该协议的协议是使用硅湿法蚀刻制成的，如Galland等人所报道的那样。11;主模具的制造程序对于该协议并不重要。金字塔排列成方形阵列，X 和 Y 方向的间距相同（在这种情况下，间距为 350 μm）。
作为例证，发表了概念验证实验12 ，以证明该芯片允许长期培养（数月）和分化方案，同时精确定义孔中初始细胞的数量。使用标准明场和3D光片荧光显微镜可以自动实时监测大量类器官的个体发育。此外，可以检索类器官以进行进一步的生物学研究（例如，转录组学分析）。本文概述了细胞培养盖玻片制造的详细方案、荧光显微镜的接种和染色程序以及类器官的检索。
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Protocol
注意：本协议的第一部分详细介绍了细胞培养装置的微细加工。带有金字塔形空腔的原始主模具可以在内部生产 - 如果有微加工设施 - 或外包给外部公司。这项工作中使用的主要模具是内部生产的，制造工艺步骤在其他地方描述11，13。模具微细加工的基本协议可在 补充文件1中找到。关键：步骤 1 到 6 中的操作需要在无尘环境中进行。层流罩或洁净室（如果有）是首选。通过所有这些步骤，需要使用个人防护装备（PPE），例如手套，实验室外套和安全眼镜。
1. PDMS模具的切割
- 将PDMS模具的一小部分切割成最终设备所需的尺寸（例如，1 cm x 1 cm [图1B]）。平行于阵列的 XY 方向切割它们。
关键：将PDMS模具切割成1厘米x 1厘米的骰子时，分一步执行切割;使用单面剃须刀片，施加压力并一步切开PDMS。这是为了防止PDMS小颗粒的形成，这些颗粒会沉积在模具表面并影响复制步骤的质量（步骤3）。
2. 平板PDMS基板的制备
- 称取~15-20gPDMS基础树脂和1.5-2g网状剂（即比例为10：1），小心混合，并在真空罐中脱气~20分钟。
- 慢慢将脱气的PDMS倒入15厘米宽（直径）的塑料培养皿上。
- 通过将培养皿保持在65°C的烤箱中2小时来固化PDMS。等待固化完成后，即可使用~1.5mm厚的扁平PDMS膜（包含在培养皿中）（图2A）。
- 使用锋利的刀片，从PDMS中切出2厘米x 2厘米的碎片（图2B-D）。
注意：此PDMS片材的确切厚度并不重要;~1-2毫米是一个合适的范围。切割的尺寸应大于纹理模具，但不要大多少，这会导致材料浪费。
3. 生产由UV固化粘合剂制成的纹理层
- 将一个PDMS模具骰子（如步骤1中制备的那样）面朝下放在平面PDMS切割的顶部（如步骤2中制备的那样）（图3A，B）。
注意： 确保模具中的金字塔突起朝向平坦的PDMS基板，并且只有截断金字塔的顶面接触。用光学显微镜评估正确的位置（图3C，D）。 - 在模具的一侧，使用移液管滴入少量（两滴，约0.1-0.2mL）紫外光固化粘合剂（图4A）。
注意：当液体与模具边缘接触时，毛细作用将驱动液体填充模具本身与用作基板的PDMS平面切割之间的空腔。- 跟踪腔内液体的进展，例如，使用具有10倍放大镜的倒置光学显微镜（图4B，C）。
- 将紫外光固化粘合剂暴露在紫外光下以固化。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间（例如，功率密度为35 mW / cm 2的UV-LED盒;在此方案中以50%功率2分钟以完全固化粘合剂）。
- 在一个边缘使用过量的粘合剂，用手指轻轻按压将固化的粘合剂固定在平坦的PDMS基材上（图5A，B）。同时，用镊子捏住模具的一角，紧挨着被压住的同一边缘，慢慢地将其剥离，同时确保纹理薄膜也不会被抬起。
注意：图5C显示了正确脱模程序的结果;图5E-G显示了错误的过程。 - 使用剃须刀片修剪多余的粘合剂和多余的PDMS基材，使固化的，有纹理的粘合剂层平放在PDMS上，仅在一个边缘上放置多余的PDMS（图5D），这将在步骤5中需要。
4. 盖玻片基材制备
注意：作为最终设备的基材，使用直径为25毫米的标准圆形1.5H盖玻片。在使用之前，需要清洁它们以去除其表面的灰尘和/或有机残留物。
- 盖玻片清洁
- 在施加超声波（40 kHz，110 W声波功率）时，将盖玻片浸入肥皂水中5分钟。
- 用干净的去离子（DI）水清洗盖玻片，首先浸入水中，最后用水龙头中的去离子水清洗盖玻片。用N2 气体吹气枪擦干盖玻片。
- 将盖玻片浸入丙酮浴中5分钟;立即移至2-丙醇（IPA）浴中再加热5分钟。
- 使用挤压瓶用干净的 IPA 冲洗盖玻片。用N2 气体吹气枪擦干盖玻片。
注意：使用此过程清洁的盖玻片可以存放在封闭的容器中，直到需要为止。将它们放在干燥的柜子里，以避免湿气沉积在它们的表面。
- 准备使用时，用短的O 2等离子体工艺处理干净的盖玻片，以提高其亲水性：O2 20 sccm，3 mbar压力，RF发生器处60 W，持续时间60 s。
- 等离子活化后，通过将盖玻片放在标准旋涂机的真空卡盘上并在盖玻片的中心倒入一小滴粘合剂，立即对薄层UV固化粘合剂进行旋涂（图6）。运行旋涂工艺：以 500 rpm 的速度涂布 5 秒，以 3，000 rpm 的速度涂布 45 秒（加速和减速设置为 100 rpm/s）。
- 如果没有旋涂，请使用以下替代方法在盖玻片上形成一层UV粘合剂薄膜：
- 在干净的盖玻片上，使用移液管滴下~0.1 mL的紫外光固化粘合剂（图7A）。
- 取第二张盖玻片并将其放在第一张盖玻片的顶部，使液体粘合剂均匀地散布在两个盖玻片之间（图7B-D）。
- 一旦铺展粘合剂到达盖玻片的边缘，通过将一个滑过另一个来轻轻地将它们分开。分离后，两个盖玻片都完全涂有一层薄薄的液体粘合剂（图7E）。
注意： 只有当分离不是通过平稳和连续的运动完成时，涂层才可能不均匀和光滑。
- 如果没有旋涂，请使用以下替代方法在盖玻片上形成一层UV粘合剂薄膜：
- 紫外光固化胶粘剂的预固化
- 旋涂后，通过暴露于紫外线来预固化粘合剂。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间（此处，功率密度为35 mW /cm 2 的UV-LED盒在50%功率下使用1分钟）。
关键：这里使用的粘合剂是光学胶。有关其固化能量剂量的要点，请参阅讨论。
- 旋涂后，通过暴露于紫外线来预固化粘合剂。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间（此处，功率密度为35 mW /cm 2 的UV-LED盒在50%功率下使用1分钟）。
5. 将纹理薄膜转移到最终基材
- 取其中一种纹理薄膜（在步骤3中制备）并将其与涂有粘合剂的盖玻片（在步骤4中制备）接触。确保盖玻片上部分固化的粘合剂与纹理薄膜之间的接触尽可能均匀（图8A-C）。
关键：在这个阶段，盖玻片上的粘合剂应该足够牢固以避免回流，当接触时会填充纹理薄膜的金字塔形空腔，但也要具有足够的塑料和粘合剂，可以通过轻轻按压纹理薄膜来优化接触。 - 将盖玻片暴露在紫外线下，直到盖玻片上涂有的粘合剂层完全固化。这将密封盖玻片上的纹理薄膜，并在金字塔腔之间提供防漏隔离。
- 最后，剥离PDMS平面基板（图8D-F）。使用镊子将PDMS捏在修剪后留下多余材料的边缘的一角（步骤3.5）。这样，纹理薄膜层被粘附在盖玻片上，顶部有开放通道用于细胞接种。关键：剥离平坦的PDMS时，纹理薄膜应保持良好附着在盖玻片上。如果在最终暴露于紫外线后，纹理薄膜可以毫不费力地从盖玻片上剥离，则很容易确认粘合失败。
6. 细胞培养盖玻片的长期钝化
注意：钝化是通过产生仿生共聚物的保形和连续涂层来实现的，其结构类似于细胞膜中磷脂的极性基团。这种保形涂层可防止细胞粘附在细胞培养装置上
- 用溶解在纯乙醇中的0.5%（w / v）仿生共聚物制备溶液。将溶液储存在4°C以备将来使用。
- 将细胞培养盖玻片置于35mm培养皿中，并用仿生共聚物溶液完全覆盖。
- 5分钟后，用仿生共聚物溶液从容器中取出细胞培养盖玻片，并将其在生物安全罩中的最终培养皿内室温下干燥（>1小时）。
注意：通过增加涂料溶液中仿生共聚物的浓度，可以产生更厚的涂层;较厚涂层的结果在明场显微镜下可见（图9A）。
7. 细胞接种
- 脱气和灭菌
- 在细胞接种之前，将无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）分配到细胞培养皿中（35 mm培养皿通常为1 mL）。使用超声波设备用无菌PBS对培养皿脱气~10分钟，然后进行几轮移液以去除所有气泡。
关键：如果空气被困在锥体腔内，它将阻止细胞进入它们。为了确保在细胞接种前金字塔中没有空气被困，建议目视确保（在10倍或20倍放大倍率的台式明场显微镜下）这些腔中没有空气（图10）。 - 用无菌培养基替换PBS，并在细胞培养罩下用紫外线对板进行30分钟的灭菌。
注意：从此步骤开始，应将培养皿视为无菌并使用无菌技术进行操作。从细胞培养装置中去除滞留空气的另一种方法是使用带有真空泵的真空罐。
- 在细胞接种之前，将无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）分配到细胞培养皿中（35 mm培养皿通常为1 mL）。使用超声波设备用无菌PBS对培养皿脱气~10分钟，然后进行几轮移液以去除所有气泡。
- 细胞悬液制备
注意：细胞可以作为单个或小细胞聚集体接种，并通过顶部孔径进入样品孔。随着时间的推移，插入的细胞在样品孔内聚集并生长成大小大于孔径大小的球状体。作为经过验证的细胞系模型，使用在推荐培养基中维持的HCT116（CCL-247 ATCC）或MCF7（HTB-22 ATCC）癌细胞（ATCC指南）。- 准备细胞悬液（例如，按照ATCC指南使用胰蛋白酶消化过程）。遵循针对目标细胞的胰蛋白酶消化/细胞悬液制备建议。
- 在推荐的培养基中计数并将细胞浓度调整至0.5×106 细胞/ mL。
- 细胞分液
- 从 35 mm 细胞培养皿中取出 PBS 缓冲液，然后分配 1 mL 调整后的细胞悬液。参见 图11A ，了解具有足够细胞密度和均匀性的细胞接种过程的光学显微镜图像。
- 将细胞培养皿放回细胞培养箱（37°C，5%CO2和100%湿度）中10分钟。大约80-100个细胞将进入每个锥体腔。
注意：可以通过增加细胞浓度或去除细胞悬液之前花费的时间来增加每个细胞培养皿的细胞数量。通常，球体形成在细胞接种后需要几个小时（取决于细胞类型），可以使用明场显微镜（4倍至40倍物镜; 图 11）。从这里开始，可以根据可能持续几天、几周或几个月的典型分化方案，改变培养基、细胞外基质和分化生长因子或将其添加到含有球状体的细胞培养皿中。 - 孵育10分钟后，从培养箱中回收细胞培养皿并轻轻吸出细胞悬液以除去未捕获的细胞。将 1 mL 培养基加入 35 mm 培养皿中，然后将其放回细胞培养箱中。
关键：在这个阶段，由于球状体尚未形成，因此避免导致细胞损失的强烈抽吸或分配非常重要。强烈建议在此步骤中使用台式明场显微镜进行视觉控制。
8. 免疫染色和成像
- 固定和染色
注意：不同的经典固定和免疫染色程序与细胞培养皿完全兼容。这里描述了一个典型的协议。- 在室温下将细胞培养皿中的类器官/球状体固定在4%多聚甲醛中20分钟。
- 在轨道摇床上将类器官在无菌PBS中的1%表面活性剂溶液中透化24小时，并在封闭缓冲液（2%牛血清白蛋白[BSA]和无菌PBS中的1%表面活性剂）中孵育24小时在4°C的轨道摇床上。
- 将样品与感兴趣的一抗在抗体稀释缓冲液（无菌PBS中的2%BSA和0.2%表面活性剂）中的1/50至1/200（或根据制造商的建议）在4°C中孵育48小时。
- 在轨道摇床上用洗涤缓冲液冲洗样品 3 次（无菌 PBS 中的 3% NaCl 和 0.2% 表面活性剂），并在抗体稀释缓冲液中与相应的二抗一起孵育（稀释在 1/100 和 1/300 之间或根据制造商的建议）、0.5 μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和 0.2 μg/mL Alexa Fluor 647 或 488 鬼笔环肽在 4 °C 下在轨道摇床上孵育 24 小时， 然后用PBS进行五个冲洗步骤。或者，使用预热至37°C的水溶性清除剂安装样品。
- 成像
注意：在此阶段，微孔板中的类器官可被视为包含固定和染色样品以进行成像的正常培养皿：可以使用任何标准成像程序，无需调整或修改。 图12 显示了使用转盘共聚焦显微镜获得的图像和3D重建的代表性结果，具有40倍空气物镜（数值孔径0.75）。- 使用以下设置使用构造函数软件进行自动图像采集过程：曝光时间= 50 ms，使用Z电动载物台获取z堆栈（1μm Z步长，总高度为70μm）。
- 使用图像分析软件执行 3D 重建。
9. 类器官的释放和收集
注意：细胞培养皿的纹理粘合层可以从盖玻片上分离，以释放锥体腔内包含的活球体/类器官（固定前），以便使用其他程序分析细胞，例如RNA测序，组学方法， 体外 实验和 体内 移植。
- 将样品仍在培养皿和生物安全罩中，使用刀片（如手术刀）切割纹理粘合剂层的一角。
- 用镊子捏住切割边缘上的纹理粘合剂层，然后将其从玻璃盖玻片上轻轻剥离，但将其浸入培养基中（一些类器官可能残留在粘合剂层中， 图 13）。
- 用培养基冲洗3次，并通过移液收集类器官。
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Representative Results
图8F 显示了成功制造后细胞培养盖玻片的典型方面。紫外光固化的粘合剂层看起来很平坦，并且很好地粘附在盖玻片上。如果盖玻片上的粘合层过度固化，或者如果平坦的PDMS基材的去除不正确（如图 8G，H所示），则盖玻片上的粘合剂层的转移可能会失败。在这两种情况下，故障都是显而易见的，因为没有纹理薄膜转移到盖玻片上。
为了使微孔工作，产生的纹理膜（如协议步骤3中所述）需要使金字塔的顶部和底部都打开，以确保步骤7中接种期间的细胞可以进入空腔并在类器官开始形成后保持包含。图9显示了通过增加涂层溶液中仿生共聚物的浓度来增加涂层厚度。图10显示了对细胞培养皿进行脱气以确保金字塔腔中没有空气滞留的结果。图10A，B显示了完全脱气，而图10C，D显示了锥形空腔中的气泡。
在图11中，细胞被困在金字塔内，并在培养的第2天和第15天后形成相应的类器官。如果微孔的顶部开口改为关闭（由于步骤3不正确），则在细胞接种后冲洗样品后不会留下任何细胞。 图12显示了类器官的代表性图像以及使用具有40倍空气物镜（数值孔径0.75）的转盘共聚焦显微镜获得的3D重建。释放和收集后，类器官可以储存在一个小瓶中并用于进一步分析（例如，RNA测序）。图13B示出了如描述收集的类器官样品的示例。
图 1：聚（二甲基硅氧烷）模具。 （A）作为4英寸纹理晶圆的铸造复制品获得的起始PDMS模具（见补充文件1）。（B）1厘米×1厘米宽的起始PDMS模具切口。（C）以方形阵列排列的梯形柱的扫描电子显微镜图像，这些柱子填充模具表面。比例尺 = 1 cm （A）、100 μm 和 200 μm（分别为顶部和底部 C）。缩写：PDMS = 聚（二甲基硅氧烷）。请点击此处查看此图的大图。
图 2：平面 PDMS 基板。 （A）在标准的15厘米宽的培养皿中制备一层~1毫米厚的PDMS。（B）从新鲜的PDMS中剥离出来。（C）培养皿上剩余的PDMS可以切成更多的块以供进一步使用。（D）平面PDMS切割和PDMS模具并排;平面PDMS比模具大。缩写：PDMS = 聚（二甲基硅氧烷）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：将模具放在基板上。 （A）将模具放置在平面基板上，金字塔朝下。（B）模具与PDMS基板接触不良（顶部）和接触良好（底部）的外观不同。（三）接触不良区域的光学显微镜图像;红色圆圈突出显示了不与基板接触的柱子 - 它们看起来比同一图像中接触的柱子颜色更亮。（D）所有支柱良好接触的区域的光学图像。比例尺 = 200 μm （C，D）。缩写：PDMS = 聚（二甲基硅氧烷）。请点击此处查看此图的大图。
图 4：紫外光固化粘合剂的毛细管填充 。 （A）这一系列图像显示了（从左到右）在一条边缘上浇注少量粘合剂以及液体粘合剂在模具和基材之间的空腔中的进展。黄色箭头指向液体流动的方向。（B）液体前沿移动的光学图像序列（40倍放大）;当接触良好时，液体的前部在金字塔的边缘移动而不会泄漏。黄色箭头指向流动方向，红色箭头指向围绕接触边缘移动的液体前沿的前缘。（C）接触不良时液体前沿移动的光学图像序列（40倍）;红色箭头指向模具和基材之间渗入的液体的前缘。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：粘合剂固化后去除模具。 （A-C）剥离模具的正确程序：用镊子轻轻按压左侧边缘多余的粘合剂的同时，将模具捏住在同一边缘附近并缓慢弯曲以剥离。 （四）正确程序的结果;多余的部分在三个边缘上被修剪掉，而一小部分多余的PDMS被留在第四侧（黄色箭头）。（E-G）取出模具的错误程序示例：用镊子从相反的边缘夹住模具，导致粘合剂薄膜的平坦基材与模具一起剥落。请点击此处查看此图的大图。
图 6：玻璃盖玻片的涂层。 （A，B）良好涂布程序的示例：将玻璃盖玻片放在旋涂机的真空卡盘上，并在中心分配足够的粘合剂，使盖玻片涂层均匀。（中，四）涂层程序不良的示例：分配的粘合剂不足，导致盖玻片涂层不均匀。（E）从左到右，良好，可接受和不良涂层的示例。请点击此处查看此图的大图。
图 7：替代涂层工艺 。 （A）在盖玻片的中心放置一小滴液体粘合剂。（B）将第二张盖玻片轻轻放在第一张盖玻片的顶部。（中，四）液体在两个盖玻片之间扩散并均匀分布。（E） 正确分离盖玻片（左）或不正确分离（右）后的结果示例。 请点击此处查看此图的大图。
图8：转移到盖玻片上 。 （A）将固化和修剪的胶膜（图5D）与部分固化的粘合剂一起放置在盖玻片上。（B）纹理薄膜与盖玻片之间良好接触的示例。插图是显示梯形腔之间区域的均匀接触的光学图像（深色均匀颜色）。（C）纹理薄膜与盖玻片之间接触不良的示例。较亮的区域不接触，红色箭头指向这些区域。插图是一张光学图像，显示了良好接触（左边两个）和差接触（右边两个）的不同外观。比例尺（黄色， B，C）= 200 μm。 （D，E）去除PDMS平坦基板的正确程序：使用镊子在PDMS过量的边缘捏住PDMS并弯曲以轻轻剥离。 （F）结果用UV粘合剂纹理薄膜成功转移到盖玻片上。（G，H）不正确的剥离程序示例：使用镊子将扁平的PDMS捏在修剪掉多余材料的边缘之一;因此，薄膜与平面PDMS一起被移除。缩写：PDMS = 聚（二甲基硅氧烷）。 请点击此处查看此图的大图。
图9：用仿生共聚物涂覆 。 （A）使用0.5%（左）或（B）1%（右）（w/v）纯乙醇溶液涂覆仿生共聚物的细胞培养装置。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图10：细胞培养装置的脱气。 （A）完全脱气前的细胞培养装置。（二）完全脱气后的细胞培养装置;（C，D）细胞培养装置，仅部分脱气，气泡被困在金字塔中。比例尺 = 200 μm （A-D）。请点击此处查看此图的大图。
图11：细胞接种和类器官生长的代表性明场图像 。 （A）可见细胞漂浮在顶部。（B）细胞被困在锥体腔中的细胞冲洗掉细胞悬浮液后。如图所示，仅保留捕获的细胞。（C）细胞聚集在每个腔中形成球状体（细胞接种后第2天）。（D）在锥体腔中生长的类器官的细胞接种后第15天的图像。比例尺 = 200 μm （A B）、120 μm （C） 和 150 μm （D）。 请点击此处查看此图的大图。
图 12：类器官的 3D 成像 。 （A）在神经外胚层分化（细胞接种后第7天）使用类器官的旋转盘共聚焦（镜头40x，空气，数值孔径：0.75）获得三种不同的Z计划。使用橙笔环肽（Alexa Fluor 647）和蓝色N-钙粘蛋白免疫染色（Alexa Fluor 561）进行肌动蛋白染色。（B）使用图像分析软件对相应的类器官进行3D重建（80 Z平面图，总高度为100μm）。白色箭头：肌动蛋白表达水平高的条纹周围的细胞簇。蓝色箭头：N-钙粘蛋白表达阳性的细胞簇。 请点击此处查看此图的大图。
图13：类器官的释放。 （A）用镊子去除带纹理的粘合剂层;（B）去除后得到的类器官悬浮液的明场图像。比例尺 = 200 μm （B）。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：提出了具有金字塔形微腔的Si模具微加工的分步协议。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文描述了微孔培养皿的制备方法，该培养皿允许高密度类器官培养和分化。由于微腔的几何形状和排列，可以在单个板中长时间（数周或更长时间）培养和染色数千个球体，几乎没有材料损失。相比之下，细胞培养板上4 mm x 2 mm的区域可以包含与单个384孔板一样多的球状体，面积为12 cm x 8 cm。
微腔的规律分布和用作基质的扁平标准盖玻片能够以 3D 方式监测数千个活的或固定的类器官，而无需在培养容器和成像支架之间进行复杂且耗时的样品操作。由于金字塔形状的顶部比基部小，因此在培养基交换、细胞外基质分配或染色过程中的移液步骤不会因类器官损失。所有这些步骤都可以直接执行，就像2D细胞单层一样，没有任何额外的预防措施，这与经典的类器官生成技术（例如，悬挂液滴，低附着板，聚集体）不同。
此外，与这些现有技术相比，微孔设计用于与所有类型的浸没透镜（空气、水、油和硅）兼容的高分辨率3D成像。长期维护封闭在平板玻璃盖玻片上的类器官使细胞培养盖玻片与高分辨率光学显微镜兼容，这在现有方法中是不可能的，没有复杂的处理和苛刻的类器官转移。此外，优化的钝化程序避免了细胞/类器官的任何粘附以进行长期培养，从而控制了3D培养物的分化 最后，由于纹理粘合剂层是可去除的，因此可以检索活的类器官以进行其他类型的实验，例如组学测定或 体内 移植。
应该注意的是，用于该协议的微腔的金字塔形状和阵列排列来自主模具，该模具通过硅湿蚀制造，以提供具有镜面状表面处理和45°倾斜度以允许单物镜光片显微镜（soSPIM11）。虽然这些要求的讨论和如何生产此类模具的完整描述可以在其他地方找到12，13，但在补充文件 1 中也给出了一个简单的协议。生产主模具有不同的方法，这些方法与本协议中芯片的制造完全兼容。例如，玻璃的激光蚀刻和高分辨率3D打印可用于生产具有合适空腔的主模具，用于容纳类器官，但不适用于soSPIM成像。
这里公开的制造方案可以适用于任何标准的生物实验室，因为不需要专用的先进微细加工工具。微孔制造的一些关键步骤是通过毛细管填充纹理胶膜并将其转移到玻璃基板进行生产。但是，根据我们的经验，它们可以在短时间内以高重现性掌握。金字塔之间的距离应尽可能小，以增加类器官生长的空腔密度，但也需要足够大，以便空腔可以密封在基板上，而不会有任何泄漏或缺乏密封。我们发现，对于这种情况，50μm的距离是一个很好的折衷方案。
在细胞接种过程中，一个关键方面是去除空腔内的任何气泡，以确保细胞进入。我们在这里描述一种经过验证的解决方案，它仅使用经典的实验室设备（例如，超声波均质机或真空罐）。为了使每个细胞培养皿的细胞数量更好地匀浆，建议从培养皿的侧面分配细胞悬液，而不是直接在盖玻片上方分配。温和的手动搅拌也有助于使细胞溶液均质化。
细胞接种后，可以像任何其他经典培养支持物一样处理带有类器官的细胞培养皿;不需要特定的操作或关键步骤。与微孔设备一起使用的所有协议实际上与低附着培养皿（如U型底板）中使用的协议相同。因此，与其他标准品相比，这些微孔中的类器官培养不需要对培养条件进行任何改变。
另一个关键因素是这里使用的粘合剂是光学胶。在其建议的最佳用法中（另请参阅供应商的应用说明），将两个要粘合的光学元件对齐，并在界面处涂上紫外光固化粘合剂。首次暴露于不足以引起完全聚合的能量的紫外线用于固化胶水，同时保持粘合性能。可以移动光学元件以实现最佳对准，然后将胶水完全固化至最终状态，第二次暴露于紫外线以提供永久粘附。第一次和第二次曝光能量剂量（即，如果使用已知和恒定能量密度的来源，则曝光时间）必须根据所用紫外线源的能量密度、胶水层的厚度、紫外线通过光学元件的传输以及要粘合的表面的表面纹理（或缺乏纹理）进行优化。
虽然纹理薄膜和粘合剂涂层盖玻片之间的粘附力需要足够强以提供防漏密封，但如果需要任何进一步的分析，例如基因型分析，还需要能够在成像后去除纹理薄膜以检索类器官。使用此处描述的方案，在防漏密封和剥离纹理薄膜的能力之间实现了正确的折衷，但可能需要进一步优化盖玻片上粘合剂薄层的预固化和最终固化时间，因为它取决于紫外线暴露系统和使用的薄膜厚度。
当前微孔版本的一个限制是播种程序;细胞必须在ECM组件之前接种，以允许它们进入金字塔附近。作为第一步，正在进行改进以用细胞外基质组分涂覆微孔。我们尚未对腔内的固定类器官进行任何电子显微镜（EM）。在用EM对微孔中的类器官进行成像成为可行的选择之前，需要对这些制造和细胞培养方案进行一些修改。
这种方法未来的自然扩展是提供高内涵筛选能力，以允许在单个工作流程（多孔板）中进行多条件测试。该细胞培养设备为现有类器官技术提供了一种独特的替代方案，提供了无与伦比的培养和成像通量，并为生物医学应用和药物发现的类器官研究领域开辟了新的前景。
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Disclosures
一项国际专利申请已经公布，公布号为WO 2021/167535 A1。
Acknowledgments
该研究得到了新加坡总理办公室国家研究基金会在其卓越研究和技术企业校园（CREATE）计划下支持的CALIPSO项目的支持。V.V.感谢NRF调查员NRF-NRFI2018-07，教育部3级MOE2016-T3-1-005，MBI种子资金和ANR ADGastrulo的支持。A.B.和G.G.感谢MBI核心资金的支持。A.B.感谢Andor Technologies借用BC43显微镜。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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