Summary
Het verkrijgen van sterilisatie is essentieel voor tracheale weefseltransplantatie. Hierin presenteren we een sterilisatieprotocol met behulp van lage dosis gammastraling die volledig wordt getolereerd door organen.
Abstract
Een van de belangrijkste aspecten om ervoor te zorgen dat een transplantatie correct evolueert, is de steriliteit van het medium. Gedecellulariseerde tracheale transplantatie omvat het implanteren van een orgaan dat oorspronkelijk in contact stond met de omgeving, waardoor het vanaf het begin niet steriel was. Hoewel het decellularisatieprotocol (door middel van detergentexpositie [2% natriumdodecylsulfaat], continu roeren en osmotische schokken) wordt uitgevoerd in overeenstemming met aseptische maatregelen, biedt het geen sterilisatie. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen het waarborgen van steriliteit voorafgaand aan in vivo implantatie. Hoewel er vastgestelde gammastralingssterilisatieprotocollen zijn voor anorganische materialen, zijn er geen dergelijke maatregelen voor organische materialen. Bovendien kunnen de bestaande protocollen voor anorganische materialen niet worden toegepast op organische materialen, omdat de vastgestelde stralingsdosis (25 kGy) het implantaat volledig zou vernietigen. Dit artikel bestudeert het effect van een geëscaleerde stralingsdosis in een gedecellulariseerde konijnenluchtpijp. We handhaafden het dosisbereik (kGy) en testten geëscaleerde doses totdat we de minimale dosis vonden waarbij sterilisatie wordt bereikt. Na het bepalen van de dosis bestudeerden we de effecten ervan op het orgaan, zowel histologisch als biomechanisch. We stelden vast dat hoewel 0,5 kGy geen steriliteit bereikte, doses van zowel 1 kGy als 2 kGy dat wel deden, waarbij 1 kGy daarom de minimale dosis was die nodig was om sterilisatie te bereiken. Microscopische studies toonden geen relevante veranderingen in vergelijking met niet-gesteriliseerde organen. Axiale biomechanische eigenschappen werden helemaal niet gewijzigd en er werd slechts een lichte vermindering van de kracht per lengte-eenheid waargenomen die het orgaan radiaal kan verdragen. We kunnen daarom concluderen dat 1 kGy volledige sterilisatie van gedecellulariseerde konijnenluchtpijp bereikt met een minimale of geen effecten op het orgaan.
Introduction
Sterilisatie van een implantaat is een basisvoorwaarde voor de levensvatbaarheid ervan; In feite zijn prothesen die succesvol zijn gebleken, die geïmplanteerd in steriele gebieden (bloedvaten, hart, bot, enz.) 1. De luchtpijp heeft twee oppervlakken: een oppervlak in contact met de externe omgeving, dat daarom niet steriel is, en een oppervlak naar het mediastinum, dat steriel is. Daarom is het vanaf het moment dat de luchtpijp wordt geëxtraheerd geen steriel orgaan. Ondanks dat het daaropvolgende decellularisatieproces wordt uitgevoerd in maximale steriele omstandigheden, is het geen sterilisatiestap2. De implantatie van vreemd materiaal op zich brengt een risico op infectie met zich mee vanwege de probacteriële micro-omgeving die het produceert3en een risico tot 0,014% op ziekteoverdracht van de donor naar de ontvanger, zelfs als het materiaal is gesteriliseerd4. Om een correcte vascularisatie van de luchtpijp te garanderen, ondergaat deze in bijna alle experimentele transplantatieprotocollen eerst heterotope implantaat 5,6,7 naar een steriel gebied (spier, fascia, omentum, subcutaan, enz.); Dit komt omdat het implanteren van een niet-steriel element in dit medium zou leiden tot infectie van het gebied3.
Er zijn verschillende mogelijke strategieën om een steriel implantaat te verkrijgen. Met behulp van superkritische CO2is terminale sterilisatie 8,9 bereikt. Andere methoden, zoals ultraviolette straling of behandeling met stoffen zoals perazijnzuur, ethanol, zuurstofperoxide en geëlektrolyseerd water, hebben verschillende succespercentages bij sterilisatie verkregen, bijna altijd afhankelijk van hun doseringen, maar er is aangetoond dat ze de biomechanische kenmerken van implantaten beïnvloeden. Inderdaad, sommige stoffen, zoals ethyleenoxide, kunnen de structuur van de geïmplanteerde matrix aanzienlijk veranderen en kunnen zelfs ongewenste immunogene effecten veroorzaken. Om deze reden kunnen veel van deze strategieën niet worden toegepast op biologische modellen 2,10,11,12,13.
De meest bestudeerde en geaccepteerde sterilisatiestrategie is die van de ISO 11737-1:2006-norm voor de sterilisatie van medische hulpmiddelen die bij mensen zijn geïmplanteerd, met een gammastralingsdosis van 25 kGy. Deze verordening richt zich echter alleen op de sterilisatie van inerte, niet-biologische elementen14,15. Bovendien zijn de doses radiotherapie bij de radicale behandeling van carcinoom drie ordes van grootte lager dan die welke worden gebruikt om medische hulpmiddelen te steriliseren1. Met dit in gedachten kunnen we concluderen dat deze dosis niet alleen de microbiota zou doden, maar ook de biologische structuur van het implantaat zou vernietigen en radicaal zou veranderen. Er is ook de mogelijkheid dat het bij afbraak resterende lipiden zou genereren, die mogelijk cytotoxisch kunnen zijn en de enzymatische afbraak van de steiger 13,14,15,16,17 kunnen versnellen, zelfs bij gebruik van doses zo laag als 1,9 kGy en met schade die recht evenredig is met de ontvangen stralingsdosis 17.
Het doel van dit artikel is dus om te proberen de stralingsdosis te identificeren die het mogelijk maakt om een steriel implantaat te verkrijgen met minimale schadelijke effecten veroorzaakt door bestraling 2,18,19. De strategie die we volgden omvatte de bestraling van gedecellulariseerde en bestraalde luchtpijpen bij verschillende geëscaleerde doses binnen een bereik van kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, enz.), totdat een negatieve cultuur werd bereikt. Aanvullende tests werden uitgevoerd voor die doses die negatieve culturen bereikten, om sterilisatie te bevestigen. Na het bepalen van de minimale dosis om sterilisatie te verkrijgen, werden de structurele en biomechanische effecten van de bestraling op de luchtpijp gecontroleerd. Alle statistieken werden vergeleken met de controle inheemse konijnen luchtpijpen. De sterilisatie van het construct werd vervolgens in vivo getest door de luchtpijpen in Nieuw-Zeelandse witte konijnen te implanteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Europese richtlijn 20170/63/EU voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werd nageleefd en het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Valencia (wet 86/609/EEG en 214/1997 en code 2018/VSC/PEA/0122 type 2 van de regering van Valencia, Spanje).
1. Tracheale decellularisatie
OPMERKING: De decellularisatiemethode is elders gemeld20.
- Euthanaseer mannelijke volwassen Nieuw-Zeelandse witte konijnen (Oryctolagus cuniculus) met een gewicht van 3,5-4,1 kg met 133 mg / kg pentobarbitalnatrium, met behulp van een injectie van 200 mg / ml door de marginale oorader.
- Terwijl u zorgt voor aseptische omstandigheden, voert u een centrale longitudinale cervicotomie uit, ontleedt u de cervicale spieren en nadert u de luchtpijp. Ontleed het orgaan omtreks- en longitudinaal. Tot slot, transect onder de eerste ring en net boven de carina.
- Snijd met een scalpel de luchtpijpen in stukken van 2 cm. Verwijder met een schaar het omliggende bindweefsel en de binnenste slijmvlieslaag6.
- Dompel de monsters onder in 12 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% natriumdodecylsulfaat (SDS), 5% penicilline-streptomycine en 5% amfotericine B bevat.
- Onderwerp de luchtpijpen aan constant roeren met een magneetroerder bij 400 tpm gedurende 5 weken bij kamertemperatuur. Vervang de decellularisatieoplossing wekelijks na een osmotische schok van 2 uur, door middel van onderdompeling van de luchtpijp in gedestilleerd water.
- Cryogeniseer de monsters met behulp van een mengsel van 12 ml van 80% foetaal runderserum (FBS) en 20% dimethylsulfoxide (DMSO) in een vriescontainer bij -80 °C.
- Wanneer de luchtpijpen worden gebruikt (na 13-15 dagen), ontdooi ze dan in een waterbad bij 37 °C en was ze door ze onder te dompelen in PBS nadat het ontdooien is voltooid.
2. Sterilisatie
- Bestraling
- Plaats partijen van vier tracheale stukken van elk 2 cm in een 20 ml methacrylaat in een T25-kweekkolf gevuld met PBS totdat een totaal volume van 30 ml is bereikt. Zorg ervoor dat er geen bellen ontstaan, die energiediffusie in de lucht-vloeistofinterface kunnen veroorzaken.
- Voer bestraling uit met behulp van een lineaire versneller, met fotonen met een nominale energie van 10 MV afvlakkende filtervrije bundels. Breng een dosistempo van 2.400 monitoreenheden per minuut aan in het isocentrum, plaats de luchtpijpen op een bronoppervlakafstand van 100 cm om te worden bestraald, met een scherptediepte van 2,5 cm voor een stralingsveld van 10 cm x 10 cm - zodat de hele container wordt bedekt - overeenkomend met een dosis van 24 Gy / min.
- Escaleer de doses met elke vierdelige batch; vier stukken worden onderworpen aan 0,5 kGy, vier tot 1 kGy, vier tot 2 kG, enz., totdat sterilisatie is bereikt.
- Cultuur
- Introduceer de stukjes in 30 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met geïnactiveerde 10% FBS zonder antibiotica of antischimmelmiddelen.
- Kweek ze gedurende 2 weken in een standaard weefselincubator bij 37 °C en 5% CO2 en inspecteer ze elke 24 uur.
OPMERKING: De verontreinigingsparameters zijn veranderingen in de pH van het kweekmedium en dienovereenkomstig veranderingen in de kleur en troebelheid van het medium. De luchtpijpen werden geoogst van kiemvrije lagomorfen, die niet ziek waren en dus verwachtten verstoken te zijn van anaerobe bacteriën in hun luchtpijpen.
3. Histologische analyse
OPMERKING: Beits de stukken met hematoxyline en eosine21, Masson's trichromen en orceïne22.
- DAPI-kleuring
- Bepaal de levensvatbaarheid van het weefsel met behulp van DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool). Deze blauw-fluorescerende vlek bindt sterk aan adenine- en thyminerijke gebieden in DNA-sequenties en maakt het daarom mogelijk om DNA te bekijken via fluorescentiemicroscopie.
- Sluit de weefselmonsters in de optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding in.
- Snijd de monsters met behulp van een cryostaat.
- Was het te verven monster driemaal in gedestilleerd water om het OCT te verwijderen. Plaats het in een montagemedium met een DAPI-oplossing van 30 nM.
- Visualiseer fluorescentie met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- DNA-gehalte analyse
- Snijd segmenten van de luchtpijp van ongeveer 3 mm lang met behulp van een scalpel.
- Incubeer gedurende 2 uur in proteïnase K (Tabel met materialen).
- Extraheer het DNA met een DNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Bepaal door middel van spectrofotometrie de concentratie van DNA door de absorptie bij 260/280 te meten met behulp van een spectrofotometer.
- Meet de grootte van de geëxtraheerde DNA-monsters met behulp van capillaire chromatografie met een bioanalysator.
4. Biomechanisch onderzoek
OPMERKING: De weerstand van tracheale tegen langs- en dwarskrachten wordt gemeten door middel van axiale trek- en radiale compressietests23.
- Tracheale meting
- Meet de tracheale lengte, wanddikte en buitendiameter met behulp van een Vernier-remklauw.
- Bereken de gemiddelde waarden uit drie willekeurige metingen van elk van de variabelen.
- Bereken bij de radiale compressietests de anteroposterieure diameter door het punt te detecteren waarop de plaat in contact komt met het monster.
- Voer alle tests uit bij kamertemperatuur.
- Trekproeven
- Voer trekproeven uit op een tractiedesktop universele testmachine (UTM) verplaatsingsregeling, uitgerust met een belasting van 100 N (0,1 N krachtresolutie, 0,001 mm positie en 0,1 s). De testmachine is uitgerust met kracht- en positiesensoren en is verbonden met een computer met software die speciaal is ontworpen door de fabrikant23.
- Leg elke 0,4 s gegevens vast en exporteer deze naar een spreadsheet.
- Bouw trekkaken aangepast aan het gemiddelde kaliber van de konijnenluchtpijpen uit zuivere monolaagse, niet-toxische kristalpolyvinylchloride (PVC) holle buizen met een uitwendige diameter van 1 cm en een wanddikte van 1,5 mm.
- Sectie de geleiders in 3 cm lange segmenten.
- Boor 12 voorgevormde gaten voor de termino-terminale hechting, 2 mm van de rand van de kaken en gescheiden door een afstand van 2,5 mm, om vertekening door de hechtingen te voorkomen.
- Bevestig de PVC-glazen buizen aan de luchtpijp van het konijn door termino-terminale anastomose met een continue hechting door afwisselend voorgevormde gaten (elke 5 mm), op 2 mm afstand van de rand van de luchtpijp en met een 6-0 nylon monofilamenthechting.
- Rek alle stukken uit met een verplaatsingssnelheid van 5,0 mm/min.
- Noteer de variabelen maximale spanning (σ max, in N/mm2) en spanning (εmax, zonder eenheden), samen met de opgeslagen energie per eenheid luchtpijpvolume (W/Vol, in mJ/mm) en Young's modulus (E, in MPa).
- Radiale compressietests
- Voer radiale compressietests uit op een UTM met compressiedesktop, uitgerust met een 15 N-loadcel (krachtresolutie 0,001 N, positie 0,001 mm en tijd 0,1 s) om krachtgegevens (N), positie (mm) en tijd (s) te verkrijgen. Gegevens opnemen en exporteren naar spreadsheet met intervallen van 0,5 s.
- Plaats de luchtpijpen met het vliezige gebied rustend op de onderste plaat. De plaat stijgt geleidelijk omhoog naar de bovenplaat met een constante snelheid van 5 mm/min.
- Bereken elke eenheid per eenheid lengte van het monster (f in N/mm), stijfheid (R in Mpa·mm) en de energie per oppervlakte-eenheid (W / S in mJ/mm2) die nodig is om de luchtpijp volledig af te sluiten.
5. Chirurgische techniek
OPMERKING: De chirurgische techniek is elders op grote schaal gemeld20.
- Plaats een steriele intraluminale PVC-stent, maat 14 Fr (waardoor deze vrij kan glijden zonder de wanden te comprimeren), met een marge van 3-4 mm aan elk uiteinde.
- Bevestig de stent met een enkele 6-0 nylon monofilamentsteek door de intercartilagineuze ruimte van het eerste kraakbeen.
- Ga verder met het verdoven van de konijnen.
- Pre-medicaat de proefpersonen (3,65-4,05 kg mannelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen) met intramusculaire analgetica (35 mg / kg ketamine) met een kalmerend middel, spierverslapper en analgeticum (2,5 mg / kg xylazine).
- Scheer de incisiezone uit de operatiezone en reinig het operatiegebied om het haar te verwijderen.
- Pijnstillers plus antibiotische profylaxe toedienen: 0,05 mg/kg intramusculair buprenorfine en 10 mg/kg enrofloxacine.
- Plaats een veneuze katheter in de marginale oorader van elk konijn.
- Induceer anesthesie met een intraveneuze bolus van 10 mg/kg propofol.
- Controleer de vitale functies van het dier met behulp van een elektrocardiogram met drie leads, pulsoximetrie en niet-invasieve drukmeting. Breng elke 30 minuten fysiologisch serum aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
- Controleer het verdovingsvlak met behulp van de teenknijpmethode.
- Handhaaf de anesthesie met geïnhaleerd isofluraan op 1,5% -2% van de minimale alveolaire concentratie zonder spontane ventilatie te verliezen en bied thermische ondersteuning aan het konijn met een verwarmingskussen.
- Desinfecteer de incisiezone meerdere keren in een cirkelvormige beweging met een scrub op basis van jodium. Maak onder aseptische omstandigheden te allen tijde en met steriel materiaal een longitudinale centrale thoracale incisie van 3 cm en oogst bilaterale pedicled flappen bestaande uit borstfascia en een spiercomponent.
- Wikkel de luchtpijpen met de flap in vier konijnen, één op elke hemithorax (dus in totaal acht luchtpijpen).
- Wanneer de operatie is voltooid, keert u de anesthesie om door de toediening van isofluraan te onderbreken.
- Postoperatieve periode
- Houd de dieren in de operatiekamer totdat ze volledig hersteld zijn van de anesthesie. Wanneer ze volledig zijn hersteld, breng je ze terug naar hun omgeving met andere konijnen.
- Behandel de konijnen met antibiotica (0,5 ml/kg 2,5% enrofloxacine) en pijnstillers (5 mg/ml meloxicam; 0,05 ml/kg metacam) om de 24 uur gedurende 5 dagen.
- Laat de implantaten ter plaatse gedurende de gewenste tijd.
- Voorafgaand aan euthanasie, pre-medica de konijnen met intramusculaire analgetica (35 mg / kg ketamine) en een kalmerend, spierverslapper en pijnstiller (2,5 mg / kg xylazine). Euthanaseer vervolgens de konijnen met 133 mg / kg pentobarbitalnatrium met behulp van een injectie van 200 mg / ml door de marginale oorader en oogst de luchtpijpen.
- Voer biomechanische en histologische tests uit op de luchtpijpen.
6. Statistische analyse
- Pas alle modellen aan volgens de Bayesiaanse methode op R-software, versie 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
- Analyseer de onderzoeksvariabelen, behalve f en R, met behulp van meerdere lineaire regressiemodellen.
- Pas voor de variabelen f en R gemengde lineaire regressiemodellen toe. In deze modellen introduceren, naast de variabelen van belang met betrekking tot de behandeling en conditie van elke luchtpijp, het percentage occlusie als een monotoon effect en een onafhankelijke term per luchtpijp als een willekeurige factor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisatie
DAPI-kleuring toont de afwezigheid van DNA en er werden geen DNA-waarden hoger dan 50 ng gedetecteerd in een van de luchtpijpen door elektroforese, waarbij alle fragmenten kleiner waren dan 200 bp20.
Microbiële cultuur
Twee van de acht stukken die aan 0,5 kGy werden onderworpen, vertoonden kleurverandering in minder dan 1 week. Geen van de met 1 kGy en 2 kGy bestraalde stukken vertoonde enige kleurverandering (figuur 1).
Histologische analyse
Er werden geen veranderingen in het collageen- of elastische vezelverdelingspatroon gedetecteerd in een van de geanalyseerde monsters (figuur 2).
Bepaling van de stralingsdosis
Gezien de hierboven beschreven resultaten, waaruit bleek dat bestraling bij 0,5 kGy geen sterilisatie van het monster garandeerde, terwijl doses van 1 kGy en 2 kGy dat wel deden, stelden we de minimaal mogelijke doorstralingsdosis vast om sterilisatie van het weefsel als 1 kGy te bereiken. Daarom hebben we de biomechanische impact van deze dosis op de luchtpijpengetest 2,17,23.
Biomechanische studie
Axiale trekproeven
De gegevens die bij de trekproef op bestraalde luchtpijpen zijn verkregen, zijn weergegeven in tabel 1. Figuur 3 toont de bijbehorende spanning-rekcurves en breekpunten.
Het onderwerpen van tracheale stukken aan gammastraling voor sterilisatiedoeleinden, ondanks het licht verhogen van de gedetecteerde waarden, veroorzaakt dus geen significante effecten op de axiale biomechanische kenmerken van de organen. Vandaar dat zowel de σmax die de luchtpijpen kunnen verdragen (0,05 MPa; CI [-0,046, 0,144] MPa), evenals εmax (0,096 CI [-0,096, 0,281]), (0,022 MPa; CI [-0,23, 0,274] MPa), en W / Vol (vanaf 0,044 mJ / mm3; BI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), zijn in deze steekproef zeer licht verhoogd, maar zijn in geen geval van toepassing op de populatieschatting.
Radiale compressietests
De compressietests die zijn uitgevoerd op zowel de oorspronkelijke luchtpijpen (controles) als op de gedecellulariseerde, gecryopreserveerde en bestraalde luchtpijpen zijn weergegeven in tabel 2. De bijbehorende grafieken zijn te zien in figuur 4.
Gammastraling veroorzaakt slechts een minimale maar significante afname van radiale biomechanische eigenschappen in de variabele kracht per lengte-eenheid, die varieert met -0,017 N/mm; BI [-0,042, -0,004] N/mm, terwijl de minimale variaties gedetecteerd in W/Vol (0,044 mJ/mm3; BI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), R (-0,018 MPa · mm; BI [-0,145, 0,083] MPa · mm), en W/S (-0,081 mJ/mm2; BI [-0,95, 0,74] mJ/mm2), zijn in geen geval van toepassing op de bevolkingsschatting (figuur 5).
Implantaat
Macroscopisch onderzoek
Geen van de dieren vertoonde inflammatoire of infectieuze symptomen tijdens de postoperatieve periode; Hun dieet werd hersteld zoals gepland en antibiotica en pijnstillers werden op dag vijf opgeschort. Bij euthanasie werd de integratie van de luchtpijp en de flap macroscopisch waargenomen, zonder zichtbare tekenen van ontsteking.
Histologisch onderzoek
Het histologisch onderzoek toonde aan dat de flap sterk georganiseerd bindweefsel vormde - nauw verbonden met de tracheale ringen, met continuïteit tussen hen en het weefsel - in de vorm van het perichondrium van de inheemse luchtpijp. Het kraakbeen was intact en vertoonde geen tekenen van necrose. Bovendien werd de aanwezigheid van macrofagen en enkele geïsoleerde reuzencellen die vellen vormen waargenomen. Afgezien van de schaarse aanwezigheid van eosinofielen, werd de gebruikelijke postoperatieve milde acute ontstekingscellulariteit waargenomen (figuur 6). Beginnende neovascularisatie werd ook waargenomen rond de luchtpijp.
Biomechanische evaluatie
Na implantatie in de lagomorf bleven de kenmerken van de luchtpijp ongewijzigd, met uitzondering van de kracht per lengte-eenheid, die de kenmerken van de inheemse luchtpijp slechts 2 weken na de transplantatie herstelde (0,006 N/mm, BI [-0,026, 0,04] N/mm) (figuur 7).
Figuur 1: Doorstraalde luchtpijpen in DMEM zonder antibiotica of antischimmelmiddelen. De kleur van de twee exemplaren aan de linkerkant (0,5 kGy) is veranderd, wat wijst op een verandering in pH, en is een indirect teken van bacteriegroei. Er is ook verhoogde troebelheid in het eerste exemplaar aan de linkerkant. De twee exemplaren rechts (1 kGy) vertonen geen kleurverandering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Luchtpijpen gedecellulariseerd en bestraald in verschillende doses. Elke rij komt overeen met een andere kleuring en elke kolom met een andere sterilisatiedosering. 1) Hematoxyline-eosine. Panoramisch uitzicht op het kraakbeen, slijmvlies, submucosa en serosa. 2) Masson's trichrome vlek. Tracheale submucosa. 3) Hematoxyline-eosine. Gedetailleerde weergave van het tracheale kraakbeen. (A) Niet-doorstraalde luchtpijpen (controle). B) Doorstraalde luchtpijpen bij 0,5 kGy. C) Doorstraalde luchtpijpen met 1 kGy. D) Doorstraalde luchtpijpen bij 2 kGy. De afwezigheid van objectieve histologische veranderingen met betrekking tot de stralingsdosis wordt waargenomen. Afkorting: N = inheemse luchtpijp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Spanning-rekcurven voor gedecellulariseerde en bestraalde luchtpijpen. Het breekpunt is oranje gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: curven voor het percentage occlusie dat overeenkomt met tractietests in gedecellulariseerde en bestraalde luchtpijpen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Biomechanische respons op bestraling. (A) Grafiek van de marginale effecten op de variabele kracht per lengte-eenheid, volgens het occlusiepercentage van de bestralingsinteractie. B) Grafiek van de marginale effecten op de variabele kracht per lengte-eenheid, volgens het occlusiepercentage van de bestralingsinteractie. (C) Partiële afhankelijkheidsgrafiek van de opgeslagen energie per oppervlakte-eenheidsmodel voor de bestralingsvariabele. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Zicht op geïmplanteerde luchtpijp na 2 weken . (A) Masson's trichrome kleuring. Neogevormd bindweefsel van het tracheale buitenoppervlak georganiseerd in concentrische lagen van vezels en cellen wordt waargenomen. b) Hematoxyline-eosine. Panoramisch uitzicht op perfect bewaard kraakbeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Grafiek van de marginale effecten van de interactie tussen kracht per lengte-eenheid en percentage occlusie en controle (inheemse) luchtpijpen versus luchtpijpimplantaten na 2 weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Trekproeven op bestraalde luchtpijpen. Controles zijn inheemse konijnenluchtpijpen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Compressietests op bestraalde, gedecellulariseerde luchtpijpen. Controles zijn inheemse konijnenluchtpijpen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er bestaan verschillende sterilisatiestrategieën. Superkritisch CO2dringt volledig door in weefsels, verzuurt het medium en deconstrueert de cellulaire fosfolipide dubbellaag met eenvoudige eliminatie door middel van drukverlaging van het implantaat 8,14,25. Ultraviolette straling is ook gebruikt en de effectiviteit ervan bij de luchtpijp van knaagdieren is gepubliceerd, hoewel er slechts een paar rapporten in de literatuur zijn10. Andere gebruikte methoden omvatten de toepassing van stoffen zoals perazijnzuur, ethanol, zuurstofperoxide of geëlektrolyseerd water, die onregelmatige resultaten hebben gegeven en waarvan is aangetoond dat ze weefsel sterk beïnvloeden11,12. In tegenstelling tot de bovengenoemde strategieën, is gammastraling niet alleen volledig effectief gebleken in termen van sterilisatie, maar is het ook grondig en overvloedig bestudeerd, zowel met betrekking tot de dosis als de steriliserende effecten. In feite is het zo veel bestudeerd dat er een ISO-norm is voor het gebruik van gammastraling bij sterilisatie, waarin de dosis voor de sterilisatie van inert materiaal dat bij mensen moet worden geïmplanteerd, is vastgesteld op 25 kGy13,14,15.
Aan de andere kant is aangetoond dat bestraling, naast het steriliseren van materiaal, ook neveneffecten veroorzaakt als een beperking van de techniek. Deze omvatten de vernietiging en wijziging van matrices door het denatureren van eiwitmoleculen, waaronder collageen, en het genereren van resterende moleculen, die zelfs giftig kunnen worden. Deze achteruitgang van de orgaanstructuur heeft bijgevolg invloed op zowel de biologische als de biomechanische eigenschappen, waarbij de schadelijke effecten van bestraling recht evenredig zijn met de dosis en worden waargenomen bij relatief lage doses 13,14,15,16,17. Hier was het doel dus tweeledig: enerzijds het verkrijgen van een steriele constructie om een levensvatbaar implantaat te garanderen, en anderzijds het behoud van de biologische en biomechanische kenmerken van de matrix, aangezien het implantaat zinloos zou zijn tenzij beide zouden worden gehandhaafd26. De uitdaging was dus om een strategie te kiezen die een balans mogelijk maakte tussen succesvolle sterilisatie en het behoud van de weefselstructuur.
Hierin werd 1 kGy vastgesteld als de minimale dosis voor sterilisatie. Histologisch onderzoek toonde aan dat deze dosis bestraling geen invloed heeft op het weefsel. Verder heeft biomechanische karakterisering van de bestraalde luchtpijpen vastgesteld dat het gebruik van bestraling absoluut geen verschil maakt voor de tractieparameters. Er was een lichte maar statistisch significante afname van de kracht per lengte-eenheid die de luchtpijp kon verdragen in de radiale compressietests, maar dit heeft geen invloed op de andere radiale kenmerken.
Hoewel er een paar artikelen zijn die de onmogelijkheid van sterilisatie en de destructuratie veroorzaakt door doses zo laag als 1,5 kGy 19 bespreken, is de overgrote meerderheid in overeenstemming met de gepresenteerde gegevens 2,18,19. Op deze manier merken de auteurs op dat het steriliseren van bot in doses van 10, 15, 20 en 25 kGy volledige sterilisatie bereikt, hoewel in ruil voor een vermindering van de celincubatiecapaciteit en een toename van collageenafbraakproducten bij doses hoger dan 15 kGy18. Een dosis van 1,5 kGy verkreeg geen sterilisatie in gedecellulariseerde hartkleppen, maar veroorzaakte wel schade aan de mechanische eigenschappen van de monsters, zowel in vivo als in vitro; ondertussen bereikte een dosis van 3 kGy wel sterilisatie, maar veroorzaakte destructurering en fibrose19. Wat de luchtpijp betreft, vergeleken Johnson et al. de effecten van sterilisatie bij de ISO-dosis van 25 kGy met een dosis van 5 kGy. Beide doses verkregen terminale sterilisatie, waarbij de dosis van 5 kGy de structuur van het monster enigszins veranderde en de dosis van 25 kGy de luchtpijp volledig destructureerde2.
Bovendien wordt effectieve sterilisatie bevestigd dankzij een afwezigheid van infectieuze gebeurtenissen met betrekking tot het implantaat na 2 weken, waarbij sterilisatie volledig wordt getolereerd door de organen. Ook bleef de structuur volledig behouden, zonder necrose of denaturatie van het orgaan. Bovendien werd als aanvullende bevinding opgemerkt dat de kleine verandering in biomechanische kenmerken - tot de kracht die de luchtpijp per lengte-eenheid kan verdragen - slechts 2 weken na implantatie terugkeerde naar de waarden van een inheemse luchtpijp; Daarom kan dit effect buiten beschouwing worden gelaten volgens het uiteindelijke beheer van de constructie.
Daarom presenteert dit artikel de mogelijkheid om volledig steriele organen te verkrijgen bij veel lagere doses dan de aanbevolen dosis van 25 kGy; het voorstel lost de sterilisatie van Nieuw-Zeelandse konijnenluchtpijpen met een dosis van 1 kGy op. Deze dosis zorgt ervoor dat de histologische, ultrastructurele en biomechanische kenmerken van deze organen behouden blijven en toont een perfecte tolerantie voor de implantatie. Een beperking van het onderzoek is dat het alleen wordt uitgevoerd op gesteriliseerde konijnenluchtpijpen, die over het algemeen een lagere dosering vereisen omdat ze kleiner zijn; er kan echter worden geconcludeerd dat de te hoge cijfers die zijn vastgesteld in de ISO-norm voor inerte implantaten niet nodig zijn voor de sterilisatie van gedecellulariseerde luchtpijpen, wat een enorme prestatie is vanwege de sterk verminderde schade aan het weefsel. Bovendien kunnen deze doses in toekomstige studies, afhankelijk van het dier en dus van de grootte van de luchtpijp, worden aangepast aan veel lagere doses die bijgevolg meer respect hebben voor de structuur en functie van het orgaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit artikel werd ondersteund door de 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Nummer 180101 toegekend aan Néstor J.Martínez-Hernández] en PI16-01315 [toegekend aan Manuel Mata-Roig] door het Instituto de Salud Carlos III. CIBERER wordt gefinancierd door het VI National R&D&I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions en het Instituto de Salud Carlos III, met steun van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
