Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering av menneskelig cerebellær utvikling in vitro i 2D-struktur

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

Den nåværende protokollen forklarer genereringen av et 2D-monolag av cerebellære celler fra induserte pluripotente stamceller for å undersøke de tidlige stadiene av cerebellær utvikling.

Abstract

Den presise og rettidige utviklingen av lillehjernen er avgjørende ikke bare for nøyaktig motorisk koordinering og balanse, men også for kognisjon. I tillegg har forstyrrelse i cerebellar utvikling vært involvert i mange nevrodevelopmental lidelser, inkludert autisme, oppmerksomhetsunderskudd-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) og skizofreni. Undersøkelser av cerebellær utvikling hos mennesker har tidligere bare vært mulig gjennom post mortem-studier eller neuroimaging, men disse metodene er ikke tilstrekkelige for å forstå de molekylære og cellulære endringene som forekommer in vivo under tidlig utvikling, som er når mange nevroutviklingsforstyrrelser oppstår. Fremveksten av teknikker for å generere menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCs) fra somatiske celler og evnen til ytterligere å re-differensiere iPSCs til nevroner har banet vei for in vitro-modellering av tidlig hjerneutvikling. Denne studien gir forenklede skritt mot å generere cerebellære celler for applikasjoner som krever en 2-dimensjonal (2D) monolagsstruktur. Cerebellarceller som representerer tidlige utviklingsstadier, er avledet fra humane iPSCer via følgende trinn: først blir embryoide legemer laget i 3-dimensjonal (3D) kultur, deretter behandles de med FGF2 og insulin for å fremme cerebellar skjebnespesifikasjon, og til slutt blir de terminalt differensiert som et monolag på poly-l-ornitin (PLO) / lamininbelagte substrater. Ved 35 dagers differensiering uttrykker iPSC-avledede cerebellære cellekulturer cerebellære markører, inkludert ATOH1, PTF1α, PAX6 og KIRREL2, noe som tyder på at denne protokollen genererer glutamatergiske og GABAergiske cerebellar neuronale forløpere, samt Purkinje-celleprogenitorer. Videre viser de differensierte cellene distinkt nevronmorfologi og er positive for immunfluorescensmarkører for nevronidentitet som TUBB3. Disse cellene uttrykker aksonale veiledningsmolekyler, inkludert semaforin-4C, plexin-B2 og neuropilin-1, og kan tjene som en modell for å undersøke molekylære mekanismer for neurittutvekst og synaptisk tilkobling. Denne metoden genererer menneskelige cerebellære nevroner som er nyttige for nedstrøms applikasjoner, inkludert genuttrykk, fysiologiske og morfologiske studier som krever 2D monolagsformater.

Introduction

Å forstå menneskelig cerebellar utvikling og de kritiske tidsvinduene i denne prosessen er viktig ikke bare for dekoding av mulige årsaker til nevroutviklingsforstyrrelser, men også for å identifisere nye mål for terapeutisk inngrep. Modellering av menneskelig cerebellær utvikling in vitro har vært utfordrende, men over tid har mange protokoller som skiller menneskelige embryonale stamceller (hESCs) eller iPSCs med cerebellar avstamningsskjebner dukket opp 1,2,3,4,5,6,7,8 . Videre er det viktig å utvikle protokoller som genererer reproduserbare resultater, er relativt enkle (for å redusere feil), og er ikke tunge på monetære kostnader.

De første protokollene for cerebellær differensiering ble generert fra 2D-kulturer fra belagte embryoide legemer (EBs), noe som induserte cerebellar skjebne med ulike vekstfaktorer som ligner på in vivo-utvikling, inkludert WNT, BMPs og FGFs 1,9. Nyere publiserte protokoller induserte differensiering primært i 3D-organoidkultur med FGF2 og insulin, etterfulgt av FGF19 og SDF1 for rhombic leppelignende strukturer3,4, eller brukte en kombinasjon av FGF2, FGF4 og FGF85. Begge cerebellar organoid induksjonsmetoder resulterte i lignende 3D cerebellar organoider da begge protokollene rapporterte lignende cerebellar markøruttrykk ved identiske tidspunkter. Holmes og Heine utvidet sin 3D-protokoll5 for å vise at 2D-cerebellarceller kan genereres fra hESCs og iPSCs, som starter som 3D-aggregater. I tillegg viste Silva et al.7 at celler som representerer modne cerebellære nevroner i 2D, kan genereres med en lignende tilnærming til Holmes og Heine, ved å bruke et annet tidspunkt for å bytte fra 3D til 2D og forlenge tiden for vekst og modning.

Den nåværende protokollen induserer cerebellar skjebne i materfrie iPSC-er ved å generere frittflytende embryoide legemer (EB) ved bruk av insulin og FGF2 og deretter plating EBs på PLO / laminin-belagte retter på dag 14 for 2D-vekst og differensiering. Ved dag 35 oppnås celler med cerebellær identitet. Evnen til å rekapitulere de tidlige stadiene av cerebellær utvikling, spesielt i et 2D-miljø, gjør det mulig for forskere å svare på spesifikke spørsmål som krever eksperimenter med en monolagsstruktur. Denne protokollen er også egnet til ytterligere modifikasjoner som mikropatterned overflater, aksonale utvekstanalyser og cellesortering for å berike de ønskede cellepopulasjonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskningen på menneskelige ble godkjent under University of Iowa Institutional Review Board godkjenningsnummer 201805995 og University of Iowa Human Pluripotent Stem Cell Committee godkjenningsnummer 2017-02. Hudbiopsier ble innhentet fra forsøkspersonene etter skriftlig informert samtykke. Fibroblastene ble dyrket i DMEM med 15% føtalt bovint serum (FBS) og 1% MEM-ikke-essensiell aminosyreoppløsning ved 37 ° C og 5% CO2. Fibroblaster ble omprogrammert ved hjelp av et episomalt omprogrammeringssett etter produsentens protokoll (se materialtabell) ved hjelp av en nukleofektorer for elektroporering. Alle prosedyrer ble utført i et klasse II Type A2 biologisk sikkerhetsskap ("hette" for kort). Alle cellekulturmedier var antibiotikafrie; Derfor ble hver komponent som kom inn i hetten rengjort med 70% etanol. Alle cellekulturmedier og komponenter ble sterilt filtrert eller åpnet i hetten for å opprettholde steriliteten.

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Forbered kjellermembranmatrise (BMM) -belagte plater.
    MERK: BMM størkner raskere ved varmere temperaturer. Platene må tilberedes raskt og umiddelbart ved 4 °C for oppbevaring.
    1. Tine BMM (se tabell over materialer) på is, ved 4 °C i minst 2 timer, eller over natten.
    2. Bland DMEM/F12 og BMM til en endelig konsentrasjon på 80 μg/ml. Fordel BMM-løsningen i vevskulturskåler (1 ml for 35 mm og 2 ml for 60 mm servise) og inkuber ved 37 °C i minst 1 time eller over natten før cellene pløyes på.
      MERK: De ubrukte rettene kan oppbevares ved 4 °C i 2 uker.
  2. Klargjør poly-L-ornitin / laminin (PLO / laminin)-belagte plater.
    1. Forbered 20 μg / ml PLO (se materialtabell) i steril DPBS +/+ og tilsett 1 ml til hver brønn på en 6-brønns plate. Inkuber over natten ved 37 °C i inkubatoren.
    2. Dagen etter aspirerer du PLO med en vakuumsuger og vasker to ganger med DPBS+/+. Luft tørr i hetten.
      NOTAT: Lufttørkede plater kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker, innpakket i aluminiumsfolie, for fremtidig bruk.
    3. Forbered 10 μg / ml laminin (se materialtabell) i DPBS +/+ og tilsett 1 ml til hver brønn på en 6-brønns plate. Rug i minst 3 timer eller over natten ved 37 °C i inkubatoren.
    4. Aspirer lamininet med en vakuumaspirator og tilsett enten 1 ml medium eller steril DPBS+/+.
      MERK: Lamininbelegget må ikke tørke ut. PBS eller et passende kulturmedium bør legges til umiddelbart for å forhindre dette. Belagte plater kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
  3. Klargjør PSC passaging løsning.
    MERK: Et osmometer (se materialtabell) er nødvendig for å lage PSC-passasjeløsning10.
    1. Løs opp 11,49 g kaliumklorid (KCl) og 0,147 g natriumsitratdihydrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) i 400 ml sterilt cellekulturvann (se materialtabell).
    2. Mål volumet på løsningen og registrer den som det første volumet (Vi).
    3. Mål osmolariteten og juster den til 570 mOsm ved å legge til sterilt cellekulturkvalitetsvann ved hjelp av formelen Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtersteriliser løsningen med et 0,20 μm filter og lag 10 ml aliquoter. Oppbevar aliquots ved romtemperatur (RT) i opptil 6 måneder.
  4. Forbered pluripotent stamcelle (PSC) medium.
    MERK: iPSC-er opprettholdes i et medium som inneholder varmestabil FGF2 (se materialtabell), noe som gir en helgefri fôringsplan. Andre kommersielt tilgjengelige PSC-medier har ikke blitt prøvd for denne protokollen.
    1. Tine PSC medium supplement over natten ved 4 ° C.
    2. Tilsett 10 ml PSC medium supplement til 500 ml basal PSC medium. Lag 25 ml aliquots og oppbevar ved -20 °C.
      MERK: Frosne aliquots kan oppbevares ved -20 °C i 6 måneder. Tint aliquots må oppbevares ved 4 °C og brukes innen 2 uker. Celler kan fryses for langtidslagring i et PSC-medium med 10% (v / v) dimetylsulfoksid (DMSO).
  5. Forbered PSC-tinemedium.
    1. Suppler PSC-medium med 50 nM chroman, 1,5 μM emricasan, 1x polyamintilskudd og 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT-cocktail11) (se materialtabell).
    2. Filtersteriliser med et 0,20 μm filter og oppbevares ved 4 °C i opptil 4 uker.
  6. Forbered trukket glasspipetter.
    1. Trekk 22,9 cm (9 tommer) glass Pasteur pipetter i to stykker over en Bunsen-brenner, ~ 2 cm under nakken, og lag to pipetter, med den tynnere siden ~ 4 cm kortere enn den andre.
    2. Ved hjelp av flammen bøyer du spissene på den trukket siden for å skape en jevn "r".
    3. Plasser de trukket pipetter i autoklavhylser og autoklav for sterilisering.
  7. Forbered cerebellar differensieringsmedium (CDM).
    1. Bland IMDM og Hams F12 næringsblanding i forholdet 1: 1. Suppler blandingen med 1x L-alanin-L-glutamintilskudd, 1% (v / v) kjemisk definert lipidkonsentrat, 0,45 mM 1-tio-glyserol, 15 μL / ml apo-transferrin, 5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) og 7 μg / ml insulin (se materialtabell).
    2. Filtersteriliser med et 0,20 μm filter, oppbevares ved 4 °C og brukes innen 1 måned.
  8. Forbered cerebellar modningsmedium (CMM).
    1. Suppler neurobasalt medium med 1x L-alanin-L-glutamintilskudd og 1x N-2 supplement (se materialtabell).
    2. Filtersteriliser med et 0,20 μm filter, oppbevares ved 4 °C og brukes innen 2 uker.

2. Feeder-fri iPSC-kultur

  1. Tine cellene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Plasser en BMM-plate (trinn 1.1) i 37 °C-inkubatoren for å geleide i minst 1 time eller over natten før du tiner cellene.
    2. Forvarm 10 ml PSC-tinemedium (trinn 1,5) ved 37 °C.
    3. Overfør kryovialet med celler fra flytende nitrogen til et vannbad ved 37 °C.
      MERK: For å unngå å generere en forurensningskilde i cellekulturområdet, anbefales det ikke å bruke et standard vannbad. I stedet kan ferskvann varmes opp i et lite beger til 37 °C for å generere et engangsvannbad.
    4. Når det er et lite stykke is igjen i røret, fjern det fra vannbadet, tørk røret og spray med 70% etanol. Overfør røret til hetten og bruk en 2 ml eller 5 ml serologisk pipette (se materialtabell) for forsiktig å overføre cellene til et 15 ml konisk rør.
    5. Tilsett 8 ml PSC-tinemedium til cellene dråpevis mens du virvler det koniske røret. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT.
    6. Aspirer supernatanten forsiktig med en vakuumaspirator uten å forstyrre cellepelleten. Resuspend cellene i 2 ml PSC tinemedium.
    7. Aspirer BMM fra platen og legg til de resuspended cellene dråpevis over hele platen for jevn fordeling.
    8. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2. Oppdater mediet neste dag med PSC medium. Deretter bytter du mediet daglig.
  2. Vedlikehold cellene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Forvarm det nødvendige volumet av PSC-medium ved 37 °C (f.eks. 1 ml medium per 35 mm plate).
    2. Undersøk platene for differensierte celler eller kolonier og fjern de differensierte cellene med en trukket glasspipette (trinn 1.6).
      MERK: iPSC-kolonier har glatte kanter med morfologisk identiske celler.
    3. Bytt brukt medium daglig og passasje hver 3-4 dag eller når 70% sammenløp er nådd.
  3. Passasje cellene.
    1. Plasser den nødvendige mengden BMM-plater i inkubatoren i minst 1 time eller over natten før du passerer. Forvarm nødvendig mengde PSC-medium (trinn 1,3) ved 37 °C.
    2. Bruk en trukket glasspipette, rengjør eventuelle differensierte celler eller kolonier.
    3. Aspirer det brukte mediet med en vakuumaspirator og tilsett PSC-dissosiasjonsmedium, 1 ml per 35 mm tallerken. Inkuber ved 37 °C i 1-3 min.
      MERK: Hvis kolonier løftes av i PSC-passasjeløsningen før PSC-medium tilsettes, kan inkubasjonstiden reduseres.
    4. Aspirer PSC-passasjeløsningen og legg til forvarmet PSC-medium.
    5. Bruk en steril 200 μL pipettespiss, skrapelinjer parallelt med hverandre i en retning, vri platen 90 °, og lag et andre sett med ripelinjer vinkelrett på de forrige (lag et kryssklekket mønster over platen).
    6. Aspirer BMM-løsningen fra settplatene. Samle koloniene ved hjelp av en serologisk pipette og fordel dem til nye BMM-plater.
    7. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2. Bytt medium daglig.
  4. Frys cellene.
    1. Forbered kryovialer ved å merke innholdet og steriliser under ultrafiolett (UV) lys i hetten (se materialtabell) i 30 minutter.
    2. Tilbered PSC-frysemedium ved å supplere PSC-medium med 10 % (v/v) DMSO. Følg trinn 2.3.2-2.3.5.
    3. Overfør cellene til et 15 ml konisk rør med en 5 ml serologisk pipette og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT.
    4. Aspirer mediet forsiktig og resuspender cellepelleten i PSC-frysemedium.
    5. Fordel i kryovaler. Legg hetteglassene i en frysebeholder og legg beholderen i en -80 °C fryser.
    6. Neste dag, overfør kryovialene til flytende nitrogen for langtidslagring.

3. Cerebellar differensiering

MERK: Før du starter differensieringen, sendes iPSC-er til seks 35 mm retter og er klare for differensiering når de er på 70% sammenløp. Hver 35 mm plate vil bli overført til en brønn på 6-brønnsplaten.

  1. På dag 0 løfter du de sunne iPSC-koloniene for EB-dannelse.
    1. Tilsett 1 ml CDM (trinn 1.7) supplert med 10 μM Y-27632 og 10 μM SB431542 (se materialtabell) til hver brønn på en 6-brønns ultralav festeplate (ULA) og plasser i inkubatoren til de løftede koloniene er klare til å legges til brønnene.
    2. Rengjør de differensierte cellene med en trukket glasspipette. Aspirer mediet og tilsett 1 ml PSC-passasjeløsning for hver 35 mm tallerken. Inkuber i 3 minutter ved 37 °C, aspirat, og tilsett 2 ml CDM supplert med 10 μM Y-27632 og 10 μM SB431542.
      MERK: Hvis kolonier løftes av i PSC-passasjeløsningen før CDM tilsettes, kan inkubasjonstiden reduseres.
    3. Under et omvendt mikroskop med overført lys løfter du koloniene forsiktig ved hjelp av den bøyde kanten av den trukket glasspipetten ved hjelp av 4x forstørrelse. Når hver koloni er løftet, overfør forsiktig alle til en brønn på 6-brønns ULA-platen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Gjenta denne prosessen for hver iPSC-plate. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2.
      MERK: Hvis koloniene er for store eller slås sammen, kan de skjæres i skiver med tuppen av den trukket glasspipetten for å lage mindre EB-er.
  2. På dag 2 tilsettes FGF2 i hver brønn til en endelig konsentrasjon på 50 ng/ml.
    MERK: FGF2 som brukes til cerebellar differensiering er ikke varmestabil. Denne protokollen er ikke testet med varmestabil FGF2.
  3. På dag 7, gjør en 1/3 middels endring. For 3 ml totalt medium i en brønn, med en 1000 μL pipetter, aspirer forsiktig 1 ml brukt medium og erstatt det med 1 ml fersk CDM. Inkuber EBene i 7 dager.
  4. På dag 14 aspirerer du forsiktig nesten hele det brukte mediet ved hjelp av en 1000 μL pipetter. For å sikre minimal skade på EB-ene, virvle platen for å samle alle EB-ene i midten av platen, og vipp deretter platen og aspirer sakte fra kanten.
    1. Når middels mengde avtar, legg sakte platen flat og fortsett å aspirere. La det være nok medium til å unngå å tørke ut EB-ene. Deretter legger du til 3 ml fersk CDM supplert med 10 μM Y-27632. Overfør EB-ene med en 10 ml serologisk pipette til en PLO/laminin-belagt skål (trinn 1.2).
      MERK: Avhengig av nedstrøms applikasjonen, kan EBs overføres til en 6-brønns PLO / lamininplate eller enkelt EBs kan overføres til en enkelt brønn av en PLO / laminin-belagt 24-brønns plate eller coverslip.
  5. På dag 15, aspirer mediet og erstatt det med fersk CDM.
    MERK: Det er viktig å tilsette nok medium i brønnene for å sikre nok medium mellom matingene, da det over tid vil være fordampning (f.eks. For en brønn i en 6-brønns plate, tilsett 3 ml medium). Hvis mediet har begynt å surgjøre (bli klart og gult), oppdater mediet selv om det ikke er på fôringsplanen til slutten av protokollen.
  6. På dag 21, aspirer det brukte mediet og erstatt det med CMM. På dag 28, bytt medium med fersk CMM. På dag 35, høst cellene for videre applikasjoner.

4. Prøvepreparering for RNA-isolasjon

  1. Aspirer mediet og tilsett 500 μL celledissosiasjonsreagens (se materialtabell) til hver brønn på 6-brønnsplaten. La den være på i et par sekunder og aspirer.
  2. Inkuber platen, med lokket på, ved romtemperatur i 2 minutter. Trykk på sidene av platen for å løsne cellene.
  3. Tilsett 1 ml CMM (trinn 1.8) og samle cellene i et 1,5 ml rør.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering ved hjelp av en stasjonær mini-sentrifuge (se materialtabell) i 30 s ved RT (makshastighet 2000 x g), kast mediet og tilsett 1 ml 1x PBS pH 7,4 for å vaske cellepelleten.
  5. Pellet cellene igjen ved hjelp av en stasjonær mini-sentrifuge i 30 s ved RT og vask med PBS igjen.
  6. Pellet cellene og kast PBS. Lyse cellene i fenol og guanidin isotiocyanat som inneholder reagens (se tabell over materialer).
    MERK: Celler lyset i fenol og guanidinisotiocyanat inneholdende reagens kan oppbevares ved -80 °C i opptil 1 år. Celler kan lyses direkte i parabolen, avhengig av RNA-isolasjonsmetoden og reagensene som brukes. På grunn av det lave antallet celler i en tallerken, vil isolering av RNA ved hjelp av silikaspinnkolonner (se materialtabell) resultere i høyere utbytter av RNA.

5. Forbereder celler for immunfluorescerende farging

MERK: For en plate med 24 brønner er en EB per brønn tilstrekkelig.

  1. På dag 35 aspirerer du det brukte mediet og vasker cellene ved å tilsette 1 ml DPBS +/+ per brønn (for en brønn på en 24-brønns plate).
  2. Aspirer DPBS +/+ og tilsett 500 μL kald 4% paraformaldehyd (PFA, se Materialtabell) tilberedt i DPBS +/+ per brønn. Inkuber i 20 min på RT.
  3. Fjern 4 % PFA og vask cellene to ganger med DPBS+/+, som i trinn 5.1. Tilsett 1 ml DPBS+/+ og oppbevar cellene ved 4 °C til fargingen er ferdig.
    MERK: Det anbefales å gjøre immunfluorescerende farging innen 1 uke etter fiksering for å unngå celleløsning og tap av antigener. Avhengig av antistoffet og den cellulære plasseringen av målet, kan farging imidlertid gjøres på senere tidspunkter opptil 4 uker etter fiksering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversikt over 3D til 2D cerebellar differensiering
Cerebellar celler genereres fra iPSCs. Figur 1A viser den samlede arbeidsflyten og tillegg av hovedkomponenter for differensiering. På dag 0 lages EB-er ved å løfte iPSC-koloniene forsiktig (figur 1B) ved hjelp av en trukket glasspipette i CDM som inneholder SB431542 og Y-27632 og plasseres i ultralave festeplater. FGF2 legges til på dag 2. På dag 7 endres en tredjedel av mediet, og EB-dannelse observeres (figur 1C). På dag 14 blir forstørrede EBer (figur 1D) belagt på PLO / lamininbelagte retter i CDM supplert med Y-27632. På dag 15 erstattes mediet med CDM uten Y-27632. Cellene begynner å migrere utover fra EBs (figur 1E) langs den belagte overflaten. På dag 21 utføres en fullstendig mediumendring, og mediet byttes til CMM. Deretter skiftes mediet en gang i uken (eller oftere hvis mediet surgjøres raskt). Ved dag 35 er det et monolag av celler med nevronlignende morfologi og kompleksitet (figur 1F, G).

2D-celler uttrykker cerebellære cellemarkører
Celler høstes på dag 35 for RNA-isolasjon og immunfluorescerende merking. Uttrykket av gener som er kjent for å være tilstede under cerebellar utvikling, måles ved RT-qPCR (figur 2). Cellene uttrykker tidlige cerebellære stamcellemarkører som ATOH1 12,13 (rhombic lip, glutamatergic progenitors) og PTF1α14 (ventrikulær sone, GABAergic forfedre), samt Purkinje stamcellemarkører KIRREL215 og SKOR215. I tillegg til de tidlige utviklings cerebellære cellemarkørene, observeres også uttrykket av senere utviklingsgener, OTX2 og SIX3. Immunfluorescerende merking av celler viser positiv farging for cerebellarmarkørene EN2 og PTF1α (figur 3A,D), nevronmarkøren TUBB3 (figur 3G), samt for spredningsmarkøren Ki67 (figur 3J). Kjernefarging med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) viser cellekjerner (figur 3B,E,H,K). For ytterligere å validere denne protokollen ble iPSCs avledet fra pasienter med en nevropsykiatrisk lidelse brukt til å generere cerebellære celler og analysere cerebellarcellemarkøruttrykk på dag 35. RT-qPCR-dataene indikerer en lignende uttrykksprofil som kontroll-iPSC-ene (supplerende figur 1). I tillegg er uttrykket av aksonale veiledningsmolekyler som er relevante for cerebellær utvikling, tilstede både i kontrollceller og pasientavledede cerebellære celler (supplerende figur 2).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over protokollens tidslinje og representative bilder. (A) En skjematisk oversikt over cerebellar differensieringsprotokollen som viser typen kulturmedium, kosttilskuddene som legges til kulturmediet, dagene da en mediumendring er nødvendig (indikert med vertikale linjer) og overflatebelegget på kulturskålen. (B) Representative lyse feltbilder av iPSCer på dag 0 og differensierte celler som vil bli renset av før de lager EBs (vist i rød sirkel), (C) EBs på dag 7 og (D) dag 14, (E) dagen etter plating av EBs, og (F, G) modne celler på dag 35. Skala bar (BD): 1 mm; (E-G): 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ekspresjon av cerebellære cellemarkører i 2D cerebellarceller ved dag 35. RT-qPCR genuttrykksresultater på dag 35 for utvalgte gener som representerer forskjellige cerebellære utviklingsmarkører og celletyper, normalisert til GAPDH. -ΔCt-verdiene representerer GAPDH-Ct-verdier trukket fra target-Ct-verdier; Verdier nærmere null angir høyere uttrykk. En verdi under den avmerkede linjen representerer uttrykk under den påvisbare grensen. N = 2 iPSC-linjer, presenteres data som gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Immunfluorescerende merking av 2D lillehjerneceller ved dag 35. Cellene er festet med 4% PFA på dag 35 og er kjernefysisk farget med DAPI og immunmerket for (A) EN2 (grønn), (B) DAPI (blå), (C) EN2-DAPI fusjonert; (D) PTF1α (rød), (E) DAPI (blå), (F) PTF1α-DAPI slått sammen; (G) TUBB3 (grønn), (H) DAPI (blå), (I) TUBB3-DAPI slått sammen; og (J) Ki67 (rød), (K) DAPI (blå), (L) Ki67-DAPI slått sammen. Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Representative bilder av cerebellar differensiering ved bruk av iPSCs avledet fra pasienter diagnostisert med schizofreni. (A) iPSC-kolonier, (B) EBs på dag 7, (C) dag 14, (D) celler som vokser ut fra belagte EBs på PLO / laminin-belagt tallerken på dag 15, og (E) cerebellar celler på dag 35. (F) RT-qPCR-resultater for genuttrykk på dag 35 for cerebellære cellemarkører, normalisert til GAPDH. -ΔCt-verdiene representerer GAPDH-Ct-verdier trukket fra target-Ct-verdier; Verdier nærmere null angir høyere uttrykk. En verdi under den avmerkede linjen representerer uttrykk under den påvisbare grensen. N = 2 iPSC-linjer, presenteres data som gjennomsnitt ± SD. Skalalinje (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Genuttrykk av aksonale veiledningsmolekyler av 2D cerebellarceller ved dag 35. RT-qPCR genuttrykksresultater på dag 35 for utvalgte molekyler involvert i aksonveiledningssignalering, normalisert til GAPDH. Alle gener som er vist er kjent for å bli uttrykt i cerebellum bortsett fra PlxnB3, som har lavt uttrykk i cerebellum over utvikling. -ΔCt-verdiene representerer GAPDH-Ct-verdier trukket fra target-Ct-verdier; Verdier nærmere null angir høyere uttrykk. En verdi under den avmerkede linjen representerer uttrykk under den påvisbare grensen. N (kontroll) = 1, N (SCZ) = 1, og gjennomsnittet av eksperimenter som kjøres i tre eksemplarer, vises. Forkortelse: SCZ = schizofreni. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til å modellere menneskelig cerebellær utvikling in vitro er viktig for sykdomsmodellering, samt fremme forståelsen av normal hjerneutvikling. Mindre kompliserte og kostnadseffektive protokoller skaper flere muligheter for replikerbar datagenerering og bred implementering på tvers av flere vitenskapelige laboratorier. En cerebellar differensieringsprotokoll er beskrevet her ved hjelp av en modifisert metode for å generere EBs som ikke krever enzymer eller dissosiasjonsmidler, ved bruk av vekstfaktorer rapportert av Muguruma et al. 4 og en modifisert 2D monolayer cellevekstprotokoll som ligner på metoden fra Holmes et al. 5.

Den overordnede protokollen starter med å generere EBs fra iPSCs, etterfulgt av induksjon av cerebellar differensiering, og til slutt plating for 2D monolayer kultur. Under denne prosessen ble det observert en betydelig mengde celledød mellom dag 7-14. På grunn av dette celletapet anbefales det å starte med et stort antall EBs; for en 6-brønns plate med 2D-celler anbefales det å starte med minst seks plater (enten 35 mm eller 60 mm plater) av iPSC-er. Videre øker tilsetningen av Y-27632 på tidspunktet for plating EBs på PLO / laminin signifikant festingen av EBs til substratet. Det er viktig å sjekke mediet i kulturene periodisk visuelt. Hvis mediet blir gult (forsurende), anbefales det å bytte medium selv om det ikke er i fôringsskjemaet. Det totale antallet celler som fester seg vil variere fra eksperiment til eksperiment, noe som nødvendiggjør hyppigere eller mindre hyppig forfriskning av næringsstoffer i mediet.

RT-qPCR-resultatene viste at iPSC-ene differensierte seg til celler som representerte de tidlige stadiene av det utviklende lillehjernen. De foreliggende dataene antyder at det på dag 35 av differensiering er celler som uttrykker nevroncellens skjebnemarkør (TUBB3 16,17), glutamatergiske og GABAergiske stamcellemarkører (henholdsvis ATOH1 12,13 og PTF1α14), midthjerne-bakhjerne grensemarkører (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), isthmic arrangørmarkører (WNT1 18, FGF8 19), rhombic leppederivat cellemarkør (PAX6 18 ), og Purkinje celleprogenitormarkører (KIRREL215, SKOR220). Ekspresjon av den rhombiske leppemarkøren OTX221 ble også observert. Tidligere cerebellære organoidprotokoller ved bruk av hESCs har observert at FGF2-induksjon resulterer i GBX2-uttrykksceller, men svært få OTX2-positive celler, mens en lignende protokoll ved bruk av iPSCs viste identisk mRNA-ekspresjon av GBX2 og OTX2 i cerebellære organoider8. Imidlertid inneholder mus embryonale stamceller (mESC) -avledede cerebellære nevroner separate OTX2 og GBX2 positive celleklynger4, og det har vist seg at OTX2 uttrykkes gjennom mus 22 og human21,23 cerebellar utvikling. Den differensielle uttrykksprofilen til OTX2 mellom protokoller som bruker samme skjebnespesifikasjonsfaktorer, kan skyldes andre forskjeller mellom protokollene eller individuelle forskjeller mellom hESC-er og iPSC-er; Dette fortjener videre undersøkelser. SIX3-uttrykk ble også observert i kulturen på dag 35. SIX3 uttrykkes i det fremre nevrale røret under utvikling, og uttrykket i det menneskelige cerebellum forblir lavt gjennom utvikling og voksen alder23,24; Det uttrykkes imidlertid i neonatal og voksen mus cerebellum25. Dette antyder at det kan være en underpopulasjon av celler som skiller seg mot en fremre skjebne, eller de kan representere en underpopulasjon av cerebellære celler som uttrykker SIX3 under utvikling. Disse cellene kan utforskes videre.

Differensieringsprotokoller utvikles ofte ved hjelp av hESCs eller iPSCs fra friske personer, men det er viktig å bekrefte at disse protokollene kan brukes på pasientavledede iPSCs for å dissekere molekylære og cellulære endringer i sykdommen. For ytterligere å teste protokollen vår, sammen med våre kontroll iPSC-linjer, differensierte vi iPSC-linjer som ble omprogrammert fra fibroblaster hentet fra pasienter diagnostisert med schizofreni. Den tidligere litteraturen har vist at pasienter diagnostisert med schizofreni har funksjonelle og anatomiske cerebellære abnormiteter26,27,28. Disse endringene observeres hos voksne pasienter, men kan begynne under utviklingen og krever ytterligere undersøkelser. Samlet sett ble det observert at cerebellære celler fra schizofrenipasienter uttrykte de cerebellære markørene som ble testet på dag 35, og morfologisk ikke var forskjellige fra cerebellarcellene avledet fra kontroll-iPSCs (supplerende figur 1). Dette antyder at denne protokollen kan undersøke menneskelig cerebellær utvikling i sykdomssammenheng. Videre ble uttrykket av aksonale veiledningsmarkører på dag 35 også undersøkt, både i kontroll- og schizofrenicellelinjer, siden en av hovedkomponentene i utviklingen er aksonal pathfinding og neuronal tilkobling 29,30,31,32. Faktisk ble det på dag 35 verifisert aksonale veiledningsmolekyler som er indikert i cerebellær utvikling, inkludert semaforin-4C, plexin-B2 og neuropilin-1 (supplerende figur 2). Under utviklingen er plexin-B3-uttrykket lavt i det humane cerebellum23, og et lavere uttrykk av plexin-B3 ble også observert sammenlignet med de andre aksonale veiledningsmolekylene for differensieringene. Sammen med uttrykket av de cerebellære markørene, er dette en sterk indikasjon på at denne differensieringsprotokollen genererer cerebellære celler som uttrykker de riktige signalene for nevronforbindelse i den strukturen.

Det er viktig å merke seg at celletypene generert ved hjelp av denne FGF2 og insulininduserte cerebellære differensieringsprotokollen ikke ble identifisert via enkeltcelleanalyse. Nayler et al.8 publiserte nylig et datasett med enkeltcelleprofilering av cerebellære organoider generert ved hjelp av en lignende induksjonsprotokoll, og det forventes at fremtidig forskning i økende grad vil bruke encellede metoder for å løse disse spørsmålene. Cellene utover dag 35 ble heller ikke testet for ekspresjon eller morfologi. Uttrykket av cerebellære markører på senere tidspunkter og hvordan de endres over tid, vil gi mer innsikt i cellens modenhet. Samtidig dyrking av stamcelleavledede cerebellære celler med musens cerebellære granulatcelleforløpere4 eller humane føtale cerebellære skiver33 har vist seg å generere modne cerebellære celler, spesielt Purkinje-nevroner, som ofte er fraværende i cerebellære organoider. Spesielt viste en nylig studie at cerebellære organoider dissosiert på differensieringsdag 35 og belagt for 2D-vekst også gir opphav til modne cerebellære nevroner uten å trenge co-dyrking7. Disse applikasjonene tar sikte på å undersøke de senere stadiene av cerebellær utvikling og nevral modning i forhold til denne protokollen, som kan brukes til å undersøke de tidligere utviklingsstadiene. En annen interessant sammenligning kan oppstå ved å sammenligne dyrkede embryonale musecerebellære nevroner34 med iPSC-avledede humane cerebellære nevroner, som potensielt fremhever forskjeller i utvikling og skjebnespesifikasjon mellom de to artene.

Oppsummert kan den nåværende protokollen brukes til applikasjoner som krever in vitro 2D cerebellære celler generert fra iPSC-er. Denne protokollen inkluderer ikke komplekse trinn eller materialer, er kostnadseffektiv, og kan brukes som en modell for tidlig cerebellær utvikling for å undersøke genuttrykk, cellemorfologi og fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker Jenny Gringer Richards for hennes grundige arbeid med å validere kontrollfagene våre, som vi genererte kontroll-iPSC-ene fra. Dette arbeidet ble støttet av NIH T32 MH019113 (til D.A.M. og K.A.K.), Nellie Ball Trust (til T.H.W. og A.J.W.), NIH R01 MH111578 (til V.A.M. og J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (til A.J.W.), og Roy J. Carver Charitable Trust (til V.A.M., J.A.W., og A.J.W.). Figurene ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Tags

Nevrovitenskap Cerebellum utvikling 3D til 2D indusert pluripotent stamcelle differensiering sykdomsmodell
Modellering av menneskelig cerebellær utvikling <em>in vitro</em> i 2D-struktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A.,… More

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter