Summary
In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um den Prozess zu vereinfachen und die Herstellung von autologem konditioniertem Serum (ACS) kostengünstiger zu machen. Es werden keine speziellen Spritzen oder oberflächenbeschichteten Glasperlen benötigt. Darüber hinaus hat das modifizierte ACS (mACS) bei der Hornhautwundheilung von murinen Augen ex vivo Wettbewerbsvorteile gegenüber herkömmlichem autologem Serum.
Abstract
Topische Therapien aus menschlichem Blut waren in den letzten Jahrzehnten ein Segen für Kliniker. Autologes Serum (AS) und plättchenreiches Plasma (PRP) sind mit epitheliotropen Wachstumsfaktoren angereichert, die für die Wundheilung der Hornhaut unerlässlich sind. Im Gegensatz zu AS basiert PRP auf einem differentiellen Zentrifugationssystem, das mehr Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten liefert. Autologes konditioniertes Serum (ACS) konserviert nicht nur die Herstellung von AS und PRP, sondern konzentriert sich auch auf immunmodulierende Eigenschaften, die bei entzündlichen Erkrankungen wichtig sind.
Das Fehlen standardisierter Protokolle und hohe Präparationskosten sind Einschränkungen für die klinische Anwendung von ACS. Dieses Videoexperiment demonstriert ein Standardverfahren zur Herstellung von modifizierten autologen konditionierten Serums (mACS) Augentropfen. Zunächst wurde Glycerin als Stabilisator der Blutzellen während der hypoxischen Inkubation in Heparinspritzen gegeben. Um die Blutzellen zu aktivieren, wurde eine 4-stündige Inkubation bei 37 °C eingeleitet. Anschließend wurden die Blutproben bei 3.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Filtration des Überstandes durch einen 0,22 μm Filter waren die mACS-Augentropfen vollständig aufbereitet.
Eine vorläufige Erprobung der therapeutischen Wirkung von mACS zeigte, dass es bei der Wundheilung der Hornhaut in ex vivo Mäuseaugen Wettbewerbsvorteile gegenüber konventionellem AS haben könnte. Das in dieser Studie verwendete AS wurde nach veröffentlichten Studien und der klinischen Praxis in unserem Krankenhaus erstellt. Daher könnte die Wirksamkeit von mACS bei Erkrankungen der Augenoberfläche in zukünftigen Forschungen durch in vivo Tierstudien und klinische Studien evaluiert werden.
Introduction
Die therapeutische Wirkung von autologem Serum (AS) bei Erkrankungen des trockenen Auges wurde erstmals in den 1980er Jahren von Fox et al.1 beschrieben. Es wird angenommen, dass sowohl die schmierende Eigenschaft als auch die essentiellen epitheliotropen biochemischen Komponenten in AS, die natürliche Tränen nachahmen, die Proliferation von Hornhautepithelzellen begünstigen. Auf dieser Grundlage wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Studien durchgeführt. Zu den trophischen Komponenten gehören der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), Vitamin A, der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) und andere Zytokine. Interessanterweise ist das Serum reich an TGF-β und Vitamin A, von denen angenommen wird, dass sie eine zentrale Rolle bei der epidermalen Proliferation spielen 2,3,4,5. Darüber hinaus haben mehrere Studien bei der Behandlung von Patienten mit Erkrankungen der Augenoberfläche einige Vorteile von AS-Augentropfen in Bezug auf die von den Patienten berichteten Ergebnisse, andere objektive Parameter des trockenen Auges 6,7 und mikroskopische Befunde wie die Zelldichte8 gezeigt. Metaanalysestudien zeigten, dass es einige Vorteile bei der Verbesserung der Patientensyndrome durch die Behandlung mit AS-Augentropfen geben könnte, aber es fehlen noch Langzeitergebnisse und Beobachtungen 9,10.
Im Gegensatz zu AS wird plättchenreiches Plasma (PRP) durch Zugabe eines Antikoagulans während der Präparation mit weiterer differentieller Zentrifugation und chemischer Aktivierung der Blutplättchen gewonnen. Im Vergleich zu AS sind in PRP zahlreiche Chemikalien und Wachstumsfaktoren wie TGF-β, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und EGF enthalten. Es wurde auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche mit klinischem Nutzen bei der Linderung von Symptomen angewendet11.
Die Querverknüpfung zwischen Epitheldefekten und Entzündungen ist komplex. Insbesondere die Immunpathophysiologie ist ein weiteres wichtiges Thema bei Erkrankungen der Augenoberfläche. Es wird angenommen, dass proinflammatorische Zytokine wie IL-1β und IFN-γ zentrale Mediatoren in Entzündungskaskaden sind12. Auf diese Weise eröffnen sich neue Behandlungswege, die auf dem Verständnis des Immunmechanismus basieren. Strategien zur Stoppung dieses Entzündungsprozesses, einschließlich der Produktion von Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1Ra) und anderen entzündungshemmenden Zytokinen, könnten auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche eine wichtige Rolle spielen13,14,15.
Seit 1998 wird Orthokin, ein kommerzialisiertes autologes konditioniertes Serum (ACS), klinisch bei orthopädischen Patienten eingesetzt, die an Arthrose (OA), rheumatoider Arthritis (RA) und Wirbelsäulenerkrankungen leiden13. Im Vergleich zu AS und PRP sind die Behandlung mit chemisch beschichteten Glasperlen und die hypoxische Inkubation zur Aktivierung von Monozyten die Besonderheiten von ACS16. Theoretisch können mehr entzündungshemmende Faktoren ausgeschüttet werden, indem den Zellen Überlebensstress hinzugefügt wird, was zu einer höheren Konzentration essentieller immunmodulierender Komponenten, einschließlich IL-1Ra, führt. Der verbesserte therapeutische Nutzen von ACS bei Arthrose im Vergleich zu AS wurde ebenfalls berichtet17. Erkrankungen der Augenoberfläche haben in mancher Hinsicht einen ähnlichen Immunhintergrund wie orthopädische Entzündungserkrankungen. Aufgrund der erfolgreichen Ergebnisse der Therapie mit menschlichem Blut im orthopädischen Bereich könnte ACS daher Vorteile gegenüber konventionellen Behandlungen in der klinischen Praxis durch epitheliotrope und immunmodulierende Eigenschaften haben. Obwohl ACS bei orthopädisch-entzündlichen Erkrankungen weit verbreitet ist, müssen seine klinischen Anwendungen in der Augenheilkunde noch erforscht werden, was durch die hohen Kosten, die mangelnde Literaturunterstützung und die mangelnde Standardisierung des Präparationsprozesses behindert werden kann, was zu unterschiedlichen Leistungen führt.
In diesem Videoartikel wurde eine neuartige, kostengünstige und bequeme Methode zur Erzeugung des modifizierten ACS (mACS) oder wachstumsfaktorreichen Plasmas (PRGF) demonstriert, wodurch eine Augentropfenlösung mit einem vergleichbaren praktischen Wert wie kommerzialisierte ACS hergestellt wird. Die Schlüsselideen, Antikoagulanzien hinzuzufügen und die Blutzellen durch Stressinkubation zur Sekretion von entzündungshemmenden Zytokinen anzuregen, wurden beibehalten, aber im Gegensatz zu den chemisch induzierten Methoden, wie z. B. solchen, die auf CrSO 4-beschichteten Glasperlen und kommerziellen Kits basieren, wird der kritische Stressstatus bei dieser Methode physikalisch durch hypoxische Inkubation induziert. Darüber hinaus wurde Glycerin hinzugefügt, um zusätzliche Vorteile zu bieten, darunter eine Erhöhung der Stabilität der Membran der Blutzellen, die Aufrechterhaltung eines angemessenen osmotischen extrazellulären Flüssigkeitsdrucks18 und eine geeignete Nährstoffquelle unter hypoxischen Bedingungen, die eine Überlastung der Zellen vermeiden.
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Protocol
Die Recherche wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien zu Beginn des Protokollabschnitts durchgeführt. Alle Protokolle und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board der Chang Gung Medical Foundation geprüft und genehmigt. Alle Probanden wurden über die Art dieser Studie informiert und unterschrieben vor der Aufnahme eine Einverständniserklärung. Die für den gesamten Versuchsablauf benötigten Verbrauchsmaterialien sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 sowie in der Materialtabelle dargestellt.
1. Vorbereitung der Materialien, die für die Herstellung von mACS-Augentropfen benötigt werden
- Bereiten Sie 250 ml 10%ige Glycerinlösung vor und halten Sie ein 21-g-Infusionsset mit Schmetterlingsflügeln, eine 3-ml-Spritze ohne Nadel und sechs 10-ml-Vacutainer-Röhrchen mit Heparin 158 USP-Einheiten bereit (Abbildung 1).
- Verbinden Sie die 21 g Blutentnahmenadel mit der 3-ml-Spritze und entnehmen Sie 3 ml 10%ige Glycerinlösung in die vorbereitete Spritze.
Anmerkungen: Alle Materialien müssen sterilisiert werden, bevor die Nadel eingeführt wird. - Verteilen Sie die 10%ige Glycerinlösung nacheinander in den Vacutainer-Röhrchen, wobei jeweils ca. 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung enthalten sind (Abbildung 3A).
Anmerkungen: Aufgrund des Unterdrucks im Reagenzglas muss die Nadel sofort nach dem Einstecken herauskommen, um 3 ml Glycerinlösung gleichmäßig auf die sechs Reagenzgläser zu verteilen. - Sterilisieren Sie die Haut des Patienten mit sterilen Wattestäbchen mit 75% Alkohol. Punktieren Sie die oberflächliche Vene der oberen Gliedmaßen des Patienten mit der 18-G-Blutentnahmenadel. Entnahme von insgesamt 60-70 ml venösem Blut aus der oberflächlichen Vene.
2. Vorbereitung für mACS Augentropfen
- Injizieren Sie nacheinander 10 ml des entnommenen venösen Blutes in jedes der sechs Vacutainer-Röhrchen (Abbildung 3B).
Anmerkungen: Dieser Schritt beruht auf dem Unterdruck des Vakuums, um die Röhrchen zu füllen. Um eine Zerstörung der Blutzellen und eine Hämolyse zu vermeiden, üben Sie keinen Überdruck aus. - Legen Sie die sechs Vacutainer-Röhrchen mit einer konstanten Temperatur von 37 °C für 4 h in den Inkubator (Abbildung 3C).
Anmerkungen: Der hypoxische Status wird durch den verbleibenden Unterdruck in einem verschlossenen Röhrchen, das Glycerin aufgenommen hat, aufrechterhalten und stabilisiert. - Nehmen Sie die Röhrchen nach 4 h aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 3.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt die Materialien für die mACS-Extraktion vor, einschließlich der sterilisierten Augentropfenflaschen, einer 3-ml-Spritze mit der Nadel, eines 0,22-μm-Filters, einer 18-g-Nadel und eines Paares steriler Handschuhe (Abbildung 2).
Anmerkungen: Der Operationstisch sollte mit 75%igem Alkohol abgewischt werden, um eine aseptische Umgebung zu gewährleisten. Der Überstand ist nach der Zentrifugation bereits ein Halbzeug von mACS. - Legen Sie die sechs Röhrchen auf das Röhrchengestell und öffnen Sie die Kappen nach vollständiger Zentrifugation (Abbildung 3D).
Anmerkungen: Sterilität ist in diesem Schritt nicht erforderlich. - Ziehen Sie sterile Handschuhe an und ziehen Sie das mACS nacheinander mit einer 3-ml-Spritze und einer 18-G-Nadel heraus.
Anmerkungen: Achten Sie darauf, während dieses Schritts nicht die untere Blutkörperchenschicht zu zeichnen (Abbildung 3E). - Ziehen Sie die Nadel heraus, schließen Sie sie an den 0,22-μm-Filter an und verbinden Sie die 23-G-, 1,5-Zoll-Blutentnahmenadel mit der ursprünglichen 3-ml-Spritze mit dem Auslass unten (Abbildung 3F).
- Schieben Sie die Nadel vorsichtig durch den 0,22 μm Filter in die vorbereiteten sterilen Augentropfenflaschen (Abbildung 3G).
- Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle mACS gefiltert und in Augentropfenflaschen aufbewahrt wurden (Abbildung 3H).
- Lagern Sie die mACS-Augentropfen bei 4 °C zur sofortigen Anwendung. Zur Langzeitkonservierung bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Nicht länger als 2 Wochen bei 4 °C oder länger als 3 Monate bei -20 °Caufbewahren 9,19.
3. Ex vivo Wundheilungsmodell des murinen Hornhautepithels
HINWEIS: Das folgende ex vivo Tiermodell basiert auf früheren Erfahrungen von Hung et al. zu mechanischen Verletzungen des Hornhautepithels20. Die folgenden Schritte sollten unter dem Mikroskop durchgeführt werden, um eine gut umschriebene und konsistente Hornhautepithelwunde zu erzeugen.
- Betäuben Sie die C57BL/6-Mäuse mit 3%-4% Isofluran. Drücke die Hautbiopsie-Stanze über die zentrale Hornhaut der Maus und lasse einen flachen Kreis auf dem Epithel als gleichmäßigen Wundrand zurück.
Anmerkungen: Seien Sie vorsichtig, um einen Riss des Augapfels zu vermeiden. - Debride des Hornhautepithels innerhalb des bestätigten Bereichs bis zur Bowman-Schicht mit einem Hornhautrostentferner, der mit einem 0,5-mm-Grat ausgestattet ist.
- Um das ex vivo Tiermodell der mechanischen Hornhautwunde zu erstellen, entnehmen Sie den Augapfel und bereiten Sie die Kultur gut vor.
- Schläfern Sie die Mäuse zuerst ein; Drücken Sie dann sanft auf die oberen und unteren Augenhöhlenränder der Mäuse, führen Sie die Spitze der Pinzette über den retrobulbären Raum und den Augapfel heraus und halten Sie ihn an der Pinzette fest.
- Schneiden Sie den Sehnerv und das periorbitale Weichgewebe mit einer Hornhautschere durch, um den Augapfel perfekt zu isolieren.
- Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit geschmolzenem Wachs vor. Erzeugen Sie schnell ein rundes Loch mit den Spitzen der Pinzette und warten Sie dann, bis es erstarrt ist.
- Bereiten Sie die zu testenden Medien vor: 0,5 % mACS, 0,5 % AS zum Vergleich, normale Kochsalzlösung als Negativkontrolle und modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco.
HINWEIS: mACS wird mit dem oben genannten Protokoll erhalten. - Für die Ex-vivo-Kultur legen Sie den geernteten Augapfel auf die vorbereitete 96-Well-Platte. Geben Sie 200 μl jedes Mediums in die 96-Well-Platte.
- Legen Sie die 96-Well-Kulturplatte bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator. Stellen Sie sicher, dass das Nährmedium alle 24 Stunden gewechselt wird.
- Um den sequentiellen Wundheilungseffekt zu bestätigen, wird der epitheliale Wundbereich alle 8 h durch Fluoresceinfärbung unter dem Mikroskop überwacht.
- Lösen Sie das Fluorescein auf dem Fluoresceinpapier mit normaler Kochsalzlösung auf.
- Lassen Sie den Fluoresceinfarbstoff auf die zentrale Hornhaut der Maus tropfen und beobachten und dokumentieren Sie ihn unter dem Mikroskop. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 4 dargestellt.
HINWEIS: Ein Tropfen (ca. 0,05 ml) Fluoresceinfarbstoff reicht für die Beobachtung aus.
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Representative Results
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die für das Experiment benötigten Materialien, und Abbildung 3 zeigt die aufeinanderfolgenden Schritte und die erfolgreichen Zwischenprodukte während der Herstellung von mACS. Zunächst wurden 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung in jedes sterile 10-ml-Reagenzglas gegeben (Abbildung 3A). Dann wurden dem Patienten 60-70 ml venöses Blut entnommen und 10 ml Blut in jedes Röhrchen injiziert (Abbildung 3B). Das Blut des Patienten muss vor dem Präparat gründlichen und regelmäßigen Laboruntersuchungen unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die Qualität des Blutes dem Standard entspricht. Das häufigste minderwertige Blutprodukt ist auf Fettstoffwechselstörungen zurückzuführen, die nach dem Zentrifugieren zu einer trüben oberen Serumschicht führen, die schwer zu entfernen ist. Die weitere Herstellung von Augentropfen kann nicht fortgesetzt werden (Abbildung 5A).
Anschließend wird das verschlossene Reagenzglas für 4 h in einen Inkubator bei 37 °C gestellt (Abbildung 3C). Nach Inkubation und Zentrifugation konnte die Probe in eine obere Schicht, die das Vorprodukt von mACS enthielt, und eine untere Blutkörperchenschicht getrennt werden (Abbildung 3D). Anschließend wurde die Flüssigkeit der oberen Schicht aufgefangen. Aseptische Techniken sind von nun an unerlässlich. Da das Serum eine sehr nahrhafte Brutumgebung für Mikroorganismen ist, muss jede Oberfläche, die mit der Nadel in Berührung kommt, zuerst mit 75%igem Alkohol desinfiziert und während des Prozesses sterile Handschuhe verwendet werden. Wichtig ist, dass eine Störung der Blutzellen aus der unteren Schicht vermieden werden sollte, wenn der Überstand entfernt wird (Abbildung 3E).
Bei diesem Schritt wird erwartet, dass der Überstand klar oder blassgelb ist. Wenn jedoch eine leichte rote Farbe zu sehen ist, kann eine Hämolyse stattgefunden haben, und das Präparat ist möglicherweise nicht für die nachfolgenden Schritte geeignet (Abbildung 5B). Das gesammelte Serum könnte erneut zentrifugiert werden, um sicherzustellen, dass der Überstand frei von roten Blutkörperchen ist. Das Serum wurde durch einen 0,22 μm Filter in eine sterile Augentropfenflasche filtriert (Abbildungen 3F,G). Das Endprodukt, die mACS-Augentropfen, wurde dann je nach Verwendungszweck so schnell wie möglich gekühlt oder eingefroren (Abbildung 3H). Die Augentropfen konnten aufgrund ihres Reichtums an labilen Nährstoffen und des Fehlens von Konservierungsstoffen nicht allzu lange gelagert werden.
Im Ex-vivo-Oberflächenheilungsmodell zeigte die mACS-Augentropfen im Vergleich zur AS-Augentropfen ein besseres Ergebnis bei der Wundheilung der Hornhaut. Die Entnahme der Augäpfel von C57BL/6-Mäusen erfolgte, nachdem eine konzentrische Hornhautwunde durch physikalischen Abrieb unter dem Mikroskop erzeugt wurde. Anschließend wurden die geopferten Mäuseaugen in vier verschiedenen Medien kultiviert, darunter reine normale Kochsalzlösung, DMEM, 0,5 % AS und 0,5 % mACS.
Das hier verwendete AS-Medium wurde auf der Grundlage der Literatur21 und der klinischen Praxis im Chang Gung Memorial Hospital Linkou erstellt. Venöses Blut, insgesamt 40 ml, wurde nach der Hautsterilisation von Freiwilligen in Vacutainer-Röhrchen entnommen. Den Röhrchen wurde kein Gerinnungshemmer zugesetzt. Das Blut wurde dann 30 Minuten bei Raumtemperatur gelagert, um eine vollständige Gerinnung zu gewährleisten, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.500 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation besetzte das reine AS die obere Schicht der Röhrchen, die in diesem ex vivo Tiermodell mit BSS (sterile Spüllösung) auf 0,5 % verdünnt wurde.
Hornhautwunden wurden nacheinander zu sechs verschiedenen Zeitpunkten beobachtet, nämlich 0, 8, 16, 24, 32 und 48 h. Die vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass die Hornhautwunden nach 16 h unter dem 0,5%igen mACS-Augentropfen schneller heilten als die anderen Gruppen. Nach 24 h zeigten die 0,5%-AS- und DMEM-Gruppen vergleichbare therapeutische Effekte wie die 0,5%-mACS-Augentropfen. Die Heilung der Hornhautwunden, die fast vollständig genesen war, wurde nach 32 h beobachtet, mit Ausnahme der normalen Kochsalzgruppe (Abbildung 4).
Abbildung 1: Materialien, die für die Zugabe von 10%iger Glycerinlösung in die Röhrchen benötigt werden . (A) 21 g Infusionsset mit Schmetterlingsflügeln. (B) 250 ml 10%ige Glycerinlösung. (C) Sechs 10-ml-Vacutainer-Röhrchen mit Heparin 158 USP-Einheiten. (D) 3,0-ml-Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Materialien für die Extraktion und Filtration des Überstands der Blutprobe . (A) Ein 0,22-μm-Filter. (B) Eine sterilisierte 5-ml-Augentropfenflasche. (C) Ein Paar sterile Handschuhe. (D) Eine 3-ml-Spritze mit der 23-g-Nadel. (E) Eine 20-ml-Spritze. (F) 18 g Nadeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verfahren zur Blutzentrifugation und Aufbereitung zur Herstellung modifizierter autologer konditionierter Serum-Augentropfen . (A) 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung wurden in jedes Reagenzglas gegeben. (B) Die dem Patienten entnommene Blutprobe wurde gleichmäßig auf sechs Reagenzgläser aufgeteilt (nur eines im Bild zu sehen). (C) Aussehen des Reagenzglases, nachdem es 4 Stunden lang in einen 37 °C-Inkubator gegeben wurde. (D) Die Serum- und Blutzellenschichten nach der Zentrifugation. (E) Der Rückstand nach dem Absaugen des Überstands. Man sollte darauf achten, dass die untere Blutkörperchenschicht nicht abgesaugt wird. (F) Der Überstand wird in der 3-ml-Spritze aufgefangen und ein 0,22-μm-Filter und eine 23-g-Nadel werden darunter eingeführt. (G) Die Nadel wird vorsichtig in die sterile Augentropfenflasche geschoben. (H) Endprodukt der modifizierten ACS-Augentropfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Sequenzielle Veränderungen von Hornhautwunden (grüne Bereiche in den Abbildungen nach Fluoresceinfärbung) in murinen Augen in vier verschiedenen Nährmedien über die Zeit. In der Kochsalzlösung wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet, während in den DMEM-, 0,5 % AS- und 0,5 % mACS-Gruppen eine Wundheilung (Pfeile) über die Zeit beobachtet wurde. In der 0,5%-mACS-Gruppe war die Wundheilung (Pfeile) nach 16 h signifikant vollständiger als bei den mit AS und DMEM behandelten Patienten. Nach 24 h zeigten die DMEM-, 0,5% mACS- und 0,5% AS-Gruppen weitere Heilungseffekte (Pfeile), insbesondere in der mACS-Gruppe. Eine nahezu vollständige Erholung wurde nach 32 h für alle Gruppen mit Ausnahme der Kochsalzgruppe beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispiele für schlechte Blutprodukte nach der Zentrifugation . (A) Dyslipidämie. Die häufigsten fehlerhaften Produkte sind auf Fettleibigkeit oder Diabetes mellitus zurückzuführen, da das obere Serum viel Fett und Cholesterin enthält. (B) Hämolyse. Dies ist auch ein häufiges suboptimales Produkt. Der Hauptgrund kann auf die Verwendung von Nadeln mit kleinem Durchmesser für die Blutentnahme oder die Verwendung unangemessener äußerer Gewalt bei der Injektion von Blutprodukten zurückgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Herstellung von mACS beschrieben und der Nutzen von mACS-Augentropfen bei der Wundheilung von Tiermodellen weiter aufgezeigt. Die entscheidende Modifikation dieses mACS-Protokolls ist die Zugabe von ca. 0,5 ml 10%iger Glycerinlösung in jedes Reagenzglas, wodurch während der 4-stündigen Inkubation bei 37 °C geeignete hypoxische Bedingungen geschaffen werden. Diese Einstellung versorgt den AS mit angemessenem Stress und veranlasst die Zellen, die notwendigen Wachstumsfaktoren abzusondern, die die Wundheilung unterstützen. Der 0,22-μm-Filter kann dazu beitragen, die makromolekularen Proteine, Blutzellen und Verunreinigungen zu eliminieren, wodurch das Endprodukt rein und weniger haftend wird.
Das Blut wird 4 h bei 37 °C inkubiert und anschließend zentrifugiert und filtriert. Strenges Augenmerk auf Sterilität bei der Zubereitung und Lagerung der Endprodukte bei der richtigen Temperatur ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Der hohe Nährstoffgehalt in den fertigen Serumprodukten ist ein hervorragendes Nährmedium für die Bakterien. So kann eine unsachgemäße Lagerung oder Verunreinigung während der Zubereitung die Augentropfen verderben. Kontaminiertes mACS kann Krankheiten wie Bindehautentzündung oder infektiöse Keratitis verursachen.
Auch die Qualität des Blutes des Patienten ist wichtig; Daher sind vor der Herstellung von mACS Labortests erforderlich, um die Sicherheit von Blutprodukten zu gewährleisten. Während der Entnahme und bei der Operation der Blutproben des Patienten sollten sich die Bediener der Hämolyse bewusst sein. Jeder Druck während der Zubereitung kann leicht zu einer Hämolyse führen. Daher sollte die Spritze während der Blutentnahme langsam gezogen und gedrückt werden. Hypoxie sollte auch kontrolliert werden, um hohe Konzentrationen von Wachstumsfaktoren und entzündungshemmenden Zytokinen zu erhalten. Basierend auf den Erfahrungen und bereits veröffentlichten Studien22,23 ist die Anwendung einer 4-stündigen hypoxischen Inkubation das ultimative Setting. Glycerin könnte der Zelle aufgrund des Stabilisierungseffekts und des richtigen osmotischen extrazellulären Flüssigkeitsdrucks, den es bieten kann, einen geeigneteren hypoxischen Stress bieten18. Die optimale Konzentration von Glycerin und wie sie mit der Zytokinkonzentration korreliert, muss jedoch noch überprüft werden. In Zukunft werden In-vivo-Tierstudien zur Wundheilung und eine größere randomisierte kontrollierte Studie erforderlich sein, um die Wirksamkeit zu bestätigen.
Bisher konzentrierte sich die Forschung hauptsächlich auf das Auftragen von Serumprodukten auf Augenoberflächenerkrankungen unter Verwendung traditioneller AS und der aufkommenden PRP-Augentropfen24,25,26,27. Herkömmliches AS ohne Antikoagulans und ohne Filter während der Präparation ist in seiner reinen Form bernsteinfarben, bereitet den Patienten jedoch aufgrund seiner Adhäsivität oft Unbehagen. Daher wird in der Regel verdünntes AS (20%-50%) verwendet, das die Konzentrationen der Nährstoffe senkt. PRP ist jedoch weniger haftend und wird in der Regel in seiner reinen Form (100%) verwendet. Neuere Literaturberichte weisen meist darauf hin, dass PRP eine bessere entzündungshemmende und wundheilende Wirkung als AS hat, vor allem aufgrund seines reichen Gehalts an entzündungshemmenden Zytokinen, Wachstumsfaktoren und seiner Fähigkeit, IL-1β-induzierte Entzündungen abzuschwächen16,26. Eine randomisierte kontrollierte Studie von García-Conca et al. hat bereits ergeben, dass die Anwendung von PRP bei schweren oder mittelschweren hyposekretorischen Erkrankungen des trockenen Auges zufriedenstellende Ergebnisse zeigt28. Obwohl ACS als Verbesserung gegenüber AS selten bei entzündlichen und degenerativen Erkrankungen der Augenoberfläche berichtet wurde, wurde es in der Orthopädie häufig zur Behandlung von degenerativer Arthritis und Wundheilung eingesetzt 29,30,31. Das gebräuchlichste ACS wurde als kommerzielles Kit hergestellt und patentiert13,32. mACS wurde nach Anpassung des Prozesses der ACS-Präparation entwickelt, um die Stärken von ACS und PRP zu kombinieren. mACS kann kostengünstiger hergestellt werden, da keine speziellen Reagenzien benötigt werden, wie z. B. CrSO 4-beschichtete Glasperlen oder patentierte Kits, die sowohl für die Herstellung von ACS als auch von PRP benötigt werden.
Abgesehen von den wirtschaftlichen Bedenken lieferten die mACS-Augentropfen auch in einem Ex-vivo-Experiment zufriedenstellende vorläufige Ergebnisse und könnten eine revolutionäre Alternative zu den aktuellen, aufkommenden PRP-Augentropfen sein. Bemerkenswert ist, dass ACS aufgrund seiner entzündungshemmenden Wirkung und verbesserten endogenen Reparaturmechanismen sowohl qualitativ als auch quantitativ bessere Ergebnisse als die meisten etablierten Behandlungen bei entzündlichen Gelenkerkrankungen gezeigt hat17. Obwohl es bisher keine Literaturbelege für therapeutische Effekte von ACS in der Ophthalmologie gibt, ist es aufgrund seines entzündungshemmenden Mechanismus und des Erfolgs in der Orthopädie vernünftig, von einem Potenzial für die Anwendung bei Patienten mit Hornhautepitheldefekten auszugehen33. In unserer ex vivo Studie wurde nur AS mit dem mACS verglichen; PRP und ACS, die über kommerzielle Kits hergestellt werden, können jedoch auch verglichen werden. Zukünftige Forschungen zur Analyse der Serumspiegel von entzündungshemmenden Zytokinen und Wachstumsfaktoren bei mACS wären nützlich, um die Ähnlichkeit mit ACS oder PRP und die potenzielle Überlegenheit gegenüber AS zu bestätigen.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Ya-Lan Chien und Chia-Ying Lee für die hervorragende technische Unterstützung und bei der Firma OnLine English für die sprachliche Ausgabe. Diese Studie wurde zum Teil durch das Chang Gung Medical Research Project finanziert (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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