Summary
यह आलेख प्रक्रिया को सरल बनाने और ऑटोलॉगस वातानुकूलित सीरम (एसीएस) की तैयारी को कम खर्चीला बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। किसी विशेष सिरिंज या सतह-लेपित ग्लास मोती की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, संशोधित एसीएस (एमएसीएस) में म्यूरिन आंखों के कॉर्नियल घाव भरने में पारंपरिक ऑटोलॉगस सीरम पर प्रतिस्पर्धात्मक लाभ हैं।
Abstract
मानव रक्त-व्युत्पन्न सामयिक उपचार हाल के दशकों में चिकित्सकों के लिए एक वरदान रहे हैं। ऑटोलॉगस सीरम (एएस) और प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) एपिथेलियोट्रोपिक विकास कारकों में समृद्ध होते हैं जो कॉर्नियल घाव भरने में आवश्यक होते हैं। एएस के विपरीत, पीआरपी एक अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर आधारित है, जो अधिक प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक पैदा करता है। ऑटोलॉगस कंडीशन्ड सीरम (एसीएस) न केवल एएस और पीआरपी की तैयारी को संरक्षित करता है, बल्कि प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटिंग गुणों पर भी ध्यान केंद्रित करता है, जो भड़काऊ रोगों में महत्वपूर्ण हैं।
मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी और उच्च तैयारी लागत एसीएस के नैदानिक अनुप्रयोग के लिए सीमाएं हैं। यह वीडियो प्रयोग संशोधित ऑटोलॉगस कंडीशंड सीरम (एमएसीएस) आई ड्रॉप तैयार करने के लिए एक मानक संचालन प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है। सबसे पहले, ग्लिसरॉल को हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन के दौरान रक्त कोशिका स्टेबलाइजर के रूप में हेपरिन सिरिंज में जोड़ा गया था। रक्त कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे इनक्यूबेशन शुरू किया गया था। फिर, रक्त के नमूनों को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला के निस्पंदन के बाद, एमएसीएस आई ड्रॉप पूरी तरह से तैयार थे।
एमएसीएस के चिकित्सीय प्रभाव के एक अस्थायी प्रयास से पता चला है कि पूर्व विवो माउस आंखों में कॉर्नियल घाव भरने में पारंपरिक एएस पर प्रतिस्पर्धात्मक लाभ हो सकते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एएस प्रकाशित अध्ययनों और हमारे अस्पताल में नैदानिक अभ्यास के अनुसार तैयार किया गया था। इसलिए, ओकुलर सतह रोगों पर एमएसीएस की प्रभावकारिता का मूल्यांकन विवो पशु अध्ययन और नैदानिक परीक्षणों के माध्यम से भविष्य के शोध में किया जा सकता है।
Introduction
सूखी आंखों की बीमारियों में ऑटोलॉगस सीरम (एएस) के चिकित्सीय प्रभाव ों को पहली बार 1980 के दशक में फॉक्स एट अल.1 द्वारा रिपोर्ट किया गया था। यह माना जाता है कि प्राकृतिक आंसुओं की नकल करते हुए एएस में स्नेहन गुण और आवश्यक एपिथेलियोट्रोपिक जैव रासायनिक घटक दोनों, कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं के प्रसार को लाभ पहुंचाते हैं। पिछले दशकों में, इस आधार पर कई अध्ययन किए गए हैं। ट्रॉफिक घटकों में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), विटामिन ए, ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (टीजीएफ-β), और अन्य साइटोकिन्स शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि सीरम टीजीएफ-β और विटामिन ए में समृद्ध है, जो माना जाता है कि एपिडर्मल प्रसार 2,3,4,5 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, ओकुलर सतह रोगों वाले रोगियों का इलाज करते समय, कई अध्ययनों ने रोगी-रिपोर्ट किए गए परिणामों में एएस आई ड्रॉप के कुछ फायदे दिखाए हैं, अन्य उद्देश्य शुष्क आंख पैरामीटर6,7, और सूक्ष्म निष्कर्ष जैसे सेल घनत्व8। मेटा-विश्लेषण अध्ययनों से पता चला है कि एएस आई ड्रॉप उपचार के साथ रोगी के सिंड्रोम में सुधार करने में कुछ लाभ हो सकते हैं, लेकिन दीर्घकालिक परिणाम और अवलोकन अभी भी 9,10 की कमी है।
एएस के विपरीत, प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) तैयारी के दौरान एक थक्कारोधी जोड़ने से प्राप्त होता है, जिसमें प्लेटलेट्स के आगे अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और रासायनिक सक्रियण होता है। एएस की तुलना में, कई रसायन और विकास कारक, जैसे टीजीएफ-β, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ), और ईजीएफ, पीआरपी में मौजूद हैं। यह लक्षण राहत11 में नैदानिक लाभ के साथ ओकुलर सतह रोगों पर भी लागू किया गया है।
उपकला दोष और सूजन के बीच क्रॉस-लिंक जटिल है। विशेष रूप से, इम्यूनोपैथोफिज़ियोलॉजी ओकुलर सतह रोगों में एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है। प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स, जैसे आईएल -1 और आईएफएन -γ, को भड़काऊ कैस्केड12 में महत्वपूर्ण मध्यस्थ माना जाता है। इस प्रकार प्रतिरक्षा तंत्र को समझने के आधार पर उपचार के नए रास्ते खुल जाते हैं। इंटरल्यूकिन -1 रिसेप्टर विरोधी (आईएल -1 आरए) और अन्य विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन सहित इस भड़काऊ प्रक्रिया को रोकने की रणनीतियां, ओकुलर सतह रोगों 13,14,15 में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं।
1998 के बाद से, ऑर्थोकिन, एक व्यावसायिक ऑटोलॉगस वातानुकूलित सीरम (एसीएस), का उपयोग ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए), रूमेटोइड गठिया (आरए), और रीढ़ की हड्डीके विकारों से पीड़ित आर्थोपेडिक रोगियों में चिकित्सकीय रूप से किया गया है। एएस और पीआरपी की तुलना में, मोनोसाइट्स को सक्रिय करने के लिए रासायनिक रूप से लेपित ग्लास बीड्स और हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन के साथ उपचार एसीएस16 की विशिष्ट विशेषताएं हैं। सैद्धांतिक रूप से, कोशिकाओं में जीवित रहने के तनाव को जोड़कर अधिक विरोधी भड़काऊ कारकों को स्रावित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आईएल -1 आरए सहित आवश्यक प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटिंग घटकों की उच्च एकाग्रता होती है। एएस की तुलना में ओए में एसीएस के बेहतर चिकित्सीय लाभभी बताए गए हैं। ओकुलर सतह रोग कुछ मामलों में आर्थोपेडिक सूजन रोगों के साथ समान प्रतिरक्षा पृष्ठभूमि साझा करते हैं। इसलिए, आर्थोपेडिक क्षेत्र में मानव रक्त-व्युत्पन्न चिकित्सा के सफल परिणामों के आधार पर, एसीएस को एपिथेलियोट्रोपिक और प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटिंग गुणों द्वारा नैदानिक अभ्यास में पारंपरिक उपचार ों पर फायदे हो सकते हैं। यद्यपि एसीएस का व्यापक रूप से आर्थोपेडिक सूजन रोगों में उपयोग किया गया है, नेत्र विज्ञान में इसके नैदानिक अनुप्रयोगों का अभी भी पता लगाने की आवश्यकता है, जो इसकी उच्च लागत, साहित्य समर्थन की कमी और तैयारी प्रक्रिया के मानकीकरण की कमी से बाधित हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप विविध प्रदर्शन हो सकते हैं।
इस वीडियो लेख में, संशोधित एसीएस (एमएसीएस), या विकास कारकों (पीआरजीएफ) में समृद्ध प्लाज्मा उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास, लागत प्रभावी और सुविधाजनक विधि का प्रदर्शन किया गया था, जो व्यावसायिक एसीएस के लिए तुलनीय व्यावहारिक मूल्य के साथ एक आई ड्रॉप समाधान का उत्पादन करता है। एंटीकोआगुलंट्स को जोड़ने और तनावग्रस्त इनक्यूबेशन द्वारा विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स को स्रावित करने के लिए रक्त कोशिकाओं को ट्रिगर करने के प्रमुख विचारों को बरकरार रखा गया था, लेकिन रासायनिक रूप से प्रेरित तरीकों के विपरीत, जैसे कि सीआरएसओ 4-लेपित ग्लास बीड्स और वाणिज्यिक किट पर आधारित, महत्वपूर्ण तनाव की स्थिति शारीरिक रूप से इस विधि में हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन द्वारा प्रेरित होती है। इसके अलावा, ग्लिसरॉल को अतिरिक्त लाभ प्रदान करने के लिए जोड़ा गया था, जिसमें रक्त कोशिकाओं की झिल्ली की स्थिरता में वृद्धि, एक उचित आसमाटिक बाह्य तरल दबाव18 का रखरखाव, और हाइपोक्सिक स्थितियों में पोषक तत्वों का एक उपयुक्त स्रोत शामिल है जो कोशिकाओं को ओवरस्ट्रेस करने से बचते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रोटोकॉल अनुभाग की शुरुआत में संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में अनुसंधान किया गया था। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सभी प्रोटोकॉल और प्रक्रियाएं की गईं और चांग गुंग मेडिकल फाउंडेशन संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा समीक्षा और अनुमोदित किया गया। सभी स्वयंसेवकों को इस अध्ययन की प्रकृति के बारे में सूचित किया गया था और उनके शामिल होने से पहले एक सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए गए थे। संपूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों को चित्रा 1 और चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है, साथ ही सामग्री की तालिका में भी।
1. एमएसीएस आई ड्रॉप का उत्पादन करने के लिए आवश्यक सामग्री की तैयारी
- 10% ग्लिसरॉल समाधान के 250 एमएल तैयार करें और 21 ग्राम तितली-पंख वाले जलसेक सेट, सुई के बिना 3 एमएल सिरिंज, और हेपरिन 158 यूएसपी इकाइयों वाले छह 10 एमएल वैक्यूटेनर ट्यूब तैयार रखें (चित्रा 1)।
- 21 ग्राम रक्त संग्रह सुई को 3 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें और तैयार सिरिंज में 10% ग्लिसरॉल समाधान के 3 एमएल निकालें।
नोट: सुई डालने से पहले सभी सामग्रियों को निष्फल किया जाना चाहिए। - 10% ग्लिसरॉल समाधान को अनुक्रम में वैक्यूटेनर ट्यूबों में वितरित करें, जिसमें प्रत्येक में लगभग 0.5 एमएल 10% ग्लिसरॉल समाधान होता है (चित्रा 3 ए)।
नोट: टेस्ट ट्यूब में नकारात्मक दबाव के कारण, सुई को छह टेस्ट ट्यूबों में ग्लिसरॉल समाधान के 3 मिलीलीटर को समान रूप से वितरित करने के लिए जाने के तुरंत बाद बाहर आना चाहिए। - रोगी की त्वचा को 75% अल्कोहल बाँझ कपास के फाहे से बाँझ करें। 18 ग्राम रक्त संग्रह सुई के साथ रोगी के ऊपरी अंगों की सतही नस को पंचर करें। कुल मिलाकर सतही नस से 60-70 मिलीलीटर शिरापरक रक्त खींचें।
2. एमएसीएस आई ड्रॉप के लिए तैयारी
- क्रमिक रूप से खींचे गए शिरापरक रक्त के 10 मिलीलीटर को छह वैक्यूटेनर ट्यूबों में से प्रत्येक में इंजेक्ट करें (चित्रा 3 बी)।
नोट: यह कदम ट्यूबों को भरने के लिए वैक्यूम के नकारात्मक दबाव पर निर्भर करता है। रक्त कोशिका व्यवधान और हेमोलिसिस से बचने के लिए, कोई सकारात्मक दबाव लागू न करें। - इनक्यूबेटर में छह वैक्यूटेनर ट्यूबों को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान के साथ रखें (चित्रा 3 सी)।
नोट: ग्लिसरॉल प्राप्त करने वाली एक सील ट्यूब में शेष नकारात्मक दबाव द्वारा हाइपोक्सिक स्थिति को बनाए रखा जाता है और स्थिर किया जाता है। - 4 घंटे के बाद इनक्यूबेटर से ट्यूबों को निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर उन्हें सेंट्रीफ्यूज करें।
- इस बिंदु पर, एमएसीएस निष्कर्षण के लिए सामग्री तैयार करें, जिसमें निष्फल आंख की बूंद की बोतलें, सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज, 0.22 μm फिल्टर, एक 18 ग्राम सुई और बाँझ दस्ताने की एक जोड़ी शामिल है (चित्रा 2)।
नोट: एक सड़न रोकनेवाला वातावरण सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेटिंग टेबल को 75% अल्कोहल के साथ मिटा दिया जाना चाहिए। सतह पर तैरनेवाला, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पहले से ही एमएसीएस का एक अर्ध-तैयार उत्पाद है। - ट्यूब रैक पर छह ट्यूब रखें और पूर्ण सेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 3 डी) के बाद कैप खोलें।
नोट: इस चरण में बाँझपन की आवश्यकता नहीं है। - बाँझ दस्ताने पहनें और 18 ग्राम सुई के साथ 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करके एक-एक करके एमएसीएस को बाहर निकालें।
नोट: सावधान रहें कि इस चरण के दौरान निचले रक्त कोशिका परत को आकर्षित न करें (चित्रा 3 ई)। - सुई को बाहर खींचें, इसे 0.22 μm फ़िल्टर से कनेक्ट करें, और रक्त संग्रह सुई में 23 G, 1.5 को मूल 3 mL सिरिंज के साथ नीचे दिए गए आउटलेट से कनेक्ट करें (चित्रा 3F)।
- सुई को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से तैयार बाँझ आई ड्रॉप बोतलों (चित्रा 3 जी) में धीरे से धक्का दें।
- उपरोक्त चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी एमएसीएस को फ़िल्टर नहीं किया गया है और आई ड्रॉप बोतलों में संग्रहीत किया गया है (चित्रा 3 एच)।
- तत्काल उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएसीएस आई ड्रॉप स्टोर करें; दीर्घकालिक संरक्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह से अधिक समय तक या -20 डिग्री सेल्सियस 9,19 पर 3 महीने से अधिक समय तक न रखें।
3. म्यूरिन कॉर्नियल एपिथेलियम के पूर्व विवो घाव भरने का मॉडल।
नोट: निम्नलिखित पूर्व विवो पशु मॉडल कॉर्नियल एपिथेलियम20 की यांत्रिक चोटों पर हंग एट अल से पूर्व अनुभव पर आधारित था। एक अच्छी तरह से सीमित और सुसंगत कॉर्नियल उपकला घाव बनाने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
- C57BL/6 चूहों को 3% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें। मुराइन सेंट्रल कॉर्निया पर त्वचा बायोप्सी पंच को इंडेंट करें, जिससे एपिथेलियम पर एक उथला सर्कल एक समान घाव मार्जिन के रूप में छोड़ दिया जाए।
नोट: नेत्रगोलक टूटने से बचने के लिए सौम्य रहें। - बोमन की परत के नीचे पुष्टि किए गए क्षेत्र के भीतर कॉर्नियल एपिथेलियम को डेब्राइड करें, जिसमें 0.5 मिमी से लैस कॉर्नियल रस्ट रिंग रिमूवर हो।
- यांत्रिक कॉर्नियल घाव के पूर्व विवो पशु मॉडल को स्थापित करने के लिए, नेत्रगोलक की कटाई करें और संस्कृति को अच्छी तरह से तैयार करें।
- पहले चूहों को इच्छामृत्यु दें; फिर, चूहों के बेहतर और अवर कक्षीय रिम को धीरे से दबाएं, रेट्रोबुलबार स्पेस पर बल की नोक का परिचय दें, और नेत्रगोलक को बाहर निकालें और इसे बल द्वारा पकड़ें।
- नेत्रगोलक को पूरी तरह से अलग करने के लिए कॉर्नियल कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका और पेरिऑर्बिटल नरम ऊतक को काटें।
- इसके अंदर पिघले हुए मोम के साथ एक 96-अच्छी प्लेट तैयार करें। बल की युक्तियों का उपयोग करके जल्दी से एक गोल छेद बनाएं और फिर जमने की प्रतीक्षा करें।
- परीक्षण के लिए मीडिया तैयार करें: 0.5% एमएसीएस, तुलना के लिए 0.5% एएस, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सामान्य खारा, और डलबेकको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम)।
नोट: एमएसीएस ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। - पूर्व विवो संस्कृति के लिए, कटी हुई नेत्रगोलक को तैयार 96-वेल प्लेट पर रखें। 96-वेल प्लेट में प्रत्येक माध्यम के 200 μL जोड़ें।
- 96-वेल कल्चर प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। सुनिश्चित करें कि संस्कृति मीडिया हर 24 घंटे में बदल जाता है।
- अनुक्रमिक घाव भरने के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, फ्लोरेसिन धुंधला करके हर 8 घंटे में माइक्रोस्कोप के तहत उपकला घाव क्षेत्र की निगरानी करें।
- फ्लोरेसिन को फ्लोरेसिन पेपर पर सामान्य खारा के साथ घोलें।
- फ्लोरेसिन डाई को म्यूरिन सेंट्रल कॉर्निया पर गिराएं, फिर माइक्रोस्कोप के तहत इसका निरीक्षण और दस्तावेज करें। एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 4 में दिखाया गया है।
नोट: फ्लोरेसिन डाई की एक बूंद (लगभग 0.05 एमएल) अवलोकन के लिए पर्याप्त है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 और चित्रा 2 प्रयोग के लिए आवश्यक सामग्री दिखाते हैं, और चित्रा 3 एमएसीएस की तैयारी के दौरान अनुक्रमिक चरणों और सफल मध्य-उत्पादों को प्रदर्शित करता है। सबसे पहले, प्रत्येक 10 एमएल बाँझ टेस्ट ट्यूब (चित्रा 3 ए) में 10% ग्लिसरॉल समाधान के 0.5 एमएल को जोड़ा गया था। फिर, रोगी से 60-70 एमएल शिरापरक रक्त प्राप्त किया गया था, और प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल रक्त इंजेक्ट किया गया था (चित्रा 3 बी)। रोगी के रक्त को तैयारी से पहले गहन, नियमित प्रयोगशाला परीक्षाओं के अधीन किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रक्त की गुणवत्ता मानक तक है। सबसे आम कम गुणवत्ता वाला रक्त उत्पाद डिस्लिपिडेमिया के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सीरम की एक बादल ऊपरी परत होती है जिसे निकालना मुश्किल होता है; आंखों की बूंदों की आगे की तैयारी जारी नहीं रखी जा सकती है (चित्रा 5 ए)।
फिर, सीलबंद टेस्ट ट्यूब को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखा जाता है (चित्रा 3 सी)। इनक्यूबेशन और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, नमूने को एक ऊपरी परत में विभाजित किया जा सकता है जिसमें एमएसीएस का प्रारंभिक उत्पाद और एक निचली रक्त कोशिका परत (चित्रा 3 डी) होती है। ऊपरी परत तरल पदार्थ तब एकत्र किया गया था। इसके बाद सड़न रोकनेवाली तकनीक आवश्यक है। क्योंकि सीरम सूक्ष्मजीवों के लिए एक बहुत ही पौष्टिक प्रजनन वातावरण है, सुई के संपर्क में आने वाली किसी भी सतह को पहले 75% अल्कोहल के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए, और प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने का उपयोग किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, सतह पर तैरनेवाला को हटाते समय निचली परत से रक्त कोशिकाओं की गड़बड़ी से बचा जाना चाहिए (चित्रा 3 ई)।
इस चरण में, यह उम्मीद की जाती है कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट या हल्का पीला है। हालांकि, अगर थोड़ा लाल रंग देखा जाता है, तो हेमोलिसिस हो सकता है, और तैयारी बाद के चरणों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है (चित्रा 5 बी)। एकत्रित सीरम को फिर से सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सतह पर तैरनेवाला लाल रक्त कोशिकाओं से मुक्त है। सीरम को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से एक बाँझ आंख ड्रॉप बोतल (आंकड़े 3F, G) में फ़िल्टर किया गया था। अंतिम उत्पाद, एमएसीएस आई ड्रॉप्स, को उद्देश्य (चित्रा 3 एच) के आधार पर जल्द से जल्द प्रशीतित या फ्रीज किया गया था। लेबिल पोषक तत्वों में समृद्ध होने और परिरक्षकों की कमी के कारण आंखों की बूंदों को बहुत लंबे समय तक संग्रहीत नहीं किया जा सकता है।
एक्स विवो सतह उपचार मॉडल में, एमएसीएस आई ड्रॉप ने एएस आई ड्रॉप की तुलना में कॉर्नियल घाव भरने में बेहतर परिणाम दिखाया। माइक्रोस्कोप के नीचे शारीरिक घर्षण द्वारा एक संकेंद्रित कॉर्नियल घाव बनाने के बाद सी 57बीएल /6 चूहों की आंखों की पुतलियों की कटाई की गई थी। फिर, बलिदान किए गए चूहों की आंखों को चार अलग-अलग मीडिया में सुसंस्कृत किया गया, जिसमें शुद्ध सामान्य खारा, डीएमईएम, 0.5% एएस और 0.5% एमएसीएस शामिल थे।
यहां इस्तेमाल किया गया एएस माध्यम साहित्य21 और चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल लिंकू में नैदानिक अभ्यास के आधार पर तैयार किया गया था। शिरापरक रक्त, कुल मिलाकर 40 एमएल, त्वचा नसबंदी के बाद स्वयंसेवकों से वैक्यूटेनर ट्यूबों में खींचा गया था। ट्यूबों में कोई एंटीकोआगुलेंट नहीं जोड़ा गया था। रक्त को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए संग्रहीत किया गया था ताकि पूर्ण थक्के को सुनिश्चित किया जा सके, इसके बाद 10 मिनट के लिए 3,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, शुद्ध एएस ने ट्यूबों की ऊपरी परत पर कब्जा कर लिया, जिसे बीएसएस (बाँझ सिंचाई समाधान) द्वारा इस पूर्व विवो पशु मॉडल में 0.5% तक पतला किया गया था।
कॉर्नियल घावों को क्रमिक रूप से छह अलग-अलग समय बिंदुओं, अर्थात् 0, 8, 16, 24, 32 और 48 घंटे पर देखा गया था। प्रारंभिक परिणामों से पता चला है कि, 16 घंटे में, कॉर्नियल घाव अन्य समूहों की तुलना में 0.5% एमएसीएस आई ड्रॉप के तहत तेजी से ठीक हो गए। 24 घंटे में, 0.5% एएस और डीएमईएम समूहों में 0.5% एमएसीएस आई ड्रॉप के साथ तुलनीय चिकित्सीय प्रभाव थे। कॉर्नियल घावों का उपचार, पूर्ण वसूली के करीब, सामान्य खारा समूह (चित्रा 4) को छोड़कर, 32 घंटे में देखा गया था।
चित्रा 1: ट्यूबों में 10% ग्लिसरॉल समाधान जोड़ने के लिए आवश्यक सामग्री । (ए) 21 ग्राम तितली-पंख वाला जलसेक सेट। (बी) 10% ग्लिसरॉल समाधान का 250 एमएल। (ग) हेपरिन 158 यूएसपी इकाइयों से युक्त छह 10 एमएल वैक्यूटेनर ट्यूब। (डी) 3.0 एमएल सिरिंज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: रक्त के नमूने के सुपरनैटेंट के निष्कर्षण और निस्पंदन के लिए सामग्री । (ए) एक 0.22 μm फ़िल्टर। (बी) एक 5 एमएल स्टरलाइज्ड आई ड्रॉप बोतल। (सी) बाँझ दस्ताने की एक जोड़ी। (डी) 23 ग्राम सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज। (ई) एक 20 एमएल सिरिंज। (एफ) 18 ग्राम सुइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: रक्त सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए प्रक्रियाएं और संशोधित ऑटोलॉगस वातानुकूलित सीरम आई ड्रॉप के उत्पादन की तैयारी। (ए) प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में 10% ग्लिसरॉल समाधान का 0.5 एमएल जोड़ा गया था। (बी) रोगी से एकत्र किए गए रक्त के नमूने को छह परीक्षण ट्यूबों में समान रूप से विभाजित किया गया था (छवि में केवल एक दिखाया गया है)। (सी) 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखे जाने के बाद टेस्ट ट्यूब की उपस्थिति। (ई) सतह पर तैरने के बाद अवशेष। किसी को सावधान रहना चाहिए कि निचले रक्त कोशिका परत को उत्तेजित न करें। (एफ) सतह पर तैरनेवाला 3 एमएल सिरिंज में एकत्र किया जाता है और इसके नीचे 0.22 μm फ़िल्टर और 23 ग्राम सुई डाली जाती है। (जी) सुई को धीरे से बाँझ आई ड्रॉप बोतल में धकेल दिया जाता है। (एच) संशोधित एसीएस आई ड्रॉप का अंतिम उत्पाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: समय के साथ चार अलग-अलग संस्कृति मीडिया में मुराइन आंखों में कॉर्नियल घावों (फ्लोरेसिन धुंधला होने के बाद आंकड़ों में हरे क्षेत्र) के अनुक्रमिक परिवर्तन। खारा समूह में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, जबकि समय के साथ घाव भरने (तीर) डीएमईएम, 0.5% एएस और 0.5% एमएसीएस समूहों में देखा गया। 0.5% एमएसीएस समूह में, एएस और डीएमईएम के साथ इलाज किए गए लोगों की तुलना में घाव भरने (तीर) 16 घंटे में काफी अधिक पूर्ण था। 24 घंटे में, डीएमईएम, 0.5% एमएसीएस, और 0.5% एएस समूहों ने आगे उपचार प्रभाव (तीर) दिखाए, खासकर एमएसीएस समूह में। खारा समूह को छोड़कर, सभी समूहों के लिए लगभग कुल वसूली 32 घंटे में देखी गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद खराब रक्त उत्पादों के उदाहरण । (ए) डिस्लिपिडेमिया। सबसे आम दोषपूर्ण उत्पाद मोटापे या मधुमेह मेलेटस के कारण होते हैं, क्योंकि ऊपरी सीरम में उच्च वसा और कोलेस्ट्रॉल होता है। (बी) हेमोलिसिस। यह भी एक सामान्य उप-इष्टतम उत्पाद है। मुख्य कारण रक्त खींचने के लिए छोटे बोर सुइयों का उपयोग करने या रक्त उत्पादों को इंजेक्ट करने में अनुचित बाहरी बल का उपयोग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस अध्ययन में, एमएसीएस की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है और पशु मॉडल के घाव भरने में एमएसीएस आई ड्रॉप ्स का लाभ आगे दिखाया गया है। इस एमएसीएस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण संशोधन प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में 10% ग्लिसरॉल समाधान के लगभग 0.5 एमएल को जोड़ना है, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे इनक्यूबेशन के दौरान उपयुक्त हाइपोक्सिक स्थिति बनाता है। यह सेटिंग एएस को उचित तनाव प्रदान करती है और घाव भरने में मदद करने वाले आवश्यक विकास कारकों को स्रावित करने के लिए कोशिकाओं को प्रेरित करती है। 0.22 μm फ़िल्टर मैक्रोमोलेक्यूलर प्रोटीन, रक्त कोशिकाओं और अशुद्धियों को खत्म करने में मदद कर सकता है, इस प्रकार अंतिम उत्पाद को शुद्ध और कम चिपकने वाला बना सकता है।
रक्त को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, और आगे सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन किया जाता है। उचित तापमान पर अंतिम उत्पादों की तैयारी और भंडारण के दौरान बाँझपन पर सख्त ध्यान देना भी महत्वपूर्ण है। अंतिम सीरम उत्पादों में उच्च पोषक तत्व सामग्री बैक्टीरिया के लिए एक उत्कृष्ट संस्कृति माध्यम है। इस प्रकार, तैयारी के दौरान अनुचित भंडारण या संदूषण आंखों की बूंदों को खराब कर सकता है। दूषित एमएसीएस नेत्रश्लेष्मलाशोथ या संक्रामक केराटाइटिस जैसी बीमारियों का कारण बन सकता है।
रोगी के रक्त की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, रक्त उत्पादों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए एमएसीएस की तैयारी से पहले प्रयोगशाला परीक्षणों की आवश्यकता होती है। ड्राइंग के दौरान और रोगी के रक्त के नमूनों का संचालन करते समय, ऑपरेटरों को हेमोलिसिस के बारे में पता होना चाहिए। तैयारी के दौरान कोई भी दबाव आसानी से हेमोलिसिस का कारण बन सकता है; इसलिए, रक्त संग्रह के दौरान सिरिंज को धीरे-धीरे खींचना और धक्का देना चाहिए। हाइपोक्सिया को विकास कारकों और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए भी नियंत्रित किया जाना चाहिए। अनुभव और पहले प्रकाशित अध्ययनों22,23 के आधार पर, 4 एच हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन का आवेदन अंतिम सेटिंग है। ग्लिसरॉल स्थिरीकरण प्रभाव और उचित आसमाटिक बाह्य तरल दबाव के कारण कोशिका को अधिक उपयुक्त हाइपोक्सिक तनाव प्रदान कर सकताहै। हालांकि, ग्लिसरॉल की इष्टतम एकाग्रता और यह साइटोकिन एकाग्रता के साथ कैसे संबंधित है, अभी भी जांच करने की आवश्यकता है। भविष्य में, घाव भरने के विवो पशु अध्ययन में और इसकी प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए एक बड़े पैमाने पर यादृच्छिक नियंत्रण परीक्षण की आवश्यकता होगी।
अब तक, अनुसंधान ने मुख्य रूप से पारंपरिक एएस और उभरते पीआरपी आई ड्रॉप्स24,25,26,27 का उपयोग करके ओकुलर सतह रोगों के लिए सीरम उत्पादों को लागू करने पर ध्यान केंद्रित किया है। किसी भी थक्कारोधी के बिना पारंपरिक एएस और तैयारी के दौरान कोई फिल्टर का उपयोग नहीं करना अपने शुद्ध रूप में एम्बर है, लेकिन अक्सर इसकी चिपकने के कारण रोगियों को असहज बनाता है। नतीजतन, पतला एएस (20% -50%) आमतौर पर उपयोग किया जाता है, जो पोषक तत्वों की सांद्रता को कम करता है। पीआरपी, हालांकि, कम चिपकने वाला है और आमतौर पर अपने शुद्ध रूप (100%) में उपयोग किया जाता है। हाल की साहित्य रिपोर्टों में ज्यादातर बताया गया है कि पीआरपी एएस की तुलना में बेहतर विरोधी भड़काऊ और घाव भरने के प्रभाव प्रदान करता है, मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स, विकास कारकों में इसकी समृद्ध सामग्री के कारण, और आईएल -1-प्रेरित सूजन को कम करने की इसकी क्षमता16,26। गार्सिया-कोंका एट अल द्वारा किए गए एक यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षण में पहले ही पाया गया है कि गंभीर या मध्यम हाइपोसेक्रेट्री सूखी आंख रोगों में पीआरपी का आवेदनसंतोषजनक परिणाम दिखाता है। हालांकि एसीएस, एएस पर सुधार के रूप में, शायद ही कभी भड़काऊ और अपक्षयी ओकुलर सतह रोगों में रिपोर्ट किया गया है, इसका व्यापक रूप से ऑर्थोपेडिक्स 29,30,31 में अपक्षयी गठिया और घाव भरने के उपचार में उपयोग किया गया है। सबसे आम एसीएस का निर्माण और पेटेंट एक वाणिज्यिक किट13,32 के रूप में किया गया है। एसीएस और पीआरपी दोनों की ताकत को संयोजित करने के लिए एसीएस तैयारी की प्रक्रिया को समायोजित करने के बाद एमएसीएस को डिजाइन किया गया था। एमएसीएस का उत्पादन अधिक किफायती लागत पर किया जा सकता है क्योंकि किसी विशेष अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि सीआरएसओ 4-लेपित ग्लास बीड्स या कोई पेटेंट किट, जो एसीएस और पीआरपी दोनों की तैयारी में आवश्यक हैं।
आर्थिक चिंता के अलावा, एमएसीएस आई ड्रॉप्स ने एक पूर्व विवो प्रयोग में संतोषजनक प्रारंभिक परिणाम भी प्रदान किए, और वर्तमान, उभरते पीआरपी आई ड्रॉप्स के लिए एक क्रांतिकारी विकल्प हो सकता है। ध्यान दें, एसीएस ने अपनी विरोधी भड़काऊ क्षमता और बेहतर अंतर्जात मरम्मत तंत्र17 के कारण गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से भड़काऊ संयुक्त रोगों में सबसे स्थापित उपचारों की तुलना में बेहतर परिणामों का प्रदर्शन किया है। यद्यपि आज तक नेत्र विज्ञान में एसीएस के चिकित्सीय प्रभावों का कोई साहित्य प्रमाण नहीं है, लेकिन इसके विरोधी भड़काऊ तंत्र और आर्थोपेडिक्स33 में सफलता के कारण कॉर्नियल उपकला दोषों वाले रोगियों के लिए इसके आवेदन में क्षमता को मानना उचित है। हमारे पूर्व विवो अध्ययन में एमएसीएस के साथ केवल एएस की तुलना की गई थी; हालांकि, वाणिज्यिक किट के माध्यम से उत्पादित पीआरपी और एसीएस की तुलना भी की जा सकती है। एमएसीएस में विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और विकास कारकों के सीरम स्तर का विश्लेषण करने में भविष्य के शोध एसीएस या पीआरपी के साथ इसकी समानता और एएस के लिए संभावित श्रेष्ठता की पुष्टि करने में उपयोगी होंगे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए या-लान चिएन और चिया-यिंग ली और भाषाई संस्करण के लिए ऑनलाइन अंग्रेजी कंपनी को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को चांग गुंग मेडिकल रिसर्च प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या सीएमआरपीजी 3 एल 1491) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
