Summary
Este artigo descreve um protocolo para simplificar o processo e tornar a preparação de soro condicionado autólogo (SCA) menos dispendiosa. Não são necessárias seringas especiais ou contas de vidro revestidas de superfície. Além disso, a SCA modificada (mACS) apresenta vantagens competitivas sobre o soro autólogo convencional na cicatrização de feridas corneanas de olhos murinos ex vivo.
Abstract
As terapias tópicas derivadas do sangue humano têm sido um benefício para os clínicos nas últimas décadas. O soro autólogo (EA) e o plasma rico em plaquetas (PRP) são enriquecidos em fatores de crescimento epiteliotrópicos essenciais na cicatrização de feridas na córnea. Ao contrário da EA, o PRP é baseado em um sistema de centrifugação diferencial, produzindo mais fatores de crescimento derivados de plaquetas. O soro condicionado autólogo (SCA) não só preserva a preparação de EA e PRP, mas também se concentra nas propriedades imunomoduladoras, que são importantes em doenças inflamatórias.
A falta de protocolos padronizados e os altos custos de preparo são limitações para a aplicação clínica das SCA. Este experimento em vídeo demonstra um procedimento operacional padrão para a preparação de colírios de soro condicionado autólogo modificado (mACS). Primeiro, o glicerol foi adicionado às seringas de heparina como estabilizador das células sanguíneas durante a incubação hipóxica. Para ativar as células sanguíneas, iniciou-se incubação de 4 h a 37 °C. Em seguida, as amostras de sangue foram centrifugadas a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente. Após filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm, os colírios mACS foram totalmente preparados.
Uma tentativa de experimentar o efeito terapêutico da mACS mostrou que ela pode ter vantagens competitivas sobre a EA convencional na cicatrização de feridas na córnea em olhos de camundongos ex vivo . A EA utilizada neste estudo foi preparada de acordo com estudos publicados e com a prática clínica em nosso hospital. Portanto, a eficácia da mACS em doenças da superfície ocular poderia ser avaliada em pesquisas futuras através de estudos in vivo em animais e ensaios clínicos.
Introduction
Os efeitos terapêuticos do soro autólogo (EA) nas doenças do olho seco foram relatados pela primeira vez na década de 1980 por Fox et al.1. Acredita-se que tanto a propriedade lubrificante quanto os componentes bioquímicos epiteliotrópicos essenciais na EA, mimetizando lágrimas naturais, beneficiem a proliferação de células epiteliais corneanas. Nas últimas décadas, vários estudos têm sido realizados com base nisso. Os componentes tróficos incluem fator de crescimento epidérmico (EGF), vitamina A, fator transformador de crescimento β (TGF-β) e outras citocinas. Curiosamente, o soro é rico em TGF-β e vitamina A, que se acredita desempenharem um papel fundamental na proliferação epidérmica 2,3,4,5. Além disso, no tratamento de pacientes com doenças da superfície ocular, vários estudos têm demonstrado algumas vantagens do colírio de EA nos resultados relatados pelo paciente,outros parâmetros objetivos do olho seco6,7 e achados microscópicos, como a densidade celular8. Estudos de metanálise revelaram que pode haver alguns benefícios na melhora das síndromes dos pacientes com o tratamento com colírios EA, mas ainda faltam resultados e observações a longo prazo 9,10.
Ao contrário da EA, o plasma rico em plaquetas (PRP) é derivado da adição de um anticoagulante durante a preparação, com posterior centrifugação diferencial e ativação química das plaquetas. Em comparação com a EA, vários produtos químicos e fatores de crescimento, como TGF-β, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e EGF, estão presentes no PRP. Também tem sido aplicada em doenças da superfície ocular com benefícios clínicos no alívio dossintomas11.
A ligação cruzada entre defeitos epiteliais e inflamação é complexa. Notadamente, a imunofisiopatologia é outra questão importante nas doenças da superfície ocular. Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β e IFN-γ, sejam mediadores fundamentais em cascatas inflamatórias12. Novos caminhos de tratamento são assim abertos a partir da compreensão do mecanismo imunológico. Estratégias para interromper esse processo inflamatório, incluindo a produção de antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) e outras citocinas anti-inflamatórias, também podem desempenhar um papel importante nas doenças da superfície ocular13,14,15.
Desde 1998, a ortocina, soro condicionado autólogo (SCA) comercializado, tem sido utilizada clinicamente em pacientes ortopédicos portadores de osteoartrite (OA), artrite reumatoide (AR) e distúrbios da coluna vertebral13. Em comparação com EA e PRP, o tratamento com esferas de vidro revestidas quimicamente e incubação hipóxica para ativar monócitos são as características específicas da SCA16. Teoricamente, mais fatores anti-inflamatórios podem ser secretados pela adição de estresse de sobrevivência às células, resultando em uma maior concentração de componentes imunomoduladores essenciais, incluindo IL-1Ra. Os melhores benefícios terapêuticos da SCA na OA, em comparação com a EA, também foram relatados17. As doenças da superfície ocular compartilham antecedentes imunológicos semelhantes com as doenças inflamatórias ortopédicas em alguns aspectos. Portanto, com base nos resultados bem-sucedidos da terapia derivada do sangue humano no campo ortopédico, a SCA pode ter vantagens sobre os tratamentos convencionais na prática clínica pelas propriedades epiteliotrópicas e imunomoduladoras. Embora a SCA tenha sido amplamente utilizada em doenças inflamatórias ortopédicas, suas aplicações clínicas em oftalmologia ainda precisam ser exploradas, o que pode ser dificultado pelo seu alto custo, falta de respaldo na literatura e falta de padronização do processo de preparo, resultando em desempenho diversificado.
Neste artigo em vídeo, um método novo, econômico e conveniente foi demonstrado para gerar a SCA modificada (mACS), ou plasma rico em fatores de crescimento (PRGF), produzindo uma solução de colírio com um valor prático comparável às SCAs comercializadas. As idéias-chave de adicionar anticoagulantes e desencadear as células sanguíneas para secretar citocinas anti-inflamatórias por incubação estressada foram mantidas, mas ao contrário dos métodos quimicamente induzidos, como aqueles baseados em esferas de vidro revestidas com CrSO4 e kits comerciais, o estado crítico de estresse é fisicamente induzido pela incubação hipóxica neste método. Além disso, o glicerol foi adicionado para proporcionar benefícios extras, incluindo aumento da estabilidade da membrana das células sanguíneas, manutenção de uma pressão adequada do líquido extracelular osmótico18 e uma fonte adequada de nutrientes em condições hipóxicas que evitam o estresse excessivo das células.
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Protocol
A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais no início da seção de protocolo. Todos os protocolos e procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Fundação Médica Chang Gung. Todos os voluntários foram informados sobre a natureza deste estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes de sua inclusão. Os consumíveis necessários para todo o procedimento experimental são apresentados na Figura 1 e Figura 2, bem como na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos materiais necessários para produzir colírios mACS
- Preparar 250 mL de solução de glicerol a 10% e manter pronto um conjunto de infusão de asas de borboleta de 21 G, uma seringa de 3 mL sem agulha e seis tubos vacutainer de 10 mL contendo heparina 158 unidades USP (Figura 1).
- Conecte a agulha de coleta de sangue 21 G à seringa de 3 mL e retire 3 mL de solução de glicerol a 10% na seringa preparada.
NOTA: Todos os materiais devem ser esterilizados antes da inserção da agulha. - Distribuir a solução de glicerol a 10% nos tubos vacutainer em sequência, com aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada um (Figura 3A).
NOTA: Devido à pressão negativa no tubo de ensaio, a agulha deve sair imediatamente após entrar para distribuir uniformemente 3 mL de solução de glicerol para os seis tubos de ensaio. - Esterilizar a pele do paciente com cotonetes estéreis com álcool 75%. Puncionar a veia superficial dos membros superiores do paciente com a agulha de coleta de sangue 18G. Extrair 60-70 mL de sangue venoso da veia superficial no total.
2. Preparação para colírios mACS
- Injetar sequencialmente 10 mL do sangue venoso coletado em cada um dos seis tubos vacutainer (Figura 3B).
NOTA: Esta etapa depende da pressão negativa do vácuo para encher os tubos. Para evitar a ruptura das células sanguíneas e hemólise, não aplique pressão positiva. - Colocar os seis tubos vacutainer na incubadora com uma temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C).
NOTA: O estado hipóxico é mantido e estabilizado pela pressão negativa remanescente em um tubo selado que recebeu glicerol. - Retire os tubos da incubadora após 4 h e centrifugue-os a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente.
- Nesse momento, prepare os materiais para extração do mACS, incluindo os frascos de colírio esterilizados, uma seringa de 3 mL com a agulha, um filtro de 0,22 μm, uma agulha de 18 G e um par de luvas estéreis (Figura 2).
NOTA: A mesa cirúrgica deve ser limpa com álcool a 75% para garantir um ambiente asséptico. O sobrenadante, após centrifugação, já é um produto semiacabado do mACS. - Coloque os seis tubos no rack de tubos e abra as tampas após a centrifugação completa (Figura 3D).
NOTA: A esterilidade não é necessária nesta etapa. - Coloque luvas estéreis e retire o mACS um a um usando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 18 G.
NOTA: Tenha cuidado para não retirar a camada inferior de células sanguíneas durante esta etapa (Figura 3E). - Puxe a agulha, conecte-a ao filtro de 0,22 μm e conecte a agulha de coleta de sangue de 23 G, 1,5 com a seringa original de 3 mL à saída abaixo (Figura 3F).
- Empurre a agulha suavemente através do filtro de 0,22 μm para os frascos de colírio estéril preparados (Figura 3G).
- Repita as etapas acima até que todos os mACS tenham sido filtrados e armazenados em frascos de colírio (Figura 3H).
- Conservar o colírio mACS a 4 °C para utilização imediata; conservar a -20 °C para preservação a longo prazo.
NOTA: Não os mantenha durante mais de 2 semanas a 4 °C ou durante mais de 3 meses a -20 °C 9,19.
3. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano murino
NOTA: O modelo animal ex vivo a seguir foi baseado na experiência prévia de Hung e col. sobre lesões mecânicas do epitélio corneano20. Os passos seguintes devem ser realizados sob o microscópio para criar uma ferida epitelial corneana bem circunscrita e consistente.
- Anestesiar os camundongos C57BL/6 com isoflurano a 3%-4%. Recuar o punção da biópsia de pele sobre a córnea central murina, deixando um círculo raso no epitélio como uma margem uniforme da ferida.
NOTA: Seja gentil para evitar a ruptura do globo ocular. - Desbridar o epitélio corneano dentro da área confirmada até a camada de Bowman, com um removedor de anel de ferrugem corneana equipado com uma broca de 0,5 mm.
- Para estabelecer o modelo animal ex vivo da ferida corneana mecânica, colher o globo ocular e preparar bem a cultura.
- Eutanasiar os ratos primeiro; Em seguida, pressione suavemente as bordas orbitárias superior e inferior dos camundongos, introduza a ponta da pinça sobre o espaço retrobulbar, saia do globo ocular e segure-o pela pinça.
- Cortar o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar perfeitamente o globo ocular.
- Prepare um prato de 96 poços com cera derretida em seu interior. Crie rapidamente um orifício redondo usando as pontas das pinças e aguarde a solidificação.
- Preparar os meios a serem testados: 0,5% mACS, 0,5% AS para comparação, soro fisiológico normal como controle negativo e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
NOTA: mACS é obtido usando o protocolo mencionado acima. - Para a cultura ex vivo , coloque o globo ocular colhido na placa preparada de 96 poços. Adicionar 200 μL de cada meio na placa de 96 poços.
- Coloque a placa de cultura de 96 poços na incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Garantir que os meios de cultura sejam trocados a cada 24 h.
- Para confirmar o efeito sequencial da cicatrização da ferida, monitorar a área da ferida epitelial sob o microscópio a cada 8 h por coloração de fluoresceína.
- Dissolva a fluoresceína no papel fluoresceína com soro fisiológico.
- Solte o corante fluoresceína na córnea central murina, depois observe e documente-o sob um microscópio. Um resultado típico é mostrado na Figura 4.
NOTA: Uma gota (aproximadamente 0,05 mL) de corante fluoresceína é suficiente para a observação.
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Representative Results
A Figura 1 e a Figura 2 mostram os materiais necessários para o experimento, e a Figura 3 mostra as etapas sequenciais e os produtos intermediários bem-sucedidos durante a preparação do mACS. Primeiro, 0,5 mL de solução de glicerol a 10% foi adicionado a cada tubo de ensaio estéril de 10 mL (Figura 3A). Em seguida, 60-70 mL de sangue venoso foram obtidos do paciente, e 10 mL de sangue foram injetados em cada tubo (Figura 3B). O sangue do paciente deve ser submetido a exames laboratoriais minuciosos e regulares antes da preparação para garantir que a qualidade do sangue esteja dentro dos padrões. O hemoderivado de baixa qualidade mais comum é devido à dislipidemia, que resulta em uma camada superior turva de soro após a centrifugação que é difícil de remover; o preparo adicional dos colírios não pode ser continuado (Figura 5A).
Em seguida, o tubo de ensaio selado é colocado em uma incubadora a 37 °C por 4 h (Figura 3C). Após incubação e centrifugação, a amostra pôde ser separada em uma camada superior contendo o produto preliminar do mACS e uma camada inferior de células sanguíneas (Figura 3D). O líquido da camada superior foi então coletado. Técnicas assépticas são essenciais daqui em diante. Como o soro é um ambiente de reprodução muito nutritivo para microrganismos, qualquer superfície que entre em contato com a agulha deve ser desinfetada com álcool 75% primeiro, e luvas estéreis devem ser usadas durante o processo. É importante ressaltar que a perturbação das células sanguíneas da camada inferior deve ser evitada ao remover o sobrenadante (Figura 3E).
Nesta etapa, espera-se que o sobrenadante seja claro ou amarelo pálido. No entanto, se uma leve coloração vermelha for observada, pode ter ocorrido hemólise, e o preparo pode não ser adequado para as etapas subsequentes (Figura 5B). O soro coletado pode ser centrifugado novamente para garantir que o sobrenadante esteja livre de hemácias. O soro foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm para um frasco de colírio estéril (Figuras 3F,G). O produto final, colírio mACS, foi então refrigerado ou congelado o mais rápido possível, dependendo da finalidade (Figura 3H). Os colírios não podiam ser armazenados por muito tempo devido à sua riqueza em nutrientes lábeis e à falta de conservantes.
No modelo de cicatrização de superfície ex vivo , o colírio mACS apresentou resultado superior na cicatrização de feridas corneanas em comparação com o colírio EA. A coleta dos globos oculares de camundongos C57BL/6 foi realizada após a criação de uma ferida corneana concêntrica por abrasão física ao microscópio. Em seguida, os olhos de camundongos sacrificados foram cultivados em quatro meios diferentes, incluindo solução salina normal pura, DMEM, SA a 0,5% e mACS a 0,5%.
O meio EA aqui utilizado foi preparado com base na literatura21 e na prática clínica do Chang Gung Memorial Hospital Linkou. O sangue venoso, no total, 40 mL, foi coletado em tubos vacutainer dos voluntários após a esterilização da pele. Nenhum anticoagulante foi adicionado às sondas. O sangue foi então armazenado por 30 min à temperatura ambiente para garantir a coagulação completa seguida de centrifugação a 3.500 × g por 10 min. Após a centrifugação, o SA puro ocupou a camada superior dos tubos, que foi diluída por BSS (solução irrigante estéril) a 0,5% neste modelo animal ex vivo .
As feridas da córnea foram observadas sequencialmente em seis momentos diferentes: 0, 8, 16, 24, 32 e 48 h. Os resultados preliminares mostraram que, em 16 h, as feridas corneanas cicatrizaram mais rapidamente sob o colírio mACS 0,5% do que os outros grupos. Em 24 h, os grupos AS 0,5% e DMEM tiveram efeitos terapêuticos comparáveis com o colírio mACS 0,5%. A cicatrização das feridas corneanas, próxima à recuperação total, foi observada em 32 h, exceto para o grupo com solução salina normal (Figura 4).
Figura 1: Materiais necessários para adicionar solução de glicerol a 10% nos tubos . (A) 21 G de conjunto de perfusão de asas de borboleta. (B) 250 mL de solução de glicerol a 10%. (C) Seis tubos vacutainer de 10 mL contendo heparina 158 unidades USP. (D) Seringa de 3,0 mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os materiais para extração e filtração do sobrenadante da amostra de sangue . (A) Um filtro de 0,22 μm. (B) Frasco de colírio esterilizado de 5 mL. (C) Um par de luvas estéreis. (D) Seringa de 3 mL com agulha 23G. (E) Uma seringa de 20 mL. (F) Agulhas de 18 G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimentos para centrifugação do sangue e preparo para a produção de colírio de soro condicionado autólogo modificado . (A) 0,5 mL de solução de glicerol a 10% foi adicionado em cada tubo de ensaio. (B) A amostra de sangue coletada do paciente foi dividida igualmente em seis tubos de ensaio (apenas um mostrado na imagem). (C) Aparência do tubo de ensaio após ser colocado em uma incubadora de 37 °C por 4 h. (D) As camadas de soro e células sanguíneas após centrifugação. (E) O resíduo após aspiração do sobrenadante. Deve-se ter cuidado para não aspirar a camada inferior de células sanguíneas. (F) O sobrenadante é coletado na seringa de 3 mL e um filtro de 0,22 μm e uma agulha de 23 G são inseridos abaixo dela. (G) A agulha é suavemente empurrada para dentro do frasco estéril do colírio. (H) Produto final do colírio ACS modificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações sequenciais de feridas corneanas (áreas verdes nas figuras após coloração com fluoresceína) em olhos murinos em quatro diferentes meios de cultura ao longo do tempo. Não houve diferença significativa no grupo salina, enquanto a cicatrização (setas) ao longo do tempo foi observada nos grupos DMEM, EA 0,5% e SCm 0,5%. No grupo mACS a 0,5%, a cicatrização das feridas (setas) foi significativamente mais completa em 16 h do que aqueles tratados com EA e DMEM. Em 24 h, os grupos DMEM, mACS 0,5% e EA 0,5% mostraram efeitos cicatrizantes adicionais (setas), especialmente no grupo mACS. Recuperação quase total foi observada em 32 h para todos os grupos, exceto para o grupo salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de hemoderivados pobres após centrifugação . (A) Dislipidemia. Os produtos defeituosos mais comuns são devido à obesidade ou diabetes mellitus, pois o soro superior contém gordura e colesterol elevados. (B) hemólise. Este também é um produto sub-ótimo comum. A principal razão pode ser atribuída ao uso de agulhas de pequeno calibre para coleta de sangue ou ao uso de força externa inadequada na injeção de hemoderivados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, um protocolo para a preparação de mACS é descrito e o benefício do colírio mACS na cicatrização de feridas de modelos animais é ainda mostrado. A modificação crucial deste protocolo mACS é a adição de aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada tubo de ensaio, o que cria condições hipóxicas adequadas durante as 4 h de incubação a 37 °C. Esta configuração fornece o AS com estresse adequado e células prontas para secretar os fatores de crescimento necessários que ajudam a cicatrização de feridas. O filtro de 0,22 μm pode ajudar a eliminar as proteínas macromoleculares, células sanguíneas e impurezas, tornando o produto final puro e menos adesivo.
O sangue é incubado por 4 h a 37 °C, e mais centrifugação e filtração são realizadas. A atenção estrita à esterilidade durante a preparação e armazenamento dos produtos finais a uma temperatura adequada também é crucial. O alto teor de nutrientes nos produtos finais do soro é um excelente meio de cultura para as bactérias. Assim, o armazenamento inadequado ou a contaminação durante o preparo podem estragar o colírio. MACS contaminados podem causar doenças como conjuntivite ou ceratite infecciosa.
A qualidade do sangue do paciente também é importante; portanto, testes laboratoriais são necessários antes da preparação de mACS para garantir a segurança dos hemocomponentes. Durante a coleta e ao operar as amostras de sangue do paciente, os operadores devem estar cientes da hemólise. Qualquer pressão durante o preparo pode facilmente causar hemólise; portanto, a seringa deve ser puxada e empurrada lentamente durante a coleta de sangue. A hipóxia também deve ser controlada para obter altas concentrações de fatores de crescimento e citocinas anti-inflamatórias. Com base na experiência e em estudos previamente publicados22,23, a aplicação de uma incubação hipóxica de 4 h é o cenário final. O glicerol poderia proporcionar estresse hipóxico mais adequado à célula, devido ao efeito estabilizador e à adequada pressão do líquido extracelular osmótico que pode proporcionar18. No entanto, a concentração ideal de glicerol e como ela se correlaciona com a concentração de citocinas ainda precisam ser verificadas. No futuro, estudos in vivo em animais de cicatrização de feridas e um ensaio clínico randomizado e controle em maior escala serão necessários para confirmar sua eficácia.
Até o momento, as pesquisas têm se concentrado principalmente na aplicação de produtos séricos em doenças da superfície ocular utilizando EA tradicional e colírio emergente PRP24,25,26,27. A EA tradicional sem qualquer anticoagulante e sem usar filtro durante o preparo é âmbar em sua forma pura, mas muitas vezes deixa os pacientes desconfortáveis devido à sua adesividade. Como resultado, geralmente é usado AS diluído (20%-50%), o que diminui as concentrações dos nutrientes. O PRP, no entanto, é menos adesivo e geralmente utilizado em sua forma pura (100%). Relatos recentes da literatura apontam principalmente que o PRP proporciona melhores efeitos anti-inflamatórios e cicatrizantes do que a EA, principalmente devido ao seu rico conteúdo em citocinas anti-inflamatórias, fatores de crescimento e sua capacidade de atenuar a inflamação induzida por IL-1β16,26. Um ensaio clínico randomizado e controlado conduzido por García-Conca e col. já verificou que a aplicação do PRP em doenças do olho seco hipossecretoras graves ou moderadas apresenta resultadossatisfatórios 28. Embora a SCA, como melhora sobre a EA, tenha sido raramente relatada em doenças inflamatórias e degenerativas da superfície ocular, tem sido amplamente utilizada no tratamento de artrite degenerativa e cicatrização de feridas em ortopedia29,30,31. O SCA mais comum foi fabricado e patenteado como kit comercial13,32. O mACS foi projetado após ajustar o processo de preparação da SCA para combinar os pontos fortes da ACS e do PRP. O mACS pode ser produzido a um custo mais econômico porque não são necessários reagentes especiais, como esferas de vidro revestidas com CrSO4 ou quaisquer kits patenteados, que são necessários na preparação de ACS e PRP.
Além da preocupação econômica, o colírio mACS também forneceu resultados preliminares satisfatórios em um experimento ex vivo , e pode ser uma alternativa revolucionária para o colírio PRP emergente atual. Vale ressaltar que a SCA tem demonstrado melhores resultados do que a maioria dos tratamentos estabelecidos em doenças inflamatórias articulares, tanto qualitativa quanto quantitativamente, devido à sua capacidade anti-inflamatória e à melhora dos mecanismos de reparo endógeno17. Embora não haja evidências na literatura dos efeitos terapêuticos da SCA em oftalmologia até o momento, é razoável supor o potencial de sua aplicação em pacientes com defeitos epiteliais corneanos devido ao seu mecanismo anti-inflamatório e ao sucesso emortopedia33. Apenas a EA foi comparada com a mACS em nosso estudo ex vivo ; no entanto, PRP e ACS produzidos através de kits comerciais também podem ser comparados. Pesquisas futuras na análise dos níveis séricos de citocinas anti-inflamatórias e fatores de crescimento na mACS seriam úteis para confirmar sua semelhança com SCA ou PRP, e potencial superioridade para EA.
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Disclosures
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Ya-Lan Chien e Chia-Ying Lee pela excelente assistência técnica, e à empresa inglesa OnLine pela edição linguística. Este estudo foi financiado em parte por Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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