Summary
이 기사에서는 공정을 단순화하고 자가 컨디셔닝 세럼(ACS) 준비 비용을 낮추는 프로토콜에 대해 설명합니다. 특별한 주사기 또는 표면 코팅 유리 구슬이 필요하지 않습니다. 더욱이, 변형된 ACS(mACS)는 생체 외에서 쥐 눈의 각막 상처 치유에 있어서 종래의 자가 혈청에 비해 경쟁 우위를 갖는다.
Abstract
인간 혈액 유래 국소 요법은 최근 수십 년 동안 임상의에게 큰 도움이 되었습니다. 자가 혈청(AS)과 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)은 각막 상처 치유에 필수적인 상피친화성 성장 인자를 풍부하게 함유하고 있습니다. AS와 달리 PRP는 차등 원심분리 시스템을 기반으로 하여 더 많은 혈소판 유래 성장 인자를 생성합니다. 자가 컨디셔닝 세럼(ACS)은 AS 및 PRP의 준비를 보존할 뿐만 아니라 염증성 질환에서 중요한 면역 조절 특성에 중점을 둡니다.
표준화된 프로토콜의 부족과 높은 준비 비용은 ACS의 임상 적용에 대한 한계입니다. 이 비디오 실험은 변형된 자가 컨디셔닝 혈청(mACS) 점안액을 준비하기 위한 표준 작동 절차를 보여줍니다. 먼저, 글리세롤은 저산소 배양 동안 혈액 세포 안정제로서 헤파린 주사기에 첨가되었습니다. 혈액 세포를 활성화시키기 위해, 37°C에서 4시간 인큐베이션을 개시하였다. 이어서, 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 3,500 × g 에서 원심분리하였다. 상층액을 0.22 μm 필터를 통해 여과한 후, mACS 점안액을 완전히 제조하였다.
mACS의 치료 효과에 대한 잠정적인 시험은 생체 외 마우스 눈에서 각막 상처 치유에서 기존 AS에 비해 경쟁 우위를 가질 수 있음을 보여주었습니다. 본 연구에 사용된 AS는 발표된 연구와 본원의 임상 실습에 따라 작성되었습니다. 따라서 안구 표면 질환에 대한 mACS의 효능은 in vivo 동물 연구 및 임상 시험을 통해 향후 연구에서 평가될 수 있습니다.
Introduction
안구건조증에서 자가 혈청(AS)의 치료 효과는 1980년대 Fox et al.1에 의해 처음 보고되었습니다. 자연 눈물을 모방한 AS의 윤활 특성과 필수 상피친화성 생화학적 성분 모두 각막 상피 세포의 증식에 도움이 되는 것으로 믿어집니다. 지난 수십 년 동안 여러 연구가 이를 기반으로 수행되었습니다. 영양 성분은 표피 성장 인자 (EGF), 비타민 A, 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 및 다른 사이토카인을 포함한다. 흥미롭게도, 혈청은 TGF-β 및 비타민 A가 풍부하며, 이들은 표피 증식에 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다 2,3,4,5. 또한, 안구 표면 질환 환자를 치료할 때, 여러 연구에서 환자가 보고한 결과, 기타 객관적인 안구건조증수치 6,7 및 세포 밀도와 같은 현미경적 소견에서 AS 점안액의 몇 가지 이점을 보여주었다8. 메타 분석 연구에 따르면 AS 점안액 치료로 환자의 증후군을 개선하는 데 몇 가지 이점이 있을 수 있지만 장기적인 결과와 관찰은 여전히부족합니다 9,10.
AS와 달리 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 준비 중에 항응고제를 첨가하여 파생되며, 혈소판의 추가 차등 원심분리 및 화학적 활성화가 있습니다. AS와 비교하여 TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 EGF와 같은 수많은 화학 물질 및 성장 인자가 PRP에 존재합니다. 또한 안구 표면 질환에도 적용되어 증상 완화에 임상적 이점이 있다11.
상피 결함과 염증 사이의 교차 결합은 복잡합니다. 특히, 면역병태생리학은 안구 표면 질환의 또 다른 중요한 문제입니다. IL-1β 및 IFN-γ과 같은 전염증성 사이토카인은 염증성 캐스케이드에서 중추적인 매개체인 것으로 여겨진다12. 따라서 면역 메커니즘에 대한 이해를 바탕으로 새로운 치료 방법이 열립니다. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 및 기타 항염증성 사이토카인의 생산을 포함하여 이러한 염증 과정을 멈추게 하는 전략은 또한 안구 표면 질환에서 중요한 역할을 할 수 있다13,14,15.
1998년부터 상용화된 자가 컨디셔닝 혈청(ACS)인 오르토카인은 골관절염(OA), 류마티스 관절염(RA) 및 척추 질환을 앓고 있는 정형외과 환자에게 임상적으로 사용되어 왔다13. AS 및 PRP와 비교하여 화학적으로 코팅된 유리 비드로 처리하고 단핵구를 활성화하기 위한 저산소 배양은 ACS16의 특정 특징입니다. 이론적으로 세포에 생존 스트레스를 가함으로써 더 많은 항염증 인자를 분비할 수 있으며, 그 결과 IL-1Ra를 포함한 필수 면역 조절 성분의 농도가 높아집니다. AS와 비교하여 OA에서 ACS의 개선된 치료 효과 또한 보고되었다17. 안구 표면 질환은 어떤 면에서 정형외과적 염증성 질환과 유사한 면역 배경을 공유합니다. 따라서 정형외과 분야에서 인간 혈액 유래 치료의 성공적인 결과를 바탕으로 ACS는 상피친화성 및 면역 조절 특성에 의해 임상 실습에서 기존 치료법에 비해 이점을 가질 수 있습니다. ACS는 정형외과 염증성 질환에 널리 사용되어 왔지만 안과에서의 임상 적용은 여전히 탐색이 필요하며, 이는 높은 비용, 문헌 지원 부족, 준비 과정의 표준화 부족으로 인해 방해를 받을 수 있어 다양한 성능을 제공합니다.
이 비디오 기사에서는 변형된 ACS(mACS) 또는 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장을 생성하여 상용화된 ACS에 필적하는 실용적인 가치를 지닌 점안액 용액을 생성하는 새롭고 비용 효율적이며 편리한 방법을 시연했습니다. 항응고제를 첨가하고 스트레스 배양을 통해 혈액 세포가 항염증성 사이토카인을 분비하도록 하는 핵심 아이디어는 유지되었지만 CrSO4 코팅 유리 구슬 및 상업용 키트를 기반으로 하는 방법과 같은 화학적 유도 방법과 달리 이 방법에서는 저산소 배양에 의해 임계 스트레스 상태가 물리적으로 유도됩니다. 또한, 글리세롤은 혈액 세포막의 안정성 증가, 적절한 삼투성 세포외액 압력의 유지(18), 세포에 과도한 스트레스를 주지 않는 저산소 상태에서 적절한 영양소 공급원을 포함하여 추가적인 이점을 제공하기 위해 첨가되었다.
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Protocol
연구는 프로토콜 섹션의 시작 부분에 있는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 프로토콜과 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board의 검토 및 승인을 받았습니다. 모든 지원자는 이 연구의 성격에 대해 통보받았고 포함되기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 전체 실험 절차에 필요한 소모품은 그림 1 과 그림 2 및 재료 표에 나와 있습니다.
1. mACS 점안액 생산에 필요한 물질의 준비
- 250mL의 10% 글리세롤 용액을 준비하고 21G 나비 날개 주입 세트, 바늘이 없는 3mL 주사기, 헤파린 158 USP 단위가 들어 있는 6개의 10mL 진공 튜브를 준비합니다(그림 1).
- 21G 채혈 바늘을 3mL 주사기에 연결하고 준비된 주사기에 10% 글리세롤 용액 3mL를 빼냅니다.
알림: 바늘을 삽입하기 전에 모든 재료를 멸균해야 합니다. - 10% 글리세롤 용액을 각각 약 0.5mL의 10% 글리세롤 용액과 함께 진공 튜브에 순서대로 분배합니다(그림 3A).
참고: 시험관의 음압 때문에 6개의 시험관에 글리세롤 용액 3mL를 고르게 분배하기 위해 바늘이 들어간 직후에 바늘이 나와야 합니다. - 75 % 알코올 멸균 면봉으로 환자의 피부를 소독하십시오. 18G 채혈 바늘로 환자 상지의 표재성 정맥을 뚫습니다. 표재성 정맥에서 총 60-70mL의 정맥혈을 채취합니다.
2. mACS 점안액 준비
- 채취한 정맥혈 10mL를 6개의 진공 튜브 각각에 순차적으로 주입합니다(그림 3B).
알림: 이 단계는 튜브를 채우기 위해 진공의 음압에 의존합니다. 혈액 세포 파괴 및 용혈을 피하려면 양압을 가하지 마십시오. - 6개의 진공 튜브를 37°C의 일정한 온도로 4시간 동안 인큐베이터에 넣습니다(그림 3C).
참고: 저산소 상태는 글리세롤을 받은 밀봉된 튜브에 남아 있는 음압에 의해 유지되고 안정화됩니다. - 4시간 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 실온에서 10분 동안 3,500× g 에서 원심분리합니다.
- 이 시점에서 멸균된 점안액 병, 바늘이 있는 3mL 주사기, 0.22μm 필터, 18G 바늘 및 멸균 장갑 한 쌍을 포함하여 mACS 추출을 위한 재료를 준비합니다(그림 2).
알림: 수술대는 무균 환경을 보장하기 위해 75% 알코올로 닦아야 합니다. 원심 분리 후 상청액은 이미 mACS의 반제품입니다. - 튜브 랙에 6개의 튜브를 놓고 원심분리가 완료된 후 캡을 엽니다(그림 3D).
알림: 이 단계에서는 무균 상태가 필요하지 않습니다. - 멸균 장갑을 끼고 18G 바늘이 달린 3mL 주사기를 사용하여 mACS를 하나씩 빼냅니다.
알림: 이 단계에서 하부 혈구층을 그리지 않도록 주의하십시오(그림 3E). - 바늘을 당겨 0.22μm 필터에 연결하고 23G, 1.5인치 채혈 바늘을 원래 3mL 주사기로 아래 배출구에 연결합니다(그림 3F).
- 0.22μm 필터를 통해 바늘을 준비된 멸균 점안액 병에 부드럽게 밀어 넣습니다(그림 3G).
- 모든 mACS가 여과되어 점안액병에 보관될 때까지 위의 단계를 반복합니다(그림 3H).
- 즉시 사용할 수 있도록 mACS 점안액을 4°C에서 보관하십시오. 장기 보존을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.
알림: 2°C에서 4주 이상 보관하거나 -3°C에서 20개월 이상 보관하지 마십시오 9,19.
3. 쥐 각막 상피의 생체 외 상처 치유 모델
참고: 다음 생체 외 동물 모델은 각막 상피의 기계적 손상에 대한 Hung et al.의 이전 경험을 기반으로 합니다20. 다음 단계는 잘 제한되고 일관된 각막 상피 상처를 만들기 위해 현미경으로 수행해야 합니다.
- C57BL/6 마우스를 3%-4% 이소플루란으로 마취합니다. 쥐 중심 각막 위에 피부 생검 펀치를 움푹 들어가게 하여 상피에 균일한 상처 여백으로 얕은 원을 남깁니다.
알림: 안구 파열이 발생하지 않도록 부드럽게 하십시오. - 0.5mm 버가 장착된 각막 녹 고리 제거제를 사용하여 확인된 부위 내의 각막 상피를 Bowman's layer까지 괴사제거합니다.
- 기계적 각막 상처의 생체 외 동물 모델을 확립하기 위해 안구를 채취하고 배양을 잘 준비합니다.
- 먼저 생쥐를 안락사시킨다. 그런 다음 생쥐의 상부 및 하부 안와 테두리를 부드럽게 누르고 집게의 끝을 구후 공간 위에 삽입하고 안구를 빼내고 집게로 잡습니다.
- 각막 가위로 시신경과 안와 주위 연조직을 절단하여 안구를 완벽하게 분리합니다.
- 내부에 녹은 왁스가 들어있는 96 웰 플레이트를 준비하십시오. 집게의 끝을 사용하여 둥근 구멍을 빠르게 만든 다음 응고를 기다립니다.
- 테스트할 배지를 준비합니다: 0.5% mACS, 비교를 위한 0.5% AS, 음성 대조군으로서 생리 식염수, 및 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM).
참고: mACS는 위에서 언급한 프로토콜을 사용하여 얻습니다. - 생체 외 배양을 위해 수확한 안구를 준비된 96웰 플레이트에 놓습니다. 각 배지 200μL를 96웰 플레이트에 추가합니다.
- 96-웰 배양 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 넣는다. 배양 배지가 24시간마다 교체되는지 확인합니다.
- 순차적인 상처 치유 효과를 확인하기 위해 플루오레세인 염색을 통해 현미경으로 8시간마다 상피 상처 부위를 모니터링합니다.
- fluorescein 종이에 fluorescein을 일반 식염수로 녹입니다.
- 플루오레세인 염료를 쥐의 중앙 각막에 떨어뜨린 다음 현미경으로 관찰하고 문서화합니다. 일반적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다.
참고: 플루오레세인 염료 한 방울(약 0.05mL)이면 관찰에 충분합니다.
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Representative Results
그림 1과 그림 2는 실험에 필요한 재료를 보여주고, 그림 3은 mACS 준비 중 순차적인 단계와 성공적인 중간 생성물을 보여줍니다. 먼저, 0.5 mL의 10% 글리세롤 용액을 각 10 mL 멸균 시험관에 넣었다(도 3A). 그런 다음 환자로부터 60-70mL의 정맥혈을 채취하고 10mL의 혈액을 각 튜브에 주입했습니다(그림 3B). 환자의 혈액은 혈액의 질이 표준에 부합하는지 확인하기 위해 준비하기 전에 철저하고 정기적 인 실험실 검사를 받아야합니다. 가장 흔한 저품질 혈액 제제는 이상지질혈증으로 인한 것이며, 이는 원심분리 후 제거하기 어려운 혈청의 상층이 흐려지는 결과를 낳습니다. 점안액의 추가 준비는 계속할 수 없습니다 (그림 5A).
그런 다음 밀봉된 테스트 튜브를 37°C의 인큐베이터에 4시간 동안 배치합니다(그림 3C). 배양 및 원심분리 후, 샘플은 mACS의 예비 생성물을 포함하는 상부 층과 하부 혈액 세포층으로 분리될 수 있었다(도 3D). 이어서, 상층 유체를 수집하였다. 무균 기술은 앞으로 필수적입니다. 혈청은 미생물의 영양가가 매우 높은 번식 환경이기 때문에 바늘과 접촉하는 모든 표면은 먼저 75% 알코올로 소독해야 하며 이 과정에서 멸균 장갑을 사용해야 합니다. 중요한 것은 상층액을 제거할 때 하층에서 혈액 세포의 교란을 피해야 한다는 것입니다(그림 3E).
이 단계에서, 상청액은 투명하거나 옅은 황색일 것으로 예상된다. 그러나 약간의 붉은 색이 보이면 용혈이 발생했을 수 있으며 제제가 후속 단계에 적합하지 않을 수 있습니다 (그림 5B). 수집된 혈청은 상층액에 적혈구가 없는지 확인하기 위해 다시 원심분리될 수 있습니다. 혈청을 0.22μm 필터를 통해 멸균 점안액 병으로 여과했습니다(그림 3F, G). 최종 제품인 mACS 점안액은 목적에 따라 가능한 한 빨리 냉장 또는 냉동되었습니다(그림 3H). 점안액은 불안정한 영양소가 풍부하고 방부제가 부족하기 때문에 너무 오래 보관할 수 없습니다.
생체 외 표면 치유 모델에서 mACS 점안액은 AS 점안액에 비해 각막 상처 치유에서 우수한 결과를 보였다. C57BL/6 마우스의 안구 채취는 현미경으로 물리적 마모에 의해 동심원 각막 상처를 만든 후 수행되었습니다. 이어서, 희생된 마우스를 순수 생리 식염수, DMEM, 0.5% AS 및 0.5% mACS를 포함하는 4개의 상이한 배지에서 배양하였다.
여기에 사용된 AS 배지는 문헌21 및 린커우 창궁기념병원에서의 임상실습에 기초하여 제조하였다. 총 40mL의 정맥혈을 피부 살균 후 지원자로부터 진공 튜브로 채취했습니다. 항응고제는 튜브에 첨가되지 않았습니다. 이어서, 혈액을 실온에서 30분 동안 보관하여 완전한 응고를 보장한 후, 3,500 × g 에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 순수한 AS가 튜브의 상층을 차지하고, 이를 생체외 동물모델에서 BSS(멸균 관개 용액)로 0.5%로 희석하였다.
각막 상처는 6개의 상이한 시점, 즉 0, 8, 16, 24, 32 및 48시간에서 순차적으로 관찰되었다. 예비 결과는 16 시간에서 각막 상처가 다른 그룹보다 0.5 % mACS 점안액 하에서 더 빨리 치유되는 것으로 나타났습니다. 24시간에, 0.5% AS 및 DMEM 그룹은 0.5% mACS 점안액과 유사한 치료 효과를 나타냈다. 완전 회복에 가까운 각막 상처의 치유는 정상 식염수 그룹을 제외하고 32시간째에 관찰되었습니다(그림 4).
그림 1: 튜브에 10% 글리세롤 용액을 첨가하는 데 필요한 재료 . (A) 나비 날개 주입 세트 21g. (b) 10% 글리세롤 용액 250mL. (C) 헤파린 158 USP 단위를 포함하는 6개의 10mL 진공청소기 튜브. (D) 3.0mL 주사기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈액 샘플의 상청액을 추출하고 여과하기 위한 재료 . (A) 0.22μm 필터. (B) 5mL 멸균 점안액병. (C) 멸균 장갑 한 켤레. (D) 23G 바늘이 있는 3mL 주사기. (E) 20mL 주사기. (F) 바늘 18g. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 변형된 자가 컨디셔닝 혈청 점안액 생산을 위한 혈액 원심분리 및 준비 절차 . (a) 0.5 mL의 10% 글리세롤 용액을 각 시험관에 넣었다. (B) 환자로부터 채취한 혈액 샘플을 6개의 시험관(이미지에 표시된 것만)으로 균등하게 분할하였다. (c) 37°C 배양기에 4시간 동안 두었던 후의 시험관의 모습. (d) 원심분리 후의 혈청 및 혈구층. (E) 상층액을 흡인 후 잔류한다. 하부 혈구층을 흡인하지 않도록 주의해야 합니다. (F) 3mL 주사기에 상층액을 채취하고, 그 아래에 0.22μm 필터와 23G 바늘을 삽입한다. (G) 바늘을 멸균 점안액 병에 부드럽게 밀어 넣습니다. (h) 변형된 ACS 점안액의 최종 산물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시간 경과에 따른 4개의 서로 다른 배양 배지에서 쥐 눈의 각막 상처(플루오레세인 염색 후 그림의 녹색 영역)의 순차적 변화. 식염수 군에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, DMEM, 0.5% AS 및 0.5% mACS 군에서는 시간 경과에 따른 상처 치유(화살표)가 관찰되었습니다. 0.5% mACS 그룹에서, 상처 치유 (화살표)는 AS 및 DMEM으로 치료한 것보다 16시간에서 유의하게 더 완전하였다. 24시간에, DMEM, 0.5% mACS, 및 0.5% AS 그룹은, 특히 mACS 그룹에서 추가적인 치유 효과를 나타내었다(화살표). 식염수 그룹을 제외한 모든 그룹에 대해 32시간에서 거의 완전한 회복이 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 원심분리 후 불량한 혈액 제제의 예 . (A) 이상지질혈증. 가장 흔한 결함 제품은 비만이나 당뇨병으로 인한 것인데, 상부 혈청에는 고지방과 콜레스테롤이 포함되어 있기 때문입니다. (B) 용혈. 이것은 또한 일반적인 차선의 제품입니다. 주된 이유는 채혈을 위해 작은 구멍 바늘을 사용하거나 혈액 제제를 주입 할 때 부적절한 외력을 사용하기 때문일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 mACS를 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고 동물 모델의 상처 치유에서 mACS 점안액의 이점을 추가로 보여줍니다. 이 mACS 프로토콜의 중요한 수정은 각 시험관에 약 0.5mL의 10% 글리세롤 용액을 첨가하여 37°C에서 4시간 배양하는 동안 적절한 저산소 조건을 생성하는 것입니다. 이 설정은 AS에 적절한 스트레스를 제공하고 세포가 상처 치유에 도움이 되는 필요한 성장 인자를 분비하도록 유도합니다. 0.22μm 필터는 고분자 단백질, 혈액 세포 및 불순물을 제거하여 최종 제품을 순수하고 접착력이 떨어지게 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
혈액을 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 추가의 원심분리 및 여과를 수행한다. 적절한 온도에서 최종 제품을 준비하고 보관하는 동안 무균에 대한 엄격한 주의도 중요합니다. 최종 혈청 제품의 높은 영양소 함량은 박테리아에 대한 우수한 배양 배지입니다. 따라서 준비 중 부적절한 보관 또는 오염은 점안액을 망칠 수 있습니다. 오염된 mACS는 결막염이나 감염성 각막염과 같은 질병을 유발할 수 있습니다.
환자의 혈액의 질도 중요합니다. 따라서 혈액 제제의 안전성을 보장하기 위해 mACS를 준비하기 전에 실험실 검사가 필요합니다. 채취 중 및 환자의 혈액 샘플을 조작할 때 작업자는 용혈에 대해 알고 있어야 합니다. 준비 중 압력이 가해지면 쉽게 용혈을 일으킬 수 있습니다. 따라서 채혈 중에 주사기를 천천히 당기고 밀어야 합니다. 저산소증은 또한 고농도의 성장 인자와 항염증성 사이토카인을 얻기 위해 조절되어야 합니다. 경험과 이전에 발표된 연구22,23에 따르면 4시간 저산소 배양의 적용이 궁극적인 설정입니다. 글리세롤은 안정화 효과와 적절한 삼투성 세포외액 압력으로 인해 세포에 더 적합한 저산소 스트레스를 제공할 수 있다18. 그러나 글리세롤의 최적 농도와 사이토카인 농도와 어떤 상관관계가 있는지 확인해야 합니다. 앞으로 상처 치유에 대한 생체 내 동물 연구와 그 효능을 확인하기 위해 대규모 무작위 대조 시험이 필요할 것입니다.
지금까지 연구는 주로 전통적인 AS와 새로운 PRP 점안액24,25,26,27을 사용하여 안구 표면 질환에 혈청 제품을 적용하는 데 중점을 두었습니다. 항응고제가 없고 준비 중에 필터를 사용하지 않는 전통적인 AS는 순수한 형태의 호박색이지만 접착력으로 인해 환자를 불편하게 만드는 경우가 많습니다. 결과적으로 희석된 AS(20%-50%)가 일반적으로 사용되어 영양소의 농도를 낮춥니다. 그러나 PRP는 접착력이 낮고 일반적으로 순수한 형태(100%)로 사용됩니다. 최근 문헌 보고에 따르면 PRP는 주로 항염증 사이토카인, 성장 인자 및 IL-1β 유발 염증을 약화시키는 능력으로 인해 AS보다 더 나은 항염증 및 상처 치유 효과를 제공한다고 지적합니다16,26. García-Conca et al.이 실시한 무작위 대조 시험에서는 중증 또는 중등도의 분비성 건조증 질환에 PRP를 적용하면 만족스러운 결과가 나타난다는 사실이 이미 밝혀졌다28. ACS는 AS에 비해 개선된 것으로서, 염증성 및 퇴행성 안구 표면 질환에서 거의 보고되지 않았지만, 정형외과에서 퇴행성 관절염 및 상처 치유의 치료에 널리 사용되어 왔다 29,30,31. 가장 일반적인 ACS는 상용 키트13,32로 제조되고 특허를 받았습니다. mACS는 ACS와 PRP의 장점을 결합하기 위해 ACS 준비 과정을 조정한 후 설계되었습니다. mACS는 ACS와 PRP의 제조에 필요한 CrSO4 코팅 유리 비드 또는 특허 키트와 같은 특수 시약이 필요하지 않기 때문에 보다 경제적인 비용으로 생산할 수 있습니다.
경제적 우려 외에도 mACS 점안액은 생체 외 실험에서 만족스러운 예비 결과를 제공했으며 현재 부상하는 PRP 점안액에 대한 혁신적인 대안이 될 수 있습니다. 주목할 점은, ACS는 항염증 능력과 개선된 내인성 복구 메커니즘으로 인해 염증성 관절 질환에서 질적, 양적으로 대부분의 확립된 치료법보다 더 나은 결과를 입증했다는것입니다 17. 현재까지 안과에서 ACS의 치료 효과에 대한 문헌 증거는 없지만, 항염증 메커니즘과 정형외과에서의 성공으로 인해 각막 상피 결손이 있는 환자에게 ACS를 적용할 가능성을 가정하는 것이 합리적이다33. 생체 외 연구에서 AS만 mACS와 비교되었습니다. 그러나 상용 키트를 통해 생산된 PRP와 ACS도 비교할 수 있습니다. mACS에서 항염증성 사이토카인 및 성장 인자의 혈청 수준을 분석하는 향후 연구는 ACS 또는 PRP와의 유사성 및 AS에 대한 잠재적 우월성을 확인하는 데 유용할 것입니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 훌륭한 기술 지원을 해준 Ya-Lan Chien과 Chia-Ying Lee, 그리고 언어판에 대해 OnLine English 회사에 감사드립니다. 이 연구는 Chang Gung Medical Research Project(보조금 번호 CMRPG3L1491)에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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