Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sanntidsmåling av den mitokondrielle bioenergetiske profilen til nøytrofiler

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Vi beskriver trinnvise protokoller som måler mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler og HL60-celler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator.

Abstract

Neutrofiler er den første forsvarslinjen og de rikeste leukocytter hos mennesker. Disse effektorcellene utfører funksjoner som fagocytose og oksidativt utbrudd, og skaper nøytrofile ekstracellulære feller (NET) for mikrobiell clearance. Ny innsikt i nøytrofilenes metabolske aktiviteter utfordrer det tidlige konseptet om at de primært er avhengige av glykolyse. Nøyaktig måling av metabolske aktiviteter kan utfolde forskjellige metabolske krav til nøytrofiler, inkludert trikarboksylsyre (TCA) -syklusen (også kjent som Krebs-syklusen), oksidativ fosforylering (OXPHOS), pentosefosfatvei (PPP) og fettsyreoksidasjon (FAO) under fysiologiske forhold og sykdomstilstander. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll og forutsetninger for å måle oksygenforbrukshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell respirasjon på nøytrofiler fra benmarg fra mus, humane blodavledede nøytrofiler og den nøytrofillignende HL60-cellelinjen, ved bruk av metabolsk fluksanalyse på en metabolsk ekstracellulær fluksanalysator. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere mitokondrielle funksjoner av nøytrofiler under normale og sykdomsforhold.

Introduction

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellebioenergetikk, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oksidativ fosforylering (OXPHOS). I tillegg til dette strekker mitokondriens rolle seg inn i generering og avgiftning av reaktive oksygenarter, cytoplasmatisk og mitokondriell matrikskalsiumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport av metabolitter i cellen1. Mitokondriell respirasjon er viktig i alle celler, da deres dysfunksjon kan resultere i metabolske problemer 2, inkludert kardiovaskulære sykdommer3 og et bredt spekter av nevrodegenerative sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon4, Parkinsons og Alzheimers sykdommer5 og Charcot-Marie-Tooth sykdom2 A (CMT2A) 6.

Elektronmikroskopiske studier på nøytrofiler viste at det er relativt få mitokondrier7, og de er avhengige av glykolyse for energiproduksjonen, da mitokondriell respirasjonsfrekvens er svært lav8. Imidlertid er mitokondrier avgjørende for nøytrofile funksjoner, som kjemotaksis9 og apoptose10,11,12. En tidligere studie avslørte et komplekst mitokondrielt nettverk i humane nøytrofiler med høyt membranpotensial. Mitokondriemembranens potensielle tap er en tidlig indikator på nøytrofil apoptose10. Behandling med mitokondriell utkobling av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hemming i kjemotaksis, sammen med endring i mitokondriell morfologi 9,10.

Selv om den primære energikilden for nøytrofiler er glykolyse, gir mitokondrier ATP som initierer nøytrofil aktivering ved å brenne den første fasen av purinerg signalering, noe som øker Ca2 + -signalering, forsterker mitokondriell ATP-produksjon og initierer nøytrofile funksjonelle responser13. Dysfunksjon av mitokondrie-respirasjonskjeden resulterer i overdreven produksjon av giftige reaktive oksygenarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er prosessen med å danne nøytrofile ekstracellulære feller (NET), er en kritisk egenskap hos nøytrofiler som hjelper dem med å bekjempe patogener17 og bidrar til mange patologiske forhold, inkludert kreft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrie-avledet ROS bidrar til NETosis19, mitokondrielt DNA kan være en komponent i NET18, og endret mitokondriell homeostase svekker NETosis 20,21,22,23,24. Videre, under normal differensiering eller modning, blir nøytrofil metabolsk omprogrammering reversert ved å begrense glykolytisk aktivitet, og de engasjerer seg i mitokondriell respirasjon og mobiliserer intracellulære lipider25,26.

Den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren kan kontinuerlig overvåke og kvantifisere levende celle mitokondriell respirasjon og glykolyse. Analysatoren benytter en 96-brønns plateformat sensorpatron og to fluoroforer for å kvantifisere oksygenkonsentrasjon (O2) og pH-endringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm høyt mikrokammer. De optiske fiberbuntene i analysatoren brukes til å opphisse fluoroforene og oppdage fluorescerende intensitetsendringer. Sanntidsendringer iO2-konsentrasjon og pH beregnes automatisk og vises som oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Det er fire porter på sensorkassetten som tillater lasting av opptil fire forbindelser i hver brønn under analysemålingene. Denne protokollen fokuserer på å kvantifisere mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler, samt de nøytrofillignende HL60-cellene, ved hjelp av den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserte fullblodsprøver ble innhentet fra friske humane donorer etter å ha innhentet informert samtykke, som godkjent av Institutional Review Board of UConn Health i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle dyreforsøk fulgte UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer, og godkjenning for bruk av gnagere ble innhentet fra UConn Health IACUC i henhold til kriterier som er skissert i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health. Hannmus C57BL/6 ved 6 ukers alder ble brukt i denne studien.

1. Fremstilling av 96-brønnplaten for metabolsk ekstracellulær fluksanalyse

  1. En sensorpatron er pakket på toppen av den spesialdesignede 96-brønnsplaten for metabolsk ekstracellulær fluksanalyse. Hydrater sylinderampullen ved å løfte den forsiktig, og plasser 200 μL/brønn kalibreringsmedium i hver brønn på den underliggende platen. Plasser sylinderampullen over platen med kalibrant i en ikke-CO2, fuktet, 37 ° C inkubator over natten for å hydrere.
  2. Basert på celletypen, bruk et spesifikt belegg for kulturplaten for å sikre celleadhesjon. For humane nøytrofiler - udifferensierte og differensierte HL60-celler - belegger 96-brønnsplaten med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 50 μL av 5 μg / ml renset mus anti-humant CD18 antistoff (klon TS1 / 18) ved 4 ° C over natten. For nøytrofile mus, belegg 96-brønnsplaten med 25 μL på 22,4 μg / ml celletak ved pH 8,0 i 0,1 M NaHCO3 ved romtemperatur (RT) i 20 minutter.
  3. Vask platene med 200 μL steril PBS to ganger.
  4. Legg komplett medium til hjørnebrønnene (A1, A12, H1 og H12) på cellekulturplaten (uten celler) for bakgrunnskorreksjon i cellekulturplatene under såing.
    MERK: Fordampning under belegging og kalibrering kan påvirke volumet på kalibreringsmediet og normalisering. Bruk et brett eller kammer med sterilt vannfuktet vev og plasser platen med kaliberet over for å forhindre fordampning.

2. Forberedelse og såing av celler

  1. Fremstilling av analysemedium
    1. Forbered analysemedium ved å tilsette 1 mM pyruvat, 10 mM glukose og 2 mM glutamin til Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM).
  2. Isolering av nøytrofiler fra mus fra benmarg
    1. Isoler nøytrofile mus fra benmarg ved hjelp av musens nøytrofile berikelsessett, i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Bedøv musene ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av ketamin (125 mg / kg) og xylazin (12,5 mg / kg) og deretter avlive musene ved cervikal dislokasjon.
    3. Høst lårbenene og tibias, som beskrevet tidligere27. Klipp huden kort for å eksponere benet med musklene. Klipp hofteleddet for å fjerne benet fra kroppen. Fjern deretter musklene for å samle lårben og tibia.
    4. Klipp de mindre endene av lårbenene og tibiasene. Hold kuttendene nede, plasser dem i et 0,5 ml sentrifugerør med to 25 G sprøytenålstansede hull i bunnen, og plasser 0,5 ml røret i et 1,5 ml sentrifugerør (figur 1A). Tilsett 50 μL PBS i 0,5 ml røret for å forhindre tørking av benmargceller.
    5. Sentrifuge ved 5,900 × g ved RT i 15 s for å samle benmargen i bunnen av 1,5 ml røret. Resuspender benmargscellene med 1 ml DMEM. Tilsett 50 μL rotteserum fra settet, bland forsiktig ved pipettering, og overfør cellesuspensjonen til et 5 ml polystyrenkulturreagensrør.
    6. Tilsett 50 μL anrikningscocktail fra Mouse Neutrophil Enrichment Kit og rug i 15 minutter ved RT. Sentrifuge ved 300 × g ved RT i 5 minutter.
    7. Resuspender cellene med 1 ml DMEM, tilsett 50 μL biotinvalgscocktail fra settet, bland forsiktig med pipettering og inkuber i 15 minutter ved RT.
    8. Tilsett 150 μL virvelbaserte magnetpartikler fra settet, bland forsiktig ved pipettering og inkuber i 10 minutter ved RT.
    9. Tilsett ~1,3 ml DMEM, bland forsiktig med pipettering, plasser røret i magneten i 3 minutter, og overfør supernatanten som inneholder rensede nøytrofiler fra mus til et nytt 5 ml polystyrenkulturreagensrør ved å snu det opprinnelige røret sammen med magneten.
    10. Sentrifuge ved 300 × g ved RT i 5 min. Etter fjerning av supernatanten ved vakuumaspirasjon, resuspenderes cellene med 1 ml analysemedium.
    11. Telle cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer.
    12. Juster celletettheten til 1,1 × 106 celler / ml ved å legge til analysemedium, frø 180 μL av musens nøytrofile suspensjon (2 × 105 celler) per brønn i den forberedte 96-brønnsplaten (trinn 1,2-1,4), og sentrifuger platen ved 300 × g ved RT i 3 minutter uten brems for å sikre riktig festing av cellene på bunnen av platen.
    13. Inkuber platen i en ikke-CO2, fuktet, 37 ° C inkubator i 1 time for å preequilibrere cellene med analysemediet.
      MERK: Renheten til nøytrofilene er kritisk for analysen siden det er en potensiell skjevhet. Renheten av musens nøytrofile isolasjon er 69,9% -88,7% ved denne protokollen. Det finnes andre metoder for å isolere nøytrofiler fra musebenmarg, for eksempel tetthetsgradientsentrifugering28. Det finnes også alternative nøytrofile isolasjonssett fra andre leverandører, basert på det negative magnetiske utvalget ved bruk av monoklonale antistoffer mot antigener som ikke uttrykkes på nøytrofiler.
  3. Isolering av humane nøytrofiler fra perifert blod
    1. Tilsett 8 ml polysakkaridoppløsning i et 15 ml sentrifugerør, legg deretter over 4 ml perifert blod på toppen av polysakkaridoppløsningen uten blanding.
    2. Sentrifuge ved 550 × g ved 20 °C i 30 minutter. Få rotoren til å bremse ned ved 1.
      MERK: Den nøytrofile separasjonstiden kan variere mellom donorer. Det er minimum 30 minutter, og ytterligere 10-20 min kan være nødvendig hvis nøytrofil separasjon ikke lykkes.
    3. Observer separasjonen av plasma/trombocytter og mononukleære celler etter sentrifugeringen, som vist i figur 1B. Fjern forsiktig den øvre gule væsken på toppen (plasma og blodplater) og det øvre uklare båndet (mononukleære celler) uten å forstyrre det nedre uklare båndet (nøytrofiler) ved hjelp av en 1 ml pipette.
    4. Samle det nedre uklare båndet og ~3-4 ml av den klare væsken nedenfor i et nytt 15 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml PBS.
    5. Sentrifuger ved 400 × g ved 20 °C i 10 minutter og fjern supernatanten ved vakuumaspirasjon.
    6. Resuspender cellene med 5 ml PBS og sentrifuge ved 300 × g ved 20 °C i 5 minutter.
    7. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspender cellene med 1 ml analysemedium.
    8. Telle cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer.
      MERK: Siden erytrocytter i blodet ikke har mitokondrier, påvirker ikke erytrocyttforurensning mitokondriestresstestanalysen og forhindrer nøytrofil aktivering / priming29,30. Erytrocytter må lyseres under celletelling for å få en nøyaktig nøytrofil konsentrasjon. Tilsett 10 μL av cellesuspensjonen til 891 μL avionisert vann i 10-30 s for å lyse erytrocytene, tilsett deretter 99 μL 10x PBS for å balansere det osmotiske trykket, unngå lysis av nøytrofilene.
    9. Juster celletettheten til 2,2 × 106 celler/ml ved å tilsette analysemedium, frø 180 μL humane nøytrofiler (~4 × 105) per brønn inn i den preparerte 96-brønnsplaten, og sentrifuger platen ved 300 × g ved RT i 3 minutter uten brems for å sikre riktig festing av cellene på bunnen av platen.
    10. Inkuber platen i en ikke-CO2, fuktet, 37 ° C inkubator i 1 time for å preequilibrere cellene med analysemediet.
      MERK: Renheten av nøytrofiler er kritisk for analysen siden det er en potensiell skjevhet. Renheten av human nøytrofil isolasjon er 86,6% -96,8%. Det finnes andre sentrifugeringsmetoder for tetthetsgradient for isolering av nøytrofiler fra humant blod, inkludert Percoll-isolasjon samt en kombinasjon av Ficoll-isolasjon og dekstransedimentering31.
  4. HL60 cellekultur og nøytrofilrettet differensiering
    1. Opprettholde HL60-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-medium som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og 250 ng / ml amfotericin B ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. For nøytrofilrettet differensiering, oppretthold HL60-cellene (suspenderte celler) i en T25-kolbe med en tetthet på 1 × 10 5 celler / ml i RPMI-1640-medium inneholdende 10% FBS, 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 250 ng / ml amfotericin B og 1,3% dimetylsulfoksid (DMSO) ved 37 ° C og5 % CO2 i 6 dager.
    3. På analysedagen, telle cellene manuelt ved hjelp av hemocytometer, sentrifuge differensierte eller udifferensierte HL60 celler ved 300 × g ved RT i 5 minutter, vask med DMEM en gang, og resuspendere cellene med analysemediet for å få en celletetthet på 1,39 × 106 celler / ml.
    4. Frø 180 μL differensierte eller udifferensierte HL60-celler (~ 2,5 × 105) per brønn inn i den forberedte 96-brønnsplaten og sentrifugerer platen ved 300 × g ved RT i 3 minutter uten brems for å sikre riktig festing av cellene på bunnen av platen.
    5. Inkuber platen i en ikke-CO2, fuktet, 37 ° C inkubator i 1 time for å preequilibrere cellene med analysemediet.
      MERK: Bekreft fullstendig vedheft av celler ved hjelp av et mikroskop før neste trinn.

Figure 1
Figur 1 Skjematisk diagram over isolering av benmargsceller og nøytrofile celler. (A) Høsting av benmargceller fra en mus og (B) isolering av nøytrofiler fra humant blod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Celletype Celler per brønn Forbindelser/reagenser Konsentrasjon av arbeidsløsning Injeksjonsvolum til porter Endelig konsentrasjon i brønner
Mus nøytrofiler 2 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Rotenon Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM
Menneskelige nøytrofiler 4 × 105 Oligomycin 10 μM 20 μL 1 μM
FCCP 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Rotenon Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM
Udifferensierte eller differensierte HL60-celler 2,5 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 15 μM 22 μL 1,5 μM
Rotenon Antimycin En blanding 10 μM 24 μL 1 μM

Tabell 1: Celletall og reagenskonsentrasjoner for mitokondriestresstesten.

3. Klargjøre forbindelser i mitokondriestresstestsettet

  1. Åpne mitokondriell stresstestsettet og klargjør reagensene.
    MERK: De forskjellige konsentrasjonene av arbeidsløsningen, injeksjonsvolumet i brønnene og endelige konsentrasjoner i brønnene til oligomycin, karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) og rotenon/antimycin En blanding brukt for nøytrofile mus, humane nøytrofile celler og HL60-celler er vist i tabell 1.
    1. Tilbered oligomycin stamløsning ved å rekonstituere oligomycin med 630 μL analysemedium for å oppnå en 100 μM stamløsning.
      MERK: Det anbefales å bruke lagerløsningen samme dag.
      1. Forbered oligomycin-arbeidsløsning for nøytrofile muse- og HL60-celleanalyser ved å blande 630 μL stamløsning med 1,890 μL analysemedium for å oppnå en 25 μM arbeidsløsning.
      2. Forbered oligomycinarbeidsløsning for den humane nøytrofile analysen ved å blande 300 μL stamoppløsning med 2,700 μL analysemedium for å oppnå en 10 μM arbeidsløsning.
        MERK: Bindingen av oligomycin til Fo-baseplate-underenheten til Fo / F1 ATPase (ATP-syntase) forhindrer gjeninnføring av protoner i mitokondrier og hemmer ATP-syntese32. Dette reduserer elektronstrømmen betydelig gjennom elektrontransportkjeden og OCR. Elektronstrømmen stopper imidlertid ikke helt på grunn av protonlekkasje over den indre mitokondriemembranen33.
    2. Klargjør FCCP-stamløsning ved å rekonstituere FCCP med 720 mikrol analysemedium for å oppnå en 100 μM stamløsning.
      1. Forbered arbeidsløsning for musenøytrofilanalysen ved å blande 300 μL stamoppløsning med 3,700 μL analysemedium for å oppnå en 7,5 μM arbeidsløsning.
      2. Forbered arbeidsløsning for den humane nøytrofile analysen ved å blande 375 μL stamoppløsning med 2,625 μL analysemedium for å oppnå en 12,5 μM arbeidsløsning.
      3. Forbered arbeidsløsning for HL60-celleanalysen ved å blande 720 μL stamløsning med 4,080 μL analysemedium for å oppnå en 15 μM arbeidsløsning.
        MERK: Tilsetningen av FCCP avslører mitokondrienes maksimale kapasitet til å bruke OXPHOS. Det er en lipidløselig, svak syre gjennomtrengelig for mitokondrier resulterer i dissipitering av transmembranpotensial. Utslipp av protongradienten over mitokondriell indre membran og avledning av protonfluksen fra Fo / F1 ATP-syntase resulterer i mitokondriell frakobling. Denne frakoblingseffekten øker brått mitokondrielt oksygenforbruk for å bevare protongradienten34.
    3. Klargjør rotenon/antimycin A-stamløsning ved å rekonstituere rotenon/antimycin A-blandingen med 540 μL analysemedium for å oppnå en 50 μM stamløsning.
      1. Forbered rotenon / antimycin En arbeidsløsning for alle analyser ved å blande 540 μL stamløsning med 2,160 μL analysemedium for å oppnå en 10 μM arbeidsløsning.
        MERK: Rotenon blokkerer kompleks I ved å hemme elektronoverføring fra jern-svovelsentrene i kompleks I til ubiquinon, mens antimycin A blokkerer kompleks III i elektrontransportkjeden, noe som fører til en blokade av OXPHOS med en begrenset syntese av ATP35. Dermed avslører dette ikke-mitokondriell respirasjon36,37.
  2. Legg patronen med reagenser; last klargjort oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A-blanding i henholdsvis A-, B- og C-portene i sylinderampullen til injeksjonsvæsker (figur 2). Bruk malinnsatsen som er tilgjengelig sammen med kassetten for å lette lasting av reagenser til portene. Fyll de ubrukte portene med 20 μL analysemedium.
    1. For musens nøytrofile analyse, last 20 μL oligomycin (25 μM; hver brønn i 96-brønnplaten har 180 μL analysemedium i begynnelsen, slik at den endelige konsentrasjonen er 2, 5 μM) i A-portene. Last inn 17,6 μL FCCP (7,5 μM; endelig konsentrasjon: ~0,61 μM) i B-portene. Legg 24 μL rotenon / antimycin A-blanding (10 μM; endelig konsentrasjon: ~ 1 μM) inn i C-portene.
    2. For den humane nøytrofile analysen, last 20 μL oligomycin (10 μM; hver brønn i 96-brønnplaten har 180 μL analysemedium i begynnelsen, slik at den endelige konsentrasjonen er 1 μM) i A-portene. Last inn 22 μL FCCP (12,5 μM; endelig konsentrasjon: ~1,25 μM) i B-portene. Legg 24 μL rotenon / antimycin A-blanding (10 μM; endelig konsentrasjon: ~ 1 μM) inn i C-portene.
    3. For HL60- og dHL60-celleanalysen, last 20 μL oligomycin (25 μM; hver brønn i 96-brønnplaten har 180 μL analysemedium i begynnelsen, slik at den endelige konsentrasjonen er 2,5 μM) inn i A-portene. Last inn 22 μL FCCP (15 μM; endelig konsentrasjon: ~1,5 μM) i B-portene. Legg 24 μL rotenon / antimycin A-blanding (10 μM; endelig konsentrasjon: ~ 1 μM) inn i C-portene.
      MERK: Pipetter legemiddeloppløsningen i porten uten å berøre bunnen av porten. Ikke bank på platen etter lasting for å unngå lekkasje, da væskene holdes av kapillærkreftene. Bakgrunnsbrønnene på kulturplaten og portene på sensorpatronen er lastet med analysemedium eller med samme port for lasting av reagenser som i prøvebrønnene for å normalisere effekten av reagenser på bakgrunnsverdiene. Reagensene må tilsettes de respektive portene uten å løfte kassetten fra den kalibrantholdige verktøyplaten for å unngå luftfelling. Fyll den siste porten av alle brønnene med mediet som vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Mitokondriell stressanalysepatron og deres injeksjonsporter. Bildet viser patronen til mitokondriespenningsanalysen og et forstørret bilde som viser lasting av individuelle legemidler/medium til portene. Forkortelse: FCCP = karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Kjører mitokondriell stressanalyse

  1. Slå på metabolsk analysator og datamaskin, åpne Wave programvare, og klikk på Heater On for å sette opp maskinen på 37 ° C minst 5 timer på forhånd. Etter å ha nådd temperaturen, viser nedre venstre hjørne av bølgeprogramvaren klar.
  2. Åpne en mal for mitokondrielt stressanalysesett i programvaren. Klikk på Gruppedefinisjon i den øverste menylinjen.
  3. Separat forhåndsinnstilt hver definisjon på venstre side, for eksempel injeksjonsstrategier, forbehandlinger, analysemedier og (biomateriale brukt) celletyper.
  4. Klikk på injeksjonsstrategier på venstre side, klikk deretter på Legg til og navngi injeksjonstilstanden som Humane nøytrofile / Musnøytrofile / HL60. Velg port A-D ved å klikke på hver og klikk på Legg til forbindelse og skriv inn Oligomycin / FCCP / Rotenone Antimycin A med de respektive konsentrasjonene (tabell 1).
  5. Klikk på forbehandling på venstre side, klikk deretter på Legg til og navngi dem som CD18 og Cell Tak separat. Klikk på biomaterialet som brukes på venstre side, klikk deretter på Legg til og navngi dem som Humane nøytrofiler, Musnøytrofiler og HL60 / dHL60 med såtetthet.
  6. Definer gruppene ved å klikke på Legg til gruppe (f.eks. for den humane nøytrofilanalysen) og ved å klikke på definisjonen som ligger til grunn (f.eks. Injeksjonsstrategier i henhold til tabell 1-Humane nøytrofiler, Forbehandling som CD18 og celletype som Humane nøytrofiler).
  7. Klikk på Platekart i toppmenyen for å observere alle gruppene, med definisjoner på venstre side og platekartet til høyre. Dra og slipp for å legge til hver brønn i gruppen mens du beholder de fire hjørnebrønnene som bakgrunn (standard).
  8. Sett opp protokollen ved å klikke på Protokoll i toppmenyen og definer tre sykluser med baseline, oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin A-blanding ved å sette tiden til Mix som 3 min, Hvil som 0 min og Måling som 7 min.
  9. Gå til Kjør analyse-siden , oppgi prosjektsammendragsinformasjonen for referanse, og klikk på Start kjøring.
  10. Gi plasseringen for å lagre filene, slik at alle resultatene lagres etter at analysen er fullført.
  11. Etter automatisk lasting av analysen, vent til skuffen åpnes for å plassere sensorkassetten og platen med 200 mikroliter kalibrant (trinn 1.1). Sett strekkoderetningen for patronen vendt mot høyre. Kjør kalibreringen ved å klikke på Jeg er klar, noe som tar ca. 20 min.
  12. Etter kalibreringen, klikk på Åpne skuff. Bytt ut platen med den cellefrøede platen og klikk på Load Cell Plate for å fortsette analysen.
  13. Etter at analysen er fullført, lagres dataene automatisk. Klikk på Se resultater og eksporter det som et regneark eller en annen analyseprogramvarefil.
  14. Graf og analyser dataene (figur 3 og figur 4).
  15. Beregn respirasjonsparametere, inkludert basal mitokondriell respirasjon, protonlekkasjebundet respirasjon, ATP-bundet respirasjon, maksimal respirasjon, ekstra respirasjonskapasitet og ikke-mitokondriell respirasjon (figur 4A) 38,39,40,41.
    1. Beregn basal mitokondriell respirasjon ved å trekke OCR-verdien målt etter tilsetning av rotenon / antimycin A-blanding fra OCR før injeksjon av oligomycin (figur 4A, a).
    2. Beregn protonlekkasjebundet respirasjon ved å trekke OCR-verdien etter rotenon/antimycin A-blandingsinjeksjon fra OCR-verdien målt etter oligomycininjeksjon (figur 4A,b).
    3. Estimere den ATP-koblede respirasjonen ved å beregne forskjellen mellom basal mitokondriell respirasjon og protonlekkasjebundet respirasjon. Trekk den første OCR-verdien målt etter oligomycininjeksjon fra den første OCR-verdien før oligomycininjeksjon (figur 4A,c).
    4. Maksimal respirasjon er den maksimale respirasjonshastigheten som en celle kan oppnå etter å ha lagt til FCCP. Beregn dette ved å trekke OCR-verdien etter rotenon/antimycin A-blandingsinjeksjon fra OCR-verdien målt etter FCCP-injeksjon (figur 4A,d).
    5. Ekstra respirasjonskapasitet refererer til kapasiteten til en celle for å møte det høyere energibehovet gjennom OXPHOS. Beregn dette ved å finne forskjellen mellom maksimal respirasjon og basal mitokondriell respirasjon (figur 4A, e).
    6. Ikke-mitokondriell respirasjon er mengden oksygen som forbrukes av ikke-mitokondrielle kilder. Mål dette etter tilsetning av rotenon/antimycin A-blanding (figur 4A,f).
  16. Utfør statistisk analyse ved hjelp av Student t-test for å sammenligne forskjellige respirasjonsparametere for udifferensierte og differensierte HL60-celler. Vurder p < 0,05 som statistisk signifikant.
    MERK: Replikater med OCR- eller EAR-verdier under null regnes som en feil i prøvepreparering, sammensatt injeksjon eller måling. De er ekskludert fra fremtidig analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativ OCR-dynamikk er vist som indikerer mitokondrielle respirasjonsendringer som respons på oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A-blanding av nøytrofile museceller (figur 3A), humane nøytrofile granulocytter (figur 3B) og udifferensierte og differensierte HL60-celler (figur 3C). I alle celler reduserer oligomycinbehandling OCR-verdien ved å hemme protonkanalen til ATP-syntase; FCCP-behandling gjenoppretter OCR-verdien ved å øke strømmen av elektroner og oksygenforbruk for å opprettholde membranpotensialet og oppnå maksimal respirasjon; og rotenon/antimycin En blandingsbehandling eliminerer mitokondriell respirasjon ved å blokkere kompleksene I og III i elektrontransportkjeden.

Vi observerte at etter nøytrofilrettet differensiering viste HL60-celler redusert mitokondriell respirasjon (figur 3C). Etter kvantifisering av ulike respirasjonsparametere, nevnt ovenfor, viste differensierte HL60-celler signifikant lavere basale mitokondriell (figur 4B) respirasjon, protonlekkasjebundet respirasjon (figur 4C), ATP-bundet respirasjon (figur 4D) og ikke-mitokondriell respirasjon (figur 4G). Maksimal respirasjon (figur 4E) i differensierte HL60-celler var økt, men ikke signifikant. Den ledige respirasjonskapasiteten (figur 4F) ble betydelig økt.

Figure 3
Figur 3: Representative grafer som viser de dynamiske endringene av OCR under mitokondriestresstestanalysen. (A) Gjennomsnittlig ± SD fra n = 3 replikater av nøytrofiler fra mus. (B) Gjennomsnittlig ± SD fra n = 3 replikater av humane nøytrofiler. (C) Gjennomsnittlig ± SD fra n = 3 replikater av udifferensierte (HL60, blå) og differensierte (dHL60, røde) HL60-celler. Forkortelse: OCR = oksygenforbruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Respirasjonsparametere hentet fra OCR-dynamikk. (A) Skjematisk som viser hvordan man beregner (a) basal mitokondriell respirasjon, (b) protonlekkasjebundet respirasjon, (c) ATP-bundet respirasjon, (d) maksimal respirasjon, (e) ledig respirasjonskapasitet og (f) ikke-mitokondriell respirasjon. (VG Nett) Gjennomsnittlig ± SD på n = 3; (B) basal mitokondriell respirasjon, (C) protonlekkasjebundet respirasjon, (D) ATP-bundet respirasjon, (E) maksimal respirasjon, (F) ledig respirasjonskapasitet og (G) ikke-mitokondriell respirasjon av udifferensierte (HL60) og differensierte (dHL60) HL60-celler. ns (ikke-signifikant) p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 ved uparet Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standardprosedyren som måler mitokondriell respirasjon av nøytrofiler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator er begrenset av mange faktorer, inkludert celleantall, cellevekst og levedyktighet. Hver sammensatt konsentrasjon varierer mellom type og kilde til celler i denne analysen. Oligomycin og rotenon/antimycin A brukes mest i en lignende konsentrasjon blant de fleste celletyper. Siden FCCP-indusert maksimal respirasjonsfrekvens varierer mellom forskjellige celler, er det imidlertid nødvendig med forsiktig titrering av FCCP for å optimalisere konsentrasjonen42. Det er også bedre å utføre sekvensielle tillegg av FCCP under optimaliseringen. Selv om den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren injiserer legemidlene i platen under lufttrykk43, begrenser ugjennomtrengeligheten av cellemembranen til noen mitokondrielle komplekshemmere deres bruk i tilfelle intakte celler i forhold til isolerte mitokondrier44. Lastingen inn i havnene må utføres nøye for å unngå krysskontaminering. Substratkonsentrasjonen (f.eks. glukose, pyruvat, glutamin) i mediet kan også påvirke mitokondriell aktivitet og må optimaliseres.

Bortsett fra legemiddelkonsentrasjonene er cellesåingstettheten også en kritisk parameter for å oppnå en god OCR-verdi. Optimal cellesåtetthet varierer etter celletype, og det anbefales å bruke forskjellige såtettheter i innledende eksperimenter for å teste effekten av målingen. Nøyaktig celletelling er obligatorisk for å redusere variasjonen mellom grupper, og passende beleggmaterialer for kulturplaten må testes for å sikre adherens av celler i bunnen av platen. Sentrifugering av kulturplaten med en hastighet på 300 × g ved RT i 5 minutter uten brems bidrar til rask sedimentering og festing av cellene. Før såing av cellene, er tilstrekkelig vask ønskelig etter aspirasjon av beleggmaterialet.

Såing av celler utføres av pipetteringsceller i bunnkanten, for å unngå kanteffekter og for å sikre jevn spredning av cellene45. Cellene holdes ved 37 °C og får hvile i minst 1 time for å minimere kanteffekten46. Det anbefales å opprettholde dem i en ikke-CO2 -inkubator for å degas cellekulturplaten før måling, siden oksygennivået i gassblandingen kan variere i henhold til eksperimentet og celletypen, med forskjellige hypoksiverdier for forskjellige vev og celletyper47. Analysemediet må tilberedes på analysedagen (70 ml medium er tilstrekkelig for analysen). Normalisering av dataene med cellenummeret kan utføres ved bruk av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2,5-tetrazoliumbromid (MTT) analyse, kjernefragmenteringsanalysen med Hoechst, celletellingsanalysen eller protein- eller DNA-kvantifiseringsanalyser48. Siden forskjellige mitokondrielle hemmere brukes, må celle levedyktighet vurderes som en faktor for resultatet. Det anbefales å utføre en celle levedyktighetstest ved slutten av analysen for å utelukke en mulig cytotoksisk effekt av legemidlene som brukes.

I tillegg til OCR kan den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren også måle ECAR, som vanligvis brukes til kvantifisering av glykolyse49. I mitokondriestressanalysen reflekterer imidlertid EAR-verdiene surheten som genereres av både glykolyse og trikarboksylsyresyklusen (via CO2) i mitokondriell respirasjon. For å måle glykolyse anbefales et glykolysestresstestsett. I utgangspunktet viser OCR før tilsetning av forbindelsene den basale respirasjonen av nøytrofilene. Basal respirasjon oppstår på grunn av at protonene transporteres fra mitokondriematrisen til intermembranrommet som passerer gjennom den indre mitokondriemembranen, avhengig av den indre mitokondriemembransammensetningen. Basalrespirasjon står for ~ 30% -50% av metabolismen av hvilende celler 1,50.

Beregninger basert på basal respirasjon av analysen kan redusere variabiliteten mellom grupper og typer celler. Normalisering av dataene er oppnådd ved sammenligning med basal respirasjon uten tilsetning av noen legemidler, noe som gjør det mulig å normalisere endringer avhengig av celletall og benkfeil på analysen. Ekstra respirasjonskapasitet er forskjellen mellom maksimal OCR og basal OCR og er en indikator på hvor nær cellene fungerer til sin bioenergetiske grense. Reduksjon i maksimal respirasjon indikerer redusert elektrontransport i respirasjonskjeden fra kompleksene I og II til kompleksene III og IV, og til slutt til molekylært oksygen. Figur 4A viser skjematisk fremstilling av beregningene av analysen.

Økningen i respiratorisk kapasitet indikerer at celler kan reagere godt på ytterligere energibehov, noe som er en forutsetning når det gjelder nøytrofiler, da de ender opp i respiratorisk utbrudd ved aktivering 51,52,53,54,55. ECAR-data fra mitokondriestressanalysen kan imidlertid ikke representere glykolysehastigheten til nøytrofilene. Det kan gjøres visse vurderinger av dataene; for eksempel innebærer reduksjonen i EAR-verdier hos både mus og humane nøytrofiler etter tilsetning av rotenon og antimycin A at EAR-verdiene før tillegg av disse komplekse I- og III-hemmerne hovedsakelig skyldes CO2-produksjon fra TCA-syklusen. Når det gjelder cellelinjer, er EAR-verdiene konstante etter tilsetning av rotenon og antimycin A, noe som tyder på at EAR-verdiene før addisjonen skyldes glykolyse45.

Mitokondriesykdommer er kliniske tilstander karakterisert ved defekt OXPHOS. Når det gjelder nøytrofiler, er måling av OCR lav på grunn av ingen celleproliferasjon, lavt mitokondrielt antall og tidlig senescens56. Ved nevrodegenerative lidelser ekstravaserer nøytrofile granulocytter til amyloid-β (Aβ) deponeringsområder. Aβ42-peptidet utløser integrinaktivering og rask nøytrofil adhesjon57. Under apoptose frigjør nøytrofile mitokondrier proapoptotiske proteiner i cytosol58. Det er også vist at den nøytrofile migrasjonshastigheten reduseres, og kjemotaksis avskaffes ved behandling med CCCP9. Dette antyder den potensielle rollen som mitokondrier og mitokondriell respirasjon i nøytrofil funksjon. Mitokondrielle aktiviteter i forskjellige celletyper under mange patologiske forhold er rapportert og knyttet til patogenese, som Alzheimers5, schizofreni59, kroniske luftveissykdommer60, bipolare lidelser, sepsis, diabetikere, astma, pulmonal hypertensjon og sigdcellesykdom. Nye terapier, som å forbedre respiratorisk kjedefluks ved bruk av antioksidanter (f.eks. CoQ10, idebenon, alfa-liposyre, vitamin C og E) og / eller kofaktorer (f.eks. Riboflavin, tiamin) og administrering av mitokondrielle substrater som L-karnitin, har blitt brukt til behandling av mitokondrielle lidelser. Imidlertid er disse behandlingene ikke standardiserte og kan ikke være effektive61. En ikke-invasiv standardisert metodikk, for eksempel bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator, for å kvantifisere mitokondrielle funksjoner i sykdomsrelevante celler, som nøytrofiler, kan tjene som en diagnostisk biomarkør i terapeutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institutt for immunologi ved UConn Health for deres opplæring i bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator, og Dr. Lynn Puddington i Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene. Vi anerkjenner Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hennes hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), et oppstartsfond fra UConn Health og et karrierestipend fra American Association of Immunologs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 196
Sanntidsmåling av den mitokondrielle bioenergetiske profilen til nøytrofiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter