Summary
Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.
Abstract
In de afgelopen jaren is het aantal studies gewijd aan het vaststellen van het verband tussen mitochondriën en kanker aanzienlijk gestegen. Er zijn echter nog meer inspanningen nodig om het verband met veranderingen in mitochondriën en tumorigenese volledig te begrijpen, evenals om tumor-geassocieerde mitochondriale fenotypes te identificeren. Om bijvoorbeeld de bijdrage van mitochondriën in tumorigenese en metastaseprocessen te evalueren, is het essentieel om de invloed van mitochondriën van tumorcellen in verschillende nucleaire omgevingen te begrijpen. Voor dit doel bestaat een mogelijke benadering uit het overbrengen van mitochondriën naar een andere nucleaire achtergrond om de zogenaamde cybride cellen te verkrijgen. In de traditionele cybridisatietechnieken wordt een cellijn zonder mtDNA (ρ0, nucleaire donorcel) opnieuw bevolkt met mitochondriën die zijn afgeleid van enucleated cellen of bloedplaatjes. Het enucleatieproces vereist echter een goede celhechting aan de kweekplaat, een kenmerk dat in veel gevallen gedeeltelijk of volledig verloren gaat in invasieve cellen. Bovendien is een andere moeilijkheid die in de traditionele methoden wordt gevonden, het bereiken van volledige verwijdering van het endogene mtDNA uit de mitochondriale ontvangercellijn om zuivere nucleaire en mitochondriale DNA-achtergronden te verkrijgen, waarbij de aanwezigheid van twee verschillende mtDNA-soorten in het gegenereerde cybride wordt vermeden. In dit werk presenteren we een mitochondriaal uitwisselingsprotocol toegepast op suspensie-groeiende kankercellen op basis van de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën. Deze methodologie stelt ons in staat om de beperkingen van de traditionele benaderingen te overwinnen en kan dus worden gebruikt als een hulpmiddel om het begrip van de mitochondriale rol in kankerprogressie en metastase uit te breiden.
Introduction
Het herprogrammeren van het energiemetabolisme is een kenmerk van kanker1 dat voor het eerst werd waargenomen door Otto Warburg in de jaren 19302. Onder aerobe omstandigheden zetten normale cellen glucose om in pyruvaat, dat vervolgens acetyl-coA genereert, de mitochondriale machinerie voedt en cellulaire ademhaling bevordert. Niettemin toonde Warburg aan dat, zelfs onder normoxische omstandigheden, de meeste kankercellen pyruvaat verkregen uit het glycolyseproces omzetten in lactaat, waardoor ze hun weg verleggen om energie te verkrijgen. Deze metabole aanpassing staat bekend als het "Warburg-effect" en stelt sommige kankercellen in staat om te voorzien in hun energetische behoeften voor snelle groei en deling, ondanks het feit dat ATP minder efficiënt wordt gegenereerd dan het aërobe proces 3,4,5. In de afgelopen decennia hebben talrijke werken de implicatie van herprogrammering van het metabolisme in de progressie van kanker ondersteund. Vandaar dat tumor energetica wordt beschouwd als een interessant doelwit tegen kanker1. Als een centrale hub in het energetisch metabolisme en in de toevoer van essentiële voorlopers, spelen mitochondriën een sleutelrol in deze celaanpassingen die we tot op heden slechts gedeeltelijk begrijpen.
In overeenstemming met het bovenstaande zijn mitochondriale DNA (mtDNA) mutaties voorgesteld als een van de mogelijke oorzaken van deze metabole herprogrammering, die zou kunnen leiden tot een verminderde elektronentransportketen (ETC) prestaties6 en zou verklaren waarom sommige kankercellen hun glycolytische metabolisme verbeteren om te overleven. Er is inderdaad gemeld dat mtDNA mutaties in kankercellen accumuleert, aanwezig in ten minste 50% van de tumoren7. Een recente studie uitgevoerd door Yuan et al. meldde bijvoorbeeld de aanwezigheid van hypergemuteerde en afgeknotte mtDNA-moleculen in nier-, colorectale en schildklierkankers8. Bovendien hebben veel werken aangetoond dat bepaalde mtDNA-mutaties geassocieerd zijn met een agressiever tumorfenotype en met een toename van het metastatische potentieel van kankercellen 9,10,11,12,13,14,15,16.
Ondanks de schijnbare relevantie van het mitochondriale genoom in de progressie van kanker, is de studie van deze mutaties en hun bijdrage aan de ziekte een uitdaging geweest vanwege beperkingen in de experimentele modellen en technologieën die momenteel beschikbaar zijn17. Er zijn dus nieuwe technieken nodig om de echte impact van mitochondriaal DNA in de ontwikkeling en progressie van kankerziekten te begrijpen. In dit werk introduceren we een protocol voor transmitochondriale cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen, gebaseerd op de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën, dat de belangrijkste uitdagingen van traditionele cybridisatiemethoden overwint18,19. Deze methodologie maakt het gebruik van elke kerndonor mogelijk, ongeacht de beschikbaarheid van hun overeenkomstige ρ0-cellijn en de overdracht van mitochondriën van cellen die, volgens de traditionele technieken, moeilijk te enucleeren zouden zijn (d.w.z. niet-aanhangende cellijnen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle cultuurmedia en buffersamenstellingen zijn gespecificeerd in tabel 1. Voorafgaand aan de cybridegeneratie moeten zowel mitochondriale als nucleaire DNA-profielen van de donor- en ontvangercellen worden getypeerd om de aanwezigheid van genetische verschillen in beide genomen tussen cellijnen te bevestigen. In deze studie werd gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare L929-cellijn en de daarvan afgeleide cellijn, L929dt, die spontaan werd gegenereerd in ons laboratorium (zie13 voor meer informatie). Deze cellijnen vertonen twee verschillen in de sequentie van hun mt-Nd2-gen die kunnen worden gebruikt om de zuiverheid van mtDNA te bevestigen zodra het cybridisatieproces is voltooid13. In dit geval werd de zuiverheid van de nucleaire achtergrond bevestigd door antibioticagevoeligheid, omdat L929, in tegenstelling tot L929dt-cellen, resistent was tegen geneticine.
1. Mitochondriale depletie door rhodamine 6G-behandeling (ontvangende cellen)
OPMERKING: De eerste stap voor een succesvolle cybridegeneratie is het volledig en onomkeerbaar afschaffen van mitochondriale functies in de ontvangende cellen. Voor dit doel is het noodzakelijk om vooraf, voor elke cellijn, de juiste concentratie en behandelingsduur met rhodamine 6G te bepalen. Deze adequate concentratie moet net onder de door het geneesmiddel geïnduceerde celdood liggen (de hoogste die de cellen tijdens de behandeling niet doodt). Voer het volgende uit zodra de optimale omstandigheden zijn gedefinieerd.
- Zaai 10 6 cellen in een6-well plaat met behulp van volledig kweekmedium (zie tabel 1 voor details) en behandel ze dagelijks met de optimale concentratie rhodamine 6G gedurende 3-10 dagen, afhankelijk van de cellijn. Traditionele concentraties variëren van 2 tot 5 μg/ml gedurende 3-10 dagen20,21. In deze studie, voor L929-afgeleide cellen, was 2,5 μg / ml rhodamine 6G gedurende 7 dagen de geselecteerde behandeling13,22.
- Om de cellen in leven te houden, vult u het celkweekmedium aan met 50 μg / ml uridine en 100 μg / ml pyruvaat en vernieuwt u het elke 24 uur.
- Verander na de behandeling en voorafgaand aan de fusie het medium van met rhodamine 6G behandelde cellen in een compleet celkweekmedium zonder rhodamine 6G en laat ze 3-4 uur in dit medium in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Het rhodamine 6G toxische effect is onomkeerbaar en cellen met niet-functionele mitochondriën mogen niet herstellen20. Dus, na de behandeling, moeten cellen die geen functionele mitochondriën ontvangen, zelfs in met uridine aangevuld kweekmedium sterven. Daarom zou er geen nucleaire selectie nodig moeten zijn. Een controlefusie van met rhodamine 6G behandelde cellen zonder mitochondriën wordt echter aanbevolen.
2. Expansie en mitochondriale isolatie (donorcellen)
- Breid de mitochondriale donorcellen uit tijdens het tijdsverloop van rhodamine 6G-behandeling om ongeveer 25 x 106-cellen te verkrijgen.
- Oogst op dag 7 exponentieel groeiende cellen in een buis van 50 ml en verzamel ze door centrifugeren bij 520 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was de cellen 3x met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en bezink ze door centrifugatie op 520 x g gedurende 5 minuten bij RT. Voer vanaf nu alle stappen van mitochondriale extractie uit bij 4 ° C, gebruik koude reagentia en houd de buizen met cellen of mitochondriën op ijs.
- Na de derde centrifugatie gooit u het supernatant weg door aspiratie met behulp van een glazen pipet gekoppeld aan een vacuümpomp en resuspensie u de verpakte cellen in een volume hypotone buffer dat gelijk is aan 7x het volume van de celpellet. Breng vervolgens de celsuspensie over in een homogenisatorbuis en laat de cellen opzwellen door ze gedurende 2 minuten op ijs te broeden.
- Breek de celmembranen door 8 tot 10 slagen uit te voeren in de homogenisator gekoppeld aan een motoraangedreven stamper die met 600 tpm draait.
OPMERKING: De stap van celmembraanverstoring kan variëren tussen celtypen; Het moet dus worden geoptimaliseerd voor elk celtype. - Voeg hetzelfde volume hypertone buffer toe aan de celsuspensie (7x het celpelletvolume) om een isotone omgeving te genereren.
- Breng het homogenaat over in een buis van 15 ml en centrifugeer het in een vaste rotor bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verzamel vervolgens slechts 3/4 van het supernatant en laat een grote marge van de pellet achter, om besmetting met kernen of intacte cellen te voorkomen en breng het over naar een andere buis. Herhaal hetzelfde proces twee keer. Merk op dat het supernatant moet worden bewaard en de pellet moet worden weggegooid.
- Bewaar de mitochondriale fractie (supernatant). Breng het over in buizen van 1,5 ml en centrifugeer op maximale snelheid (18.000 x g) gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en was de met mitochondriën verrijkte pellet met buffer A, waarbij de inhoud van de twee buizen in één wordt gecombineerd en gecentrifugeerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.7. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal zich in slechts één buis bevindt.
- Maak een extra wasbeurt met 300 μL buffer A en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test23. Voor elke cybridisatietest moet de optimale hoeveelheid mitochondriën voor de overdrachtsprocedure worden bepaald (in ons geval een concentratie tussen 10-40 μg mitochondriaal eiwit per 106 cellen).
- Bereid tegelijkertijd de rhodamine 6G-voorbehandelde cellen voor op de fusie door ze te verzamelen in een buis van 15 ml en te centrifugeren bij 520 x g gedurende 5 minuten bij RT. Merk op dat de pellet een neonroze kleur krijgt als gevolg van rhodamine 6G-behandeling.
- Om ervoor te zorgen dat zowel mitochondriale functie-afschaffing in receptorcellen als organelzuivering van donoren correct zijn uitgevoerd, zaait u een klein aantal met rhodamine 6G behandelde cellen en geïsoleerde mitochondriën met behulp van het volledige kweekmedium in een 6-putplaat en kweekt u ze gedurende een maand om te controleren of er geen overlevende cellen in een van de putten achterblijven (figuur 2).
- Evalueer tegelijkertijd de afwezigheid van nuclei-contaminanten in de mitochondriale fractie door immunodetectie van nucleaire eiwitten (d.w.z. lamin bèta, histon H3, enz.) of door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) amplificatie van een nucleair gen (d.w.z. SDH, 18S-rRNA, enz.).
OPMERKING: Om verontreinigingen te voorkomen, wordt aanbevolen om alle stappen in aseptische omstandigheden uit te voeren onder een laminaire stroomkap.
3. Fusie en cybride generatie
- Om door te gaan met de fusie, voegt u voorzichtig 106 van de rhodamine 6G-behandelde cellen toe aan de geïsoleerde mitochondriale pellet (10-40 μg mitochondriaal eiwit) en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 520 x g om de cellen te laten mengen met de mitochondriën.
- Voeg 100 μL polyethyleenglycol (PEG, 50%) toe en resuspensie de pellet voorzichtig gedurende 30 s. Laat vervolgens nog eens 30 s onaangeroerd rusten.
- Breng ten slotte het mengsel over in een 6-putsplaat met vers compleet celkweekmedium en plaats het in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Na een paar dagen (meestal 1 week) zouden transmitochondriale cybriden moeten beginnen te groeien (figuur 2), wat aanleiding geeft tot klonen die individueel kunnen worden geselecteerd of gemengd in een pool voorafgaand aan hun analyse.
4. Verificatie van zowel mitochondriale als nucleaire achtergrond
OPMERKING: Zodra de nieuwe cellijn is vastgesteld en cellen exponentieel beginnen te groeien, moet de zuiverheid van hun mitochondriale en nucleaire DNA's worden geverifieerd. De oorspronkelijke cellijnen moeten dus verschillende mutaties of polymorfismen in hun genomen bevatten om ze herkenbaar te maken.
- Totale DNA-isolatie
- Isoleer het genomische DNA van alle cellijnen die worden gebruikt voor het genereren van cybriden door gebruik te maken van een commerciële genomische DNA-extractiekit (zie tabel met materialen) of door een standaardprotocol uit te voeren met behulp van fenol-chloroform-isoamylalcoholextractie en alcoholprecipitatie24.
- mtDNA-evaluatie (figuur 3)
OPMERKING: Verschillende technieken, zoals sequencing, rflp-analyse (restriction fragment length polymorphism) of allelspecifieke qPCR, kunnen worden uitgevoerd om de zuiverheid van mtDNA te analyseren. Om de aanwezigheid van mtDNA-sequentievariaties door RFLP te bevestigen, volgt u de volgende protocolstappen.- Amplificeer een mtDNA-fragment dat de nucleotideverandering door PCR bevat.
- Hier vertonen L929dt-cellen een mtDNA-mutatie op positie 4206, binnen een mt-Nd2-gen (m.4206C>T) dat afwezig is in L929-cellen. Om de aanwezigheid van deze substitutie in de transmitochondriale cybriden te bevestigen, versterkt u een fragment van 397 bp door PCR met behulp van een standaardprotocol en de volgende primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (posities 3862-3884) en 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posities 4236-4258).
- Hier vertonen L929dt-cellen een mtDNA-mutatie op positie 4206, binnen een mt-Nd2-gen (m.4206C>T) dat afwezig is in L929-cellen. Om de aanwezigheid van deze substitutie in de transmitochondriale cybriden te bevestigen, versterkt u een fragment van 397 bp door PCR met behulp van een standaardprotocol en de volgende primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analyseer de aanwezigheid van de gewenste nucleotidesubstitutie door RFLP, met behulp van een specifieke endonuclease die de sequentieverandering herkent en een ander snijpatroon voor beide cellijnen genereert.
OPMERKING: Wanneer de L929dt mtDNA-variant aanwezig is (4206T), bevat het amplicon verkregen in stap 4.2.1 twee restrictieplaatsen voor SspI (zie tabel met materialen) die drie DNA-fragmenten van 306 bp, 52 bp en 39 bp produceren. De beperkingssite die de 52- en 39-banden genereert, wordt verstoord wanneer de wild-type (WT) versie C4206 aanwezig is en een nieuwe band van 91 bp verschijnt. Daarom is een interne controle voor volledige vertering voor SspI opgenomen in de analyse. De verteringsreactie wordt uitgevoerd bij 37 °C, volgens de instructies van de fabrikant. - Scheid de restrictiefragmenten door elektroforese en vergelijk het bandpatroon.
- Zodra de spijsvertering is uitgevoerd, analyseert u de verkregen restrictiefragmenten door elektroforese in 10% polyacrylamide-Tris-boraat-EDTA (TBE) -gels (zie tabel 1 voor 1x TBE-samenstelling). Voer de elektroforese uit op 80 V gedurende 1 uur bij RT. Visualiseer de DNA-fragmenten na gelkleuring in een oplossing van ethidiumbromide in 1x TBE gedurende 15 minuten bij RT (zie tabel 1 voor de samenstelling van de gelkleuringsoplossing).
- Amplificeer een mtDNA-fragment dat de nucleotideverandering door PCR bevat.
- Nucleaire DNA-genotypering
OPMERKING: Nucleaire DNA-genotypering moet worden uitgevoerd met behulp van het vorige DNA-extractiemonster dat is gebruikt voor RFLP-analyse.- Versterk 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 en AMEL) met behulp van een pool van commercieel-specifieke oligonucleotiden (zie tabel met materialen).
- Voer elektroforese uit met behulp van een genetische analysator om de eerder verkregen fragmenten te scheiden.
OPMERKING: Eenmaal versterkt, worden de verschillende loci geanalyseerd door elektroforese met behulp van een capilarsysteem (zie tabel met materialen). De fragmenten worden gescheiden in een 50 cm lange capilar gevuld met een commercieel polymeer. Kathode- en anodebuffers zijn ook in de handel verkrijgbaar, zoals weergegeven in de materiaaltabel. Elektroforese wordt uitgevoerd bij 19,5 kV gedurende 20 minuten bij 60 °C. - Gebruik bioinformatica-instrumenten om de allelen te bepalen die overeenkomen met elke versterkte locus (zie Materiaaltabel).
- Vergelijk de gegevens verkregen in stap 4.3.3 met de nucleaire DNA-profieldatabank (tabel 1) om te controleren of het nucleaire DNA-profiel overeenkomt met het mitochondriale receptorcellijnprofiel (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het volgen van het hierboven gepresenteerde protocol moet een homoplasmatische cybride cellijn met een geconserveerde nucleaire achtergrond maar met een nieuw mitochondriale genotype worden verkregen, zoals weergegeven in de schema's in figuur 1 en figuur 2. De zuiverheid van het mitochondriale en nucleaire DNA in de cybriden kan worden bevestigd door RFLP, zoals weergegeven in figuur 3, en door nucleaire DNA-genotyperingsanalyse, zoals weergegeven in figuur 4.
Als de mitochondriale overdracht met succes is uitgevoerd, moeten de resultaten die zijn verkregen met de RFLP-analyse voor de cybridecellijn verschillende verteringsbandpatronen vertonen in vergelijking met de ontvangende cellijn en identiek aan de mitochondriale donorcellijn. Voor dit doel moet het restrictie-enzym zorgvuldig worden gekozen en ervoor zorgen dat de bandpatronen die uit de spijsvertering worden verkregen, in beide cellijnen verschillend zijn. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 3, waarin de restrictiefragmenten verkregen na SspI-vertering in WT-mitochondriën en gemuteerde mitochondriën (MUT) worden getoond. In het geval van de nieuwe transmitochondriale cellijnen waren de restrictiefragmenten identiek aan die verkregen in hun respectieve mitochondriale donoren en verschillend van die gegenereerd met de kerndonorcelamplicons. Deze test bevestigt dus dat de mitochondriale uitwisseling werd uitgevoerd zoals verwacht. Van belang is dat een monster van ontvangende cellen dat niet aan de verteringsprocedure was onderworpen, in deze analyse werd opgenomen als een negatieve controle.
Met betrekking tot DNA-nucleaire genotypering wordt een typisch profiel verkregen uit de analyse van 16 nucleaire loci voor een van de cellijnen die in dit protocol worden gebruikt, weergegeven in figuur 4. Net als bij RFLP, door de pieken verkregen voor elke locus te vergelijken, moeten de resultaten verkregen van de mitochondriale receptorcellijn (nucleaire donor) overeenkomen met de gegenereerde cybride.
Het is belangrijk op te merken dat de verkregen resultaten kunnen variëren afhankelijk van verschillende factoren. Zoals we in het protocol aangeven, zijn niet alle cellijnen vatbaar voor dezelfde hoeveelheid rhodamine 6G voor het verwijderen van de totaliteit van functionele mitochondriën.
Figuur 1: Schematische weergave van cybride generatie, samenvattend stap 1 tot en met 3 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van het ontwerp van de celkweekplaat na het cybridisatieprotocol. Een nieuwe cybride cellijn en controles (geïsoleerde mitochondriën en rhodamine 6G-behandelde ontvangercellen) worden afzonderlijk gezaaid in een 6-well plaat. Na een paar dagen kweek beginnen cybridecellen te groeien, terwijl er geen overlevende cellen in de controleputten achterblijven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Moleculaire karakterisering van cybriden. (A) RFLP-analyse van de m.4206C>T-mutatie in mitochondriale donorcellijnen (WT en MUT, respectievelijk rijstroken 3 en 4) en hun respectieve transmitochondriale cellijnen (MUT WT → rijstrook 5 enWT MUT → rijstrook 6). MW: molecuulgewichtsmarker (baan 1); ongesneden: niet-verteerd PCR-product (baan 2). (B) SspI-beperkingskaarten van het PCR-product voor WT- en MUT-mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van nucleaire DNA-achtergrondanalyse. Voorbeeld van de nucleaire DNA-vingerafdruk verkregen na PCR-amplificatie van 16 loci en scheiding door capilaire elektroforese. De figuur toont het karakteristieke piekpatroon voor elke versterkte loci van een cellijn. Dit patroon moet anders zijn voor de twee cellijnen die in het cybridisatieprotocol worden gebruikt om de zuiverheid van nucleair DNA te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gemiddeld | Compositie | ||
| Compleet kweekmedium | DMEM hoge glucose met L-Gln en pyruvaat + FBS (10%) + Penicilline-Streptomycine (1x) | ||
| Hypotone buffer | 10 mM MOPS, 83 mM sucrose, pH 7,2 | ||
| Hypertone buffer | 30 mM MOPS, 250 mM sucrose, pH 7,2 | ||
| Buffer A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sucrose, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM Boorzuur; 1 mM EDTA | ||
| Gel kleuring oplossing | 0,75 μg/ml ethidiumbromide in 1x TBE | ||
Tabel 1: Buffers en mediasamenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinds Otto Warburg meldde dat kankercellen hun metabolisme verschuiven en "aerobe glycolyse" versterken3,4 terwijl ze mitochondriale ademhaling verminderen, is de interesse in de rol van mitochondriën in kankertransformatie en -progressie exponentieel gegroeid. In de afgelopen jaren zijn mutaties in het mtDNA en mitochondriale disfunctie gepostuleerd als kenmerken van veel kankertypen25. Tot op heden hebben talrijke studies de mtDNA-variatie van specifieke tumoren geanalyseerd 6,26,27,28,29,30,31,32, en de totale last van verworven mtDNA-mutaties is beschouwd als een biomarker van tumorigeniciteit30 bij kankers zoals prostaatkanker 33. In lijn hiermee, terwijl mtDNA-mutaties in sommige gevallen als tumorinitiators worden beschouwd, zoals bij borstkanker 34,35 of pancreas 36 kankers, gynaecologische maligniteiten 37,38, longadenocarcinoom metastasen 15,39, of acute myeloïde leukemie 40,41, lijken ze minder relevant te zijn bij glioblastomen42.
Hoewel veel kankers ernstige mtDNA-mutaties bevatten die niet worden aangetroffen in gezonde weefsels43 en kunnen bijdragen aan de initiatievan kanker 30, presenteren anderen polymorfe mtDNA-varianten die veel voorkomen in verschillende menselijke populaties. Deze varianten bevorderen mildere veranderingen die belangrijk kunnen zijn voor de aanpassing van kankercellen zodra het transformatieproces is gestart30. In ieder geval zijn mtDNA-mutaties en mitochondriale metabolismeveranderingen betrokken bij tumorprogressie, waarbij verschillende aspecten van celhomeostase worden gewijzigd, zoals de productie van reactieve zuurstofsoorten of redoxstatus44,45,46. De mechanismen waarmee mtDNA-mutaties en -varianten tumorigenese kunnen bevorderen, zijn echter nog niet volledig begrepen. Bovendien kunnen mtDNA-mutaties in kankercellen naast veranderingen in nucleaire genen 8,33 bestaan, waardoor het moeilijk is om te bepalen welke de drivermutatie is. In andere gevallen worden de bio-energetische behoeften van tumorcellen bereikt door het moduleren van het mtDNA-kopienummer47. Aan de andere kant kunnen mtDNA-mutaties in sommige gevallen tumorcellen vatbaarder maken voor specifieke antitumorgeneesmiddelen48.
Om de rol van mtDNA-mutaties in de pathofysiologie van kanker volledig te begrijpen, is het noodzakelijk om methodologieën te ontwikkelen waarin gemuteerde mitochondriën kunnen worden geanalyseerd in een gecontroleerde nucleaire omgeving. Dit kan helpen compenserende effecten van nucleaire genen te voorkomen die cellulaire aanpassing kunnen veroorzaken. Voor dit doel vormen transmitochondriale cybriden een geschikt model. Traditionele methoden van cybridisatie omvatten een mtDNA-uitgeputte cellijn (ρ0-cellen) die fungeren als een kerndonor (en dus mitochondriale receptor) en een donor van mitochondriën, meestal een enucleated cellijn of bloedplaatjes19, met de mtDNA-varianten of mutaties van belang. De eerste uitdaging die moet worden opgelost bij het genereren van cybriden is de beschikbaarheid van ρ0-cellen die de nucleaire achtergrond van keuze herbergen. De obtentie van deze cellen omvat langdurige behandeling met ethidiumbromide, een chemische verbinding die mtDNA-replicatie remt. Het kan echter ook het genereren van mutaties in het nucleaire genoom induceren die de effecten van de te bestuderen mitochondriale veranderingen kunnen maskeren. Daarom stellen we in dit werk de eliminatie voor van hele mitochondriën in kerndonorcellijnen door behandeling met rhodamine 6G, een medicijn dat mitochondriën onomkeerbaar beschadigt en de cellen zou doden tenzij verse mitochondriën worden geïntroduceerd in hun cytoplasma21,22,49.
Een andere uitdaging in traditionele cybride generatie methoden is gerelateerd aan het enucleatieproces van de mitochondriale donorcellen. Voor dit doel worden aanhangende cellen gecentrifugeerd in aanwezigheid van cytochalasine B, dat de isolatie van enucleated cytoplasten18 mogelijk maakt door de desorganisatie van het cytoskelet te bevorderen. Als cellen groeien in suspensie (zoals hematologische lijnen) of cel-cel en cel-extracellulaire matrixadhesie hebben verloren (wat kan gebeuren met cellen met een hoger metastatisch potentieel50,51,52), zou dit enucleatieprotocol in gevaar komen, omdat cytoplasten tijdens de centrifugatie van de plaat zouden loskomen om de kernen te verwijderen, waardoor hun pool voor de daaropvolgende fusieprocedure grotendeels zou worden verminderd. Om beide uitdagingen te omzeilen, stellen we hier een protocol voor waarin geïsoleerde mitochondriën worden gefuseerd met rhodamine 6G voorbehandelde cellen in aanwezigheid van PEG, dat tijdbesparend en efficiënt is gebleken21,22,49.
Zodra de transmitochondriale cellijnen zijn gegenereerd, is het cruciaal om de zuiverheid van zowel mitochondriale als nucleaire genomen te beoordelen. Daarom is het van cruciaal belang om donorcellijnen te selecteren met sequentieverschillen binnen hun mitochondriaal DNA en met onderscheidende kenmerken, zoals antibioticaresistentie of differentiële microsatellieten. Zoals hierboven beschreven, is van sommige kankers gemeld dat ze hun mtDNA-kopienummer47 moduleren, wat het belang aantoont van het analyseren van de mtDNA-belasting in zowel originele als transmitochondriale cellijnen en het bestuderen van hun OXPHOS-prestaties onder vergelijkbare omstandigheden.
De belangrijkste valkuilen verborgen in deze procedure zijn gekoppeld aan het proces van mitochondriale eliminatie met rhodamine 6G. Elk cybridisatie-experiment moet worden voorafgegaan door assays om de optimale omstandigheden van geneesmiddelconcentratie en behandelingstijd voor de geselecteerde kerndonorcellijn vast te stellen. Als de rhodamine 6G-concentratie of de expositietijd niet voldoende is, zal de nieuwe cellijn de bijdrage hebben van twee verschillende mtDNA's, wat de fenotypische analyse complexer zal maken. Bovendien, als de tijd of dosis de optimale overschrijdt, zullen de cellen niet overleven, zelfs niet na herbevolking van mitochondriën. Ten slotte is het essentieel om voorzichtig te zijn tijdens het isolatieproces van mitochondriën om besmetting met ongebroken cellen te voorkomen, wat de fenotypische karakterisering zou kunnen veranderen.
Ondanks de technische problemen is het genereren van transmitochondriale cybriden een krachtig hulpmiddel om de mitochondriale bijdrage aan kanker- en metastaseprocessen te ontrafelen en celmodellen te genereren waar potentiële antikankerbehandelingen met mitochondriën als therapeutisch doelwit kunnen worden getest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidienummer PID2019-105128RB-I00 aan RSA, JMB en AA, en PGC2018-095795-B-I00 aan PFS en RML, beide gefinancierd door MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 en subsidienummers B31_20R (RSA, JMA en AA) en E35_17R (PFS en RML) en gefinancierd door Gobierno de Aragón. Het werk van RSA werd ondersteund door een subsidie van de Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. De auteurs willen graag het gebruik van Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza, erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
