Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65186
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,2
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

Summary

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Abstract

Ces dernières années, le nombre d’études consacrées à la détermination du lien entre les mitochondries et le cancer a considérablement augmenté. Cependant, des efforts supplémentaires sont encore nécessaires pour bien comprendre le lien impliquant des altérations dans les mitochondries et la tumorigenèse, ainsi que pour identifier les phénotypes mitochondriaux associés aux tumeurs. Par exemple, pour évaluer la contribution des mitochondries dans les processus de tumorigenèse et de métastase, il est essentiel de comprendre l’influence des mitochondries des cellules tumorales dans différents environnements nucléaires. À cette fin, une approche possible consiste à transférer les mitochondries dans un fond nucléaire différent pour obtenir les cellules dites cybrides. Dans les techniques traditionnelles de cybridisation, une lignée cellulaire dépourvue d’ADNmt (ρ0, cellule donneuse nucléaire) est repeuplée avec des mitochondries dérivées de cellules énucléées ou de plaquettes. Cependant, le processus d’énucléation nécessite une bonne adhérence cellulaire à la plaque de culture, une caractéristique qui est partiellement ou complètement perdue dans de nombreux cas dans les cellules invasives. En outre, une autre difficulté trouvée dans les méthodes traditionnelles est d’obtenir l’élimination complète de l’ADNmt endogène de la lignée cellulaire mitochondriale réceptrice pour obtenir des arrière-plans d’ADN nucléaire et mitochondrial pur, évitant ainsi la présence de deux espèces d’ADNmt différentes dans la cybride générée. Dans ce travail, nous présentons un protocole d’échange mitochondrial appliqué aux cellules cancéreuses en suspension basée sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées. Cette méthodologie nous permet de surmonter les limites des approches traditionnelles et peut donc être utilisée comme un outil pour élargir la compréhension du rôle mitochondrial dans la progression du cancer et les métastases.

Introduction

La reprogrammation du métabolisme énergétique est une caractéristique du cancer1 qui a été observé pour la première fois par Otto Warburg dans les années 19302. Dans des conditions aérobies, les cellules normales convertissent le glucose en pyruvate, qui génère ensuite de l’acétyl-coA, alimentant la machinerie mitochondriale et favorisant la respiration cellulaire. Néanmoins, Warburg a démontré que, même dans des conditions normoxiques, la plupart des cellules cancéreuses convertissent le pyruvate obtenu par le processus de glycolyse en lactate, changeant leur façon d’obtenir de l’énergie. Cet ajustement métabolique est connu sous le nom d'« effet Warburg » et permet à certaines cellules cancéreuses de répondre à leurs besoins énergétiques pour une croissance et une division rapides, malgré la génération d’ATP moins efficace que le processus aérobie 3,4,5. Au cours des dernières décennies, de nombreux travaux ont soutenu l’implication de la reprogrammation du métabolisme dans la progression du cancer. Par conséquent, l’énergétique tumorale est considérée comme une cible intéressante contre le cancer1. En tant que plaque tournante du métabolisme énergétique et de l’approvisionnement en précurseurs essentiels, les mitochondries jouent un rôle clé dans ces adaptations cellulaires que, à ce jour, nous ne comprenons que partiellement.

Conformément à ce qui précède, des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été proposées comme l’une des causes possibles de cette reprogrammation métabolique, ce qui pourrait entraîner une altération de la performance de la chaînede transport d’électrons (ETC) 6 et expliquerait pourquoi certaines cellules cancéreuses améliorent leur métabolisme glycolytique pour survivre. En effet, il a été rapporté que l’ADNmt accumule des mutations au sein des cellules cancéreuses, étant présent dans au moins 50% destumeurs7. Par exemple, une étude récente menée par Yuan et al. a rapporté la présence de molécules d’ADNmt hypermutées et tronquées dans les cancers du rein, colorectal et thyroïdien8. De plus, de nombreux travaux ont démontré que certaines mutations de l’ADNmt sont associées à un phénotype tumoral plus agressif et à une augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses 9,10,11,12,13,14,15,16.

Malgré la pertinence apparente du génome mitochondrial dans la progression du cancer, l’étude de ces mutations et de leur contribution à la maladie a été difficile en raison des limites des modèles expérimentaux et des technologies actuellement disponibles17. Ainsi, de nouvelles techniques pour comprendre l’impact réel de l’ADN mitochondrial dans le développement et la progression de la maladie cancéreuse sont nécessaires. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pour la génération de cybrides transmitochondriales à partir de cellules cancéreuses en suspension à croissance, basé sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées, qui surmonte les principaux défis des méthodes traditionnelles de cybridisation18,19. Cette méthodologie permet l’utilisation de n’importe quel donneur de noyaux, indépendamment de la disponibilité de leur lignée cellulaire ρ0 correspondante et le transfert de mitochondries à partir de cellules qui, selon les techniques traditionnelles, seraient difficiles à énucléer (c’est-à-dire des lignées cellulaires non adhérentes).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

REMARQUE : Tous les milieux de culture et compositions tampons sont spécifiés dans le tableau 1. Avant la génération de cybrides, les profils d’ADN mitochondrial et nucléaire des cellules donneuses et receveuses doivent être typés pour confirmer la présence de différences génétiques dans les deux génomes entre les lignées cellulaires. Dans cette étude, une lignée cellulaire L929 disponible dans le commerce et sa lignée cellulaire dérivée, L929dt, qui a été générée spontanément dans notre laboratoire (voir13 pour plus d’informations) ont été utilisées. Ces lignées cellulaires présentent deux différences dans la séquence de leur gène mt-Nd2 qui peuvent être utilisées pour confirmer la pureté de l’ADNmt une fois le processus de cybridisation terminé13. Dans ce cas, la pureté du fond nucléaire a été confirmée par la sensibilité aux antibiotiques, car, contrairement aux cellules L929dt, les L929 étaient résistantes à la génétique.

1. Déplétion mitochondriale par traitement à la rhodamine 6G (cellules receveuses)

REMARQUE: La première étape pour une génération réussie de cybride est d’abolir complètement et irréversiblement les fonctions mitochondriales dans les cellules receveuses. À cette fin, il est nécessaire de déterminer au préalable, pour chaque lignée cellulaire, la concentration appropriée et la durée du traitement avec la rhodamine 6G. Cette concentration adéquate devrait être juste en dessous de la mort cellulaire induite par le médicament (la plus élevée qui ne tue pas les cellules pendant le traitement). Effectuez les opérations suivantes une fois les conditions optimales définies.

  1. Ensemencer 10 à 6 cellules dans une plaque à 6 puits en utilisant un milieu de culture complet (voir le tableau 1 pour plus de détails) et les traiter quotidiennement avec la concentration optimale de rhodamine 6G pendant 3à 10 jours, selon la lignée cellulaire. Les concentrations traditionnelles varient de 2 à 5 μg/mL pendant 3 à 10 jours20,21. Dans cette étude, pour les cellules dérivées de L929, 2,5 μg/mL de rhodamine 6G pendant 7 jours était le traitement sélectionné13,22.
  2. Pour garder les cellules en vie, complétez le milieu de culture cellulaire avec 50 μg/mL d’uridine et 100 μg/mL de pyruvate et renouvelez-le toutes les 24 heures.
  3. Après traitement et avant fusion, changer le milieu des cellules traitées à la rhodamine 6G pour compléter le milieu de culture cellulaire sans rhodamine 6G, et les laisser dans ce milieu pendant 3-4 h dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2.
    REMARQUE: L’effet toxique de la rhodamine 6G est irréversible et les cellules avec des mitochondries non fonctionnelles ne devraient pas récupérer20. Ainsi, après le traitement, les cellules qui ne reçoivent pas de mitochondries fonctionnelles devraient mourir même dans un milieu de culture supplémenté en uridine. Par conséquent, aucune sélection nucléaire ne devrait être nécessaire. Cependant, une fusion témoin de cellules traitées à la rhodamine 6G sans mitochondries est recommandée.

2. Expansion et isolement mitochondrial (cellules donneuses)

  1. Développer les cellules donneuses de mitochondries pendant le laps de temps du traitement à la rhodamine 6G pour obtenir environ 25 x 106 cellules.
  2. Le jour 7, récoltez des cellules à croissance exponentielle dans un tube de 50 ml et recueillez-les par centrifugation à 520 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Laver les cellules 3x avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) et les sédimenter par centrifugation à 520 x g pendant 5 min à TA. Désormais, effectuez toutes les étapes de l’extraction mitochondriale à 4 °C, en utilisant des réactifs froids et en maintenant les tubes avec des cellules ou des mitochondries sur de la glace.
  3. Après la troisième centrifugation, éliminer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette en verre couplée à une pompe à vide et remettre en suspension les cellules emballées dans un volume de tampon hypotonique égal à 7x le volume de granulés de la cellule. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube homogénéisateur et laissez les cellules gonfler en les incubant sur de la glace pendant 2 min.
  4. Casser les membranes cellulaires en effectuant 8 à 10 coups dans l’homogénéisateur couplé à un pilon motorisé tournant à 600 tr/min.
    REMARQUE: L’étape de la perturbation de la membrane cellulaire peut varier selon les types de cellules; Ainsi, il doit être optimisé pour chaque type de cellule.
  5. Ajouter le même volume de tampon hypertonique à la suspension cellulaire (7x le volume de pastilles de cellule) pour générer un environnement isotonique.
  6. Transférer l’homogénat dans un tube de 15 mL et le centrifuger dans un rotor fixe à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, prélevez seulement les 3/4 du surnageant en laissant une grande marge de la pastille, pour éviter la contamination par des noyaux ou des cellules intactes, et transférez-le dans un autre tube. Répétez le même processus deux fois. Notez que le surnageant doit être conservé et la pastille jetée.
  7. Conserver la fraction mitochondriale (surnageant). Transvasez-le dans des tubes de 1,5 mL et centrifugez à vitesse maximale (18 000 x g) pendant 2 min à 4 °C.
  8. Jeter le surnageant et laver la pastille enrichie en mitochondries avec le tampon A, en combinant le contenu des deux tubes en un seul et en centrifugeant dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.7. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau soit dans un seul tube.
  9. Faites un lavage supplémentaire avec 300 μL de tampon A et quantifiez la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test Bradford23. Pour chaque test de cybridisation, la quantité optimale de mitochondries pour la procédure de transfert doit être déterminée (dans notre cas, une concentration comprise entre 10 et 40 μg de protéines mitochondriales pour 10à 6 cellules).
  10. Simultanément, préparer les cellules prétraitées à la rhodamine 6G pour la fusion en les recueillant dans un tube de 15 mL et en centrifugeant à 520 x g pendant 5 min à TA. A noter que la pastille acquiert une couleur rose néon grâce au traitement à la rhodamine 6G.
  11. Pour s’assurer que l’abolition de la fonction mitochondriale dans les cellules réceptrices ainsi que la purification des organites des donneurs ont été correctement effectuées, ensemencer un petit nombre de cellules traitées à la rhodamine 6G et isoler les mitochondries en utilisant le milieu de culture complet dans une plaque à 6 puits et les cultiver pendant un mois pour vérifier qu’il ne reste aucune cellule survivante dans l’un des puits (Figure 2).
  12. En parallèle, évaluer l’absence de contaminants noyaux dans la fraction mitochondriale par immunodétection de protéines nucléaires (c.-à-d. lamin bêta, histone H3, etc.) ou par amplification quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) d’un gène nucléaire (c.-à-d. SDH, ARNr 18S, etc.).
    REMARQUE: Pour éviter les contaminations, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes dans des conditions aseptiques en travaillant sous une hotte à flux laminaire.

3. Fusion et génération de cybrides

  1. Pour procéder à la fusion, ajoutez soigneusement 106 des cellules traitées à la rhodamine 6G à la pastille de mitochondrie isolée (10-40 μg de protéine mitochondriale) et centrifugez à 520 x g pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se mélanger aux mitochondries.
  2. Ajouter 100 μL de polyéthylène glycol (PEG, 50%) et remettre délicatement la pastille en suspension pendant 30 s. Ensuite, laissez reposer intact pendant encore 30 s.
  3. Enfin, transférer le mélange dans une plaque à 6 puits avec un milieu de culture cellulaire complet frais et placer dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Après quelques jours (généralement 1 semaine), les cybrides transmitochondriales devraient commencer à croître (Figure 2), donnant naissance à des clones qui peuvent être sélectionnés individuellement ou mélangés dans un pool avant leur analyse.

4. Vérification du fond mitochondrial et nucléaire

REMARQUE: Une fois que la nouvelle lignée cellulaire a été établie et que les cellules commencent à croître exponentiellement, la pureté de leurs ADN mitochondriaux et nucléaires doit être vérifiée. Ainsi, les lignées cellulaires d’origine devraient abriter différentes mutations ou polymorphismes dans leurs génomes pour les rendre reconnaissables.

  1. Isolement total de l’ADN
    1. Isoler l’ADN génomique de toutes les lignées cellulaires utilisées pour la génération de cybrides en utilisant une trousse commerciale d’extraction d’ADN génomique (voir le tableau des matériaux) ou en effectuant un protocole standard utilisant l’extraction à l’alcool phénol-chloroforme-isoamylique et la précipitation de l’alcool24.
  2. évaluation de l’ADNmt (Figure 3)
    REMARQUE: Plusieurs techniques, telles que le séquençage, l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) ou la qPCR spécifique aux allèles, peuvent être effectuées pour analyser la pureté de l’ADNmt. Pour confirmer la présence de variations de séquence d’ADNmt par RFLP, suivez les étapes suivantes du protocole.
    1. Amplifier un fragment d’ADNmt contenant le changement de nucléotide par PCR.
      1. Ici, les cellules L929dt présentent une mutation de l’ADNmt en position 4206, dans un gène mt-Nd2 (m.4206C>T) absent dans les cellules L929. Pour confirmer la présence de cette substitution dans les cybrides transmitochondriales, amplifier un fragment de 397 pb par PCR en utilisant un protocole standard et les amorces suivantes : 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3' (positions 3862-3884) et 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (positions 4236-4258).
    2. Analyser la présence de la substitution nucléotidique souhaitée par RFLP, en utilisant une endonucléase spécifique qui reconnaît le changement de séquence et génère un modèle de coupe différent pour les deux lignées cellulaires.
      REMARQUE: Lorsque le variant d’ADNmt L929dt est présent (4206T), l’amplicon obtenu à l’étape 4.2.1 contient deux sites de restriction pour SspI (voir Tableau des matériaux) qui produit trois fragments d’ADN de 306 pb, 52 pb et 39 pb. Le site de restriction qui génère les bandes 52 et 39 est perturbé lorsque la version de type sauvage (WT) C4206 est présente et qu’une nouvelle bande de 91 pb apparaît. Par conséquent, un contrôle interne pour la digestion complète de SspI est inclus dans l’analyse. La réaction de digestion est effectuée à 37 °C, en suivant les instructions du fabricant.
    3. Séparez les fragments de restriction par électrophorèse et comparez le diagramme de bande.
      1. Une fois la digestion effectuée, analyser les fragments de restriction obtenus par électrophorèse dans des gels polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) à 10% (voir Tableau 1 pour 1x composition en TBE). Exécutez l’électrophorèse à 80 V pendant 1 h à TA. Visualisez les fragments d’ADN après coloration au gel dans une solution de bromure d’éthidium dans 1x TBE pendant 15 min à TA (voir le tableau 1 pour la composition de la solution de coloration en gel).
  3. Génotypage de l’ADN nucléaire
    REMARQUE : Le génotypage de l’ADN nucléaire doit être effectué à l’aide de l’échantillon d’extraction d’ADN précédent utilisé pour l’analyse RFLP.
    1. Amplifiez 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 et AMEL) en utilisant un pool d’oligonucléotides spécifiques au commerce (voir le tableau des matériaux).
    2. Effectuer une électrophorèse à l’aide d’un analyseur génétique afin de séparer les fragments précédemment obtenus.
      NOTE: Une fois amplifiés, les différents loci sont analysés par électrophorèse à l’aide d’un système capilaire (voir tableau des matériaux). Les fragments sont séparés dans une capilaire de 50 cm de long remplie d’un polymère commercial. Des tampons cathodiques et anodiques sont également disponibles dans le commerce, comme le montre le tableau des matériaux. L’électrophorèse est réalisée à 19,5 kV pendant 20 min à 60 °C.
    3. Utiliser des outils bioinformatiques pour déterminer les allèles correspondant à chaque locus amplifié (voir Tableau des matériaux).
    4. Comparer les données obtenues à l’étape 4.3.3 avec la base de données du profil d’ADN nucléaire (tableau 1), pour vérifier si le profil d’ADN nucléaire correspond au profil de la lignée cellulaire du récepteur mitochondrial (Figure 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Après avoir suivi le protocole présenté ci-dessus, une lignée cellulaire cybride homoplasmique avec un fond nucléaire conservé mais avec un nouveau génotype mitochondrial devrait être obtenue, comme représenté dans les schémas de la figure 1 et de la figure 2. La pureté de l’ADN mitochondrial et nucléaire présent dans les cybrides peut être confirmée par RFLP, comme le montre la figure 3, et par l’analyse du génotypage de l’ADN nucléaire, comme le montre la figure 4.

Si le transfert mitochondrial a été effectué avec succès, les résultats obtenus avec l’analyse RFLP pour la lignée cellulaire cybride doivent montrer des schémas de bande de digestion différents par rapport à la lignée cellulaire receveuse et identiques à la lignée cellulaire donneuse de mitochondries. À cette fin, l’enzyme de restriction doit être choisie avec soin, en veillant à ce que les schémas de bande obtenus à partir de la digestion soient différents dans les deux lignées cellulaires. Un exemple est donné dans la figure 3, dans laquelle les fragments de restriction obtenus après digestion SspI dans les mitochondries WT et les mitochondries mutantes (MUT) sont montrés. Dans le cas des nouvelles lignées cellulaires transmitochondriales, les fragments de restriction étaient identiques à ceux obtenus chez leurs donneurs mitochondriaux respectifs et différents de ceux générés avec les amplicons cellulaires donneurs de noyaux. Ainsi, ce test confirme que l’échange mitochondrial a été réalisé comme prévu. Il convient de noter qu’un échantillon provenant de cellules receveuses qui n’a pas été soumis à la procédure de digestion a été inclus dans cette analyse en tant que témoin négatif.

En ce qui concerne le génotypage nucléaire de l’ADN, un profil typique obtenu à partir de l’analyse de 16 loci nucléaires pour l’une des lignées cellulaires utilisées dans ce protocole est présenté à la figure 4. Semblable au RFLP, en comparant les pics obtenus pour chaque locus, les résultats obtenus à partir de la lignée cellulaire réceptrice des mitochondries (donneur nucléaire) devraient correspondre à la cybride générée.

Il est important de noter que les résultats obtenus peuvent varier en fonction de différents facteurs. Comme nous l’indiquons dans le protocole, toutes les lignées cellulaires ne sont pas sensibles à la même quantité de rhodamine 6G pour éliminer la totalité des mitochondries fonctionnelles.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la génération de cybrides, résumant les étapes 1 à 3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique montrant la conception de la plaque de culture cellulaire après le protocole de cybridisation. Une nouvelle lignée cellulaire cybride et des témoins (mitochondries isolées et cellules receveuses traitées à la rhodamine 6G) sont ensemencés séparément dans une plaque à 6 puits. Après quelques jours de culture, les cellules cybrides commencent à se développer, alors qu’il ne reste aucune cellule survivante dans les puits témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation moléculaire des cybrides. (A) Analyse RFLP de la mutation m.4206C>T dans les lignées cellulaires de donneurs mitochondriaux (WT et MUT, voies 3 et 4, respectivement) et leurs lignées cellulaires transmitochondriales respectives (MUT WT → voie 5, etWT MUT → voie 6). MW : marqueur de poids moléculaire (voie 1) ; non coupé : produit de PCR non digéré (voie 2). (B) Cartes de restriction SspI du produit PCR pour les mitochondries WT et MUT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’analyse de fond de l’ADN nucléaire. Exemple d’empreinte ADN nucléaire obtenue après amplification PCR de 16 loci et séparation par électrophorèse capilaire. La figure montre le motif de pic caractéristique pour chaque loci amplifié d’une lignée cellulaire. Ce modèle doit être différent pour les deux lignées cellulaires utilisées dans le protocole de cybridisation pour confirmer la pureté de l’ADN nucléaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Douleur moyenne Composition
Milieu de culture complet DMEM glycémie élevée avec L-Gln et pyruvate + FBS (10%) + Pénicilline-Streptomycine (1x)
Tampon hypotonique MOPS 10 mM, 83 mM de saccharose, pH 7,2
Tampon hypertonique MOPS 30 mM, saccharose 250 mM, pH 7,2
Tampon A 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M saccharose, pH 7,4
TBE (1x) 50 mM Tris, 50 mM d’acide borique; 1 mM d’EDTA
Solution de coloration en gel 0,75 μg/mL de bromure d’éthidium dans 1x TBE

Tableau 1 : Mémoires tampons et composition des milieux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Depuis qu’Otto Warburg a rapporté que les cellules cancéreuses modifient leur métabolisme et potentialisent la « glycolyse aérobie »3,4 tout en réduisant la respiration mitochondriale, l’intérêt pour le rôle des mitochondries dans la transformation et la progression du cancer a augmenté de façon exponentielle. Ces dernières années, des mutations dans l’ADNmt et le dysfonctionnement mitochondrial ont été postulés comme caractéristiques de nombreux types de cancer25. À ce jour, de nombreuses études ont analysé la variation de l’ADNmt de tumeurs spécifiques 6,26,27,28,29,30,31,32, et le fardeau total des mutations acquises de l’ADNmt a été considéré comme un biomarqueur de la tumorigénicité 30 dans des cancers tels que le cancerde la prostate 33. Dans cette optique, alors que les mutations de l’ADNmt sont considérées comme des initiateurs tumoraux dans certains cas, comme dans les cancers du sein 34,35 ou du pancréas 36, les tumeurs malignes gynécologiques 37,38, les métastases d’adénocarcinome pulmonaire 15,39 ou la leucémie myéloïde aiguë 40,41, elles semblent moins pertinentes dans les glioblastomes 42.

Bien que de nombreux cancers abritent de graves mutations de l’ADNmt qui ne se trouvent pas dans les tissus sains43 et pourraient contribuer à l’initiation du cancer30, d’autres présentent des variantes polymorphes de l’ADNmt qui sont courantes dans diverses populations humaines. Ces variantes favorisent des changements plus légers qui peuvent être importants pour l’adaptation des cellules cancéreuses une fois que le processus de transformation a été initié30. Dans tous les cas, les mutations de l’ADNmt et les altérations du métabolisme mitochondrial sont impliquées dans la progression tumorale, modifiant différents aspects de l’homéostasie cellulaire tels que la production d’espèces réactives de l’oxygène ou le statut redox44,45,46. Cependant, les mécanismes par lesquels les mutations et les variantes de l’ADNmt peuvent favoriser la tumorigenèse ne sont pas encore complètement compris. En outre, les mutations de l’ADNmt dans les cellules cancéreuses peuvent coexister avec des altérations dans les gènes nucléaires 8,33, ce qui rend difficile de déterminer quelle est la mutation pilote. Dans d’autres cas, les besoins bioénergétiques des cellules tumorales sont atteints en modulant le numéro de copie de l’ADNmt47. D’autre part, dans certains cas, les mutations de l’ADNmt pourraient rendre les cellules tumorales plus sensibles à des médicaments antitumoraux spécifiques48.

Pour bien comprendre le rôle des mutations de l’ADNmt dans la physiopathologie du cancer, il est nécessaire de développer des méthodologies permettant d’analyser les mitochondries mutées dans un environnement nucléaire contrôlé. Cela peut aider à éviter les effets compensatoires des gènes nucléaires qui pourraient déclencher l’adaptation cellulaire. À cette fin, les cybrides transmitochondriales représentent un modèle approprié. Les méthodes traditionnelles de cybridisation impliquent une lignée cellulaire appauvrie en ADNmt (cellules ρ0) qui agit comme donneur de noyaux (et, par conséquent, récepteur mitochondrial) et donneur de mitochondries, généralement une lignée cellulaire énucléée ou des plaquettes19, portant les variantes ou mutations d’ADNmt d’intérêt. Le premier défi à résoudre lorsque l’on essaie de générer des cybrides est la disponibilité de cellules ρ0 hébergeant le fond nucléaire de choix. L’obtention de ces cellules implique un traitement à long terme avec du bromure d’éthidium, un composé chimique qui inhibe la réplication de l’ADNmt. Cependant, il peut également induire la génération de mutations au sein du génome nucléaire qui pourraient masquer les effets des altérations mitochondriales à étudier. Par conséquent, dans ce travail, nous proposons l’élimination des mitochondries entières dans les lignées cellulaires donneuses de noyaux par traitement à la rhodamine 6G, un médicament qui endommage irréversiblement les mitochondries et tuerait les cellules à moins que de nouvelles mitochondries ne soient introduites dans leur cytoplasme21,22,49.

Un autre défi dans les méthodes traditionnelles de génération de cybrides est lié au processus d’énucléation des cellules donneuses mitochondriales. A cet effet, les cellules adhérentes sont centrifugées en présence de cytochalasine B, ce qui permet l’isolement des cytoplastes énucléés18 en favorisant la désorganisation du cytosquelette. Si les cellules se développent en suspension (comme les lignées hématologiques) ou ont perdu l’adhésion cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire (ce qui peut arriver à celles ayant un potentiel métastatique plus élevé50,51,52), ce protocole d’énucléation serait compromis, puisque les cytoplastes se détacheraient de la plaque pendant la centrifugation pour enlever les noyaux, réduisant considérablement leur pool pour la procédure de fusion ultérieure. Pour contourner ces deux défis, nous proposons ici un protocole dans lequel des mitochondries isolées sont fusionnées avec des cellules prétraitées à la rhodamine 6G en présence de PEG, qui s’est avéré rapide et efficace21,22,49.

Une fois que les lignées cellulaires transmitochondriales sont générées, il est crucial d’évaluer la pureté des génomes mitochondrial et nucléaire. Par conséquent, il est essentiel de sélectionner des lignées cellulaires de donneurs présentant des différences de séquence dans leur ADN mitochondrial et des caractéristiques distinctives, telles que la résistance aux antibiotiques ou les microsatellites différentiels. Comme décrit ci-dessus, il a été rapporté que certains cancers modulent leur numéro de copie d’ADNmt47, ce qui démontre l’importance d’analyser la charge d’ADNmt dans les lignées cellulaires originales et transmitochondriales et d’étudier leur performance OXPHOS dans des conditions similaires.

Les principaux pièges cachés dans cette procédure sont liés au processus d’élimination des mitochondries avec la rhodamine 6G. Chaque expérience de cybridisation doit être précédée de tests visant à établir les conditions optimales de concentration du médicament et de temps de traitement pour la lignée cellulaire de donneur de noyau sélectionnée. Si la concentration de rhodamine 6G ou le temps d’exposition n’est pas suffisant, la nouvelle lignée cellulaire aura la contribution de deux ADNmt différents, ce qui ajoutera plus de complexité à l’analyse phénotypique. De plus, si le temps ou la dose dépasse les doses optimales, les cellules ne survivront pas même après le repeuplement des mitochondries. Enfin, il est essentiel d’être prudent lors du processus d’isolement des mitochondries afin d’éviter la contamination par des cellules intactes, ce qui pourrait altérer la caractérisation phénotypique.

Malgré les difficultés techniques, la génération de cybrides transmitochondriales est un outil puissant pour démêler la contribution mitochondriale aux processus de cancer et de métastases et générer des modèles cellulaires où des traitements anticancéreux potentiels utilisant les mitochondries comme cible thérapeutique peuvent être testés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par les numéros de subvention PID2019-105128RB-I00 à RSA, JMB et AA, et PGC2018-095795-B-I00 à PFS et RML, toutes deux financées par MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et les numéros de subvention B31_20R (RSA, JMA et AA) et E35_17R (PFS et RML) et financées par Gobierno de Aragón. Le travail de RSA a été soutenu par une subvention de l’Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Les auteurs tiennent à souligner l’utilisation du Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Tags

Recherche sur le cancer numéro 193
Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., … More

Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter