Summary
Este protocolo describe una técnica para la generación cíbrida a partir de células cancerosas en suspensión como una herramienta para estudiar el papel de las mitocondrias en el proceso tumorigénico.
Abstract
En los últimos años, el número de estudios dedicados a determinar la conexión entre las mitocondrias y el cáncer ha aumentado significativamente. Sin embargo, aún se necesitan más esfuerzos para comprender completamente el vínculo que implica alteraciones en las mitocondrias y la tumorigénesis, así como para identificar fenotipos mitocondriales asociados a tumores. Por ejemplo, para evaluar la contribución de las mitocondrias en los procesos de tumorigénesis y metástasis, es esencial comprender la influencia de las mitocondrias de las células tumorales en diferentes entornos nucleares. Para este propósito, un posible enfoque consiste en transferir mitocondrias a un fondo nuclear diferente para obtener las llamadas células cíbridas. En las técnicas tradicionales de cibridización, una línea celular que carece de ADNmt (ρ0, célula donante nuclear) se repoblina con mitocondrias derivadas de células enucleadas o plaquetas. Sin embargo, el proceso de enucleación requiere una buena adhesión celular a la placa de cultivo, una característica que se pierde parcial o completamente en muchos casos en las células invasivas. Además, otra dificultad encontrada en los métodos tradicionales es lograr la eliminación completa del ADNmt endógeno de la línea celular receptora mitocondrial para obtener fondos de ADN nuclear y mitocondrial puro, evitando la presencia de dos especies diferentes de ADNmt en el cíbrida generado. En este trabajo, presentamos un protocolo de intercambio mitocondrial aplicado a células cancerosas de crecimiento en suspensión basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas. Esta metodología nos permite superar las limitaciones de los enfoques tradicionales, y por lo tanto puede ser utilizada como una herramienta para ampliar la comprensión del papel mitocondrial en la progresión del cáncer y la metástasis.
Introduction
La reprogramación del metabolismo energético es un sello distintivo del cáncer1 que fue observado por primera vez por Otto Warburg en la década de 19302. En condiciones aeróbicas, las células normales convierten la glucosa en piruvato, que luego genera acetil-coA, alimentando la maquinaria mitocondrial y promoviendo la respiración celular. Sin embargo, Warburg demostró que, incluso en condiciones normóxicas, la mayoría de las células cancerosas convierten el piruvato obtenido del proceso de glucólisis en lactato, cambiando su forma de obtener energía. Este ajuste metabólico se conoce como el "efecto Warburg" y permite a algunas células cancerosas satisfacer sus demandas energéticas para un rápido crecimiento y división, a pesar de generar ATP de manera menos eficiente que el proceso aeróbico 3,4,5. En las últimas décadas, numerosos trabajos han apoyado la implicación de la reprogramación del metabolismo en la progresión del cáncer. Por lo tanto, la energética tumoral se considera un objetivo interesante contra el cáncer1. Como eje central en el metabolismo energético y en el suministro de precursores esenciales, las mitocondrias juegan un papel clave en estas adaptaciones celulares que, hasta la fecha, solo entendemos parcialmente.
En línea con lo anterior, las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) han sido propuestas como una de las posibles causas de esta reprogramación metabólica, lo que podría conducir a un deterioro del rendimiento de la cadena de transporte de electrones (ETC)6 y explicaría por qué algunas células cancerosas mejoran su metabolismo glucolítico para sobrevivir. De hecho, se ha relatado que el ADNmt acumula mutaciones dentro de las células cancerosas, estando presente en al menos el 50% de los tumores7. Por ejemplo, un estudio reciente realizado por Yuan et al. reportó la presencia de moléculas de ADNmt hipermutadas y truncadas en cánceres de riñón, colorrectal y tiroides8. Además, muchos trabajos han demostrado que ciertas mutaciones del ADNmt están asociadas con un fenotipo tumoral más agresivo y con un aumento del potencial metastásico de las células cancerosas 9,10,11,12,13,14,15,16.
A pesar de la aparente relevancia del genoma mitocondrial en la progresión del cáncer, el estudio de estas mutaciones y su contribución a la enfermedad han sido desafiantes debido a las limitaciones en los modelos experimentales y tecnologías actualmente disponibles17. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para comprender el impacto real del ADN de las mitocondrias en el desarrollo y la progresión de la enfermedad del cáncer. En este trabajo, introducimos un protocolo para la generación de cíbridos transmitocondriales a partir de células cancerosas en crecimiento en suspensión, basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas, que supera los principales desafíos de los métodos tradicionales de cibridización18,19. Esta metodología permite el uso de cualquier núcleo donante independientemente de la disponibilidad de su correspondiente línea celular ρ0 y la transferencia de mitocondrias a partir de células que, siguiendo las técnicas tradicionales, serían difíciles de enuclear (es decir, líneas celulares no adherentes).
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Protocol
NOTA: Todos los medios de cultivo y composiciones de búfer se especifican en la Tabla 1. Antes de la generación cíbrida, se deben tipificar los perfiles de ADN mitocondrial y nuclear de las células donante y receptora para confirmar la presencia de diferencias genéticas en ambos genomas entre las líneas celulares. En este estudio, se utilizó una línea celular L929 disponible comercialmente y su línea celular derivada, L929dt, que se generó espontáneamente en nuestro laboratorio (ver13 para más información). Estas líneas celulares presentan dos diferencias en la secuencia de su gen mt-Nd2 que pueden ser utilizadas para confirmar la pureza del ADNmt una vez finalizado el proceso de cibridización13. En este caso, la pureza del fondo nuclear fue confirmada por la sensibilidad a los antibióticos, ya que, contrariamente a las células L929dt, L929 eran resistentes a la genética.
1. Depleción mitocondrial por tratamiento con rodamina 6G (células receptoras)
NOTA: El primer paso para una generación cíbrida exitosa es abolir completa e irreversiblemente las funciones mitocondriales en las células receptoras. Para ello, es necesario determinar previamente, para cada línea celular, la concentración adecuada y la duración del tratamiento con rodamina 6G. Esta concentración adecuada debe estar justo por debajo de la muerte celular inducida por el fármaco (la más alta que no mata las células durante el tratamiento). Realice lo siguiente una vez que se definan las condiciones óptimas.
- Sembrar 10 6 células en una placa de6 pocillos utilizando un medio de cultivo completo (ver Tabla 1 para más detalles) y tratarlas diariamente con la concentración óptima de rodamina 6G durante 3-10 días, dependiendo de la línea celular. Las concentraciones tradicionales varían de 2 a 5 μg/mL durante 3-10 días20,21. En este estudio, para las células derivadas de L929, 2,5 μg/mL de rodamina 6G durante 7 días fue el tratamiento seleccionado13,22.
- Para mantener vivas las células, complemente el medio de cultivo celular con 50 μg/mL de uridina y 100 μg/mL de piruvato y renuévelo cada 24 h.
- Después del tratamiento y antes de la fusión, cambiar el medio de las células tratadas con rodamina 6G para completar el medio de cultivo celular sin rodamina 6G, y dejarlas en este medio durante 3-4 h en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
NOTA: El efecto tóxico de la rodamina 6G es irreversible, y las células con mitocondrias no funcionales no deberían recuperarse20. Por lo tanto, después del tratamiento, las células que no reciben mitocondrias funcionales deben morir incluso en un medio de cultivo suplementado con uridina. Por lo tanto, no debería ser necesaria ninguna selección nuclear. Sin embargo, se recomienda una fusión de control de células tratadas con rodamina 6G sin mitocondrias.
2. Expansión y aislamiento mitocondrial (células del donante)
- Expanda las células donantes de mitocondrias durante el lapso de tiempo del tratamiento con rodamina 6G para obtener alrededor de 25 x 106 células.
- El día 7, cosechar células de crecimiento exponencial en un tubo de 50 ml y recogerlas por centrifugación a 520 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Lave las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) y sedimente por centrifugación a 520 x g durante 5 minutos a RT. A partir de ahora, realizar todos los pasos de la extracción mitocondrial a 4 °C, utilizando reactivos fríos y manteniendo los tubos con células o mitocondrias en hielo.
- Después de la tercera centrifugación, desechar el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de vidrio acoplada a una bomba de vacío y resuspender las células empaquetadas en un volumen de tampón hipotónico igual a 7 veces el volumen del pellet celular. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo homogeneizador y deje que las células se hinchen incubándolas en hielo durante 2 minutos.
- Rompa las membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero accionado por motor que gira a 600 rpm.
NOTA: El paso de la ruptura de la membrana celular puede variar entre los tipos de células; Por lo tanto, debe optimizarse para cada tipo de célula. - Agregue el mismo volumen de tampón hipertónico a la suspensión celular (7 veces el volumen del pellet celular) para generar un ambiente isotónico.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 ml y centrifugarlo en un rotor fijo a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, recolecte solo 3/4 del sobrenadante dejando un gran margen del pellet, para evitar la contaminación con núcleos o células intactas, y transfiéralo a otro tubo. Repita el mismo proceso dos veces. Tenga en cuenta que el sobrenadante debe conservarse y el pellet desechado.
- Guarde la fracción mitocondrial (sobrenadante). Transfiéralo a tubos de 1,5 ml y centrifugar a velocidad máxima (18.000 x g) durante 2 min a 4 °C.
- Desechar el sobrenadante y lavar el pellet enriquecido con mitocondrias con tampón A, combinando el contenido de los dos tubos en uno solo y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.7. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
- Realizar un lavado adicional con 300 μL de tampón A y cuantificar la concentración de proteína mitocondrial utilizando el ensayo Bradford23. Para cada ensayo de cibridización, se debe determinar la cantidad óptima de mitocondrias para el procedimiento de transferencia (en nuestro caso, una concentración entre 10-40 μg de proteína mitocondrial por 10a 6 células).
- Simultáneamente, prepare las células pretratadas con rodamina 6G para la fusión recolectándolas en un tubo de 15 ml y centrifugando a 520 x g durante 5 minutos a RT. Tenga en cuenta que el pellet adquiere un color rosa neón debido al tratamiento con rodamina 6G.
- Para asegurarse de que tanto la abolición de la función mitocondrial en las células receptoras como la purificación de orgánulos de los donantes se han realizado correctamente, siembre un pequeño número de células tratadas con rodamina 6G y aísle mitocondrias utilizando el medio de cultivo completo en una placa de 6 pocillos y críquelas durante un mes para verificar que no queden células sobrevivientes en ninguno de los pocillos (Figura 2).
- Paralelamente, evaluar la ausencia de contaminantes de núcleos en la fracción mitocondrial mediante inmunodetección de proteínas nucleares (es decir, lamina beta, histona H3, etc.) o mediante la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de un gen nuclear (es decir, SDH, ARNr 18S, etc.).
NOTA: Para evitar contaminaciones, se recomienda realizar todos los pasos en condiciones asépticas trabajando bajo una campana de flujo laminar.
3. Fusión y generación cíbrida
- Para proceder con la fusión, agregue cuidadosamente 106 de las células tratadas con rodamina 6G al pellet de mitocondrias aislado (10-40 μg de proteína mitocondrial) y centrifugar a 520 x g durante 5 min para permitir que las células se mezclen con las mitocondrias.
- Añadir 100 μL de polietilenglicol (PEG, 50%) y resuspender suavemente el pellet durante 30 s. Luego, deje reposar intacto durante otros 30 s.
- Finalmente, transfiera la mezcla a una placa de 6 pocillos con medio de cultivo celular completo fresco y colóquela en la incubadora a 37 °C con 5% deCO2. Después de unos días (generalmente 1 semana), los cíbridas transmitocondriales deben comenzar a crecer (Figura 2), dando lugar a clones que pueden seleccionarse individualmente o mezclarse en un grupo antes de su análisis.
4. Verificación de los antecedentes mitocondriales y nucleares
NOTA: Una vez que se ha establecido la nueva línea celular y las células comienzan a crecer exponencialmente, se debe verificar la pureza de sus ADN mitocondriales y nucleares. Por lo tanto, las líneas celulares originales deben albergar diferentes mutaciones o polimorfismos dentro de sus genomas para hacerlos reconocibles.
- Aislamiento total de ADN
- Aislar el ADN genómico de todas las líneas celulares utilizadas para la generación cíbrida empleando un kit comercial de extracción de ADN genómico (ver Tabla de Materiales) o realizando un protocolo estándar utilizando extracción de alcohol fenol-cloroformo-isoamílico y precipitación de alcohol24.
- Evaluación del ADNmt (Figura 3)
NOTA: Se pueden realizar varias técnicas, como la secuenciación, el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) o la qPCR específica de alelos, para analizar la pureza del ADNmt. Para confirmar la presencia de variaciones de secuencia de ADNmt por RFLP, siga los siguientes pasos del protocolo.- Amplificar un fragmento de ADNmt que contenga el cambio de nucleótido mediante PCR.
- Aquí, las células L929dt presentan una mutación de ADNmt en la posición 4206, dentro de un gen mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente en las células L929. Para confirmar la presencia de esta sustitución en los cíbridos transmitocondriales, amplificar un fragmento de 397 pb mediante PCR utilizando un protocolo estándar y los siguientes cebadores: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (posiciones 3862-3884) y 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posiciones 4236-4258).
- Aquí, las células L929dt presentan una mutación de ADNmt en la posición 4206, dentro de un gen mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente en las células L929. Para confirmar la presencia de esta sustitución en los cíbridos transmitocondriales, amplificar un fragmento de 397 pb mediante PCR utilizando un protocolo estándar y los siguientes cebadores: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- Analizar la presencia de la sustitución de nucleótidos deseada por RFLP, utilizando una endonucleasa específica que reconoce el cambio de secuencia y genera un patrón de corte diferente para ambas líneas celulares.
NOTA: Cuando la variante de ADNmt L929dt está presente (4206T), el amplicón obtenido en el paso 4.2.1 contiene dos sitios de restricción para SspI (ver Tabla de materiales) que produce tres fragmentos de ADN de 306 pb, 52 pb y 39 pb. El sitio de restricción que genera las bandas 52 y 39 se interrumpe cuando está presente la versión de tipo salvaje (WT) C4206 y aparece una nueva banda de 91 pb. Por lo tanto, se incluye en el análisis un control interno para la digestión completa de SspI. La reacción de digestión se realiza a 37 °C, siguiendo las instrucciones del fabricante. - Separe los fragmentos de restricción por electroforesis y compare el patrón de bandas.
- Una vez realizada la digestión, analizar los fragmentos de restricción obtenidos por electroforesis en geles de poliacrilamida-tris-borato-EDTA (TBE) al 10% (ver Tabla 1 para 1x composición TBE). Ejecutar la electroforesis a 80 V durante 1 h en RT. Visualizar los fragmentos de ADN después de la tinción en gel en una solución de bromuro de etidio en 1x TBE durante 15 min a RT (ver Tabla 1 para la composición de la solución de tinción en gel).
- Amplificar un fragmento de ADNmt que contenga el cambio de nucleótido mediante PCR.
- Genotipado de ADN nuclear
NOTA: El genotipado de ADN nuclear debe realizarse utilizando la muestra de extracción de ADN anterior empleada para el análisis de RFLP.- Amplíe 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 y AMEL) utilizando un conjunto de oligonucleótidos específicos del comercial (consulte la Tabla de materiales).
- Realizar electroforesis mediante un analizador genético con el fin de separar los fragmentos previamente obtenidos.
NOTA: Una vez amplificados, los diferentes loci se analizan mediante electroforesis utilizando un sistema capilar (ver Tabla de Materiales). Los fragmentos se separan en un capilar de 50 cm de largo lleno de un polímero comercial. Los tampones de cátodo y ánodo también están disponibles comercialmente, como se muestra en la Tabla de materiales. La electroforesis se realiza a 19,5 kV durante 20 min a 60 °C. - Utilizar herramientas bioinformáticas para determinar los alelos correspondientes a cada locus amplificado (ver Tabla de Materiales).
- Comparar los datos obtenidos en el paso 4.3.3 con la base de datos del perfil de ADN nuclear (Tabla 1), para comprobar si el perfil de ADN nuclear coincide con el perfil de la línea celular del receptor de las mitocondrias (Figura 4).
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Representative Results
Después de seguir el protocolo presentado anteriormente, se debe obtener una línea celular ciclaria homoplásmica con un fondo nuclear conservado pero con un nuevo genotipo mitocondria, como se representa en los esquemas de la Figura 1 y la Figura 2. La pureza del ADN mitocondrial y nuclear presente en los cíbridos puede confirmarse mediante RFLP, como se muestra en la Figura 3, y mediante análisis de genotipado de ADN nuclear, como se muestra en la Figura 4.
Si la transferencia mitocondrial se realizó con éxito, los resultados obtenidos con el análisis RFLP para la línea celular cíbrida deben mostrar diferentes patrones de bandas de digestión en comparación con la línea celular receptora e idénticos a la línea celular donante de mitocondrias. Para este propósito, la enzima de restricción debe elegirse cuidadosamente, asegurándose de que los patrones de banda obtenidos de la digestión sean diferentes en ambas líneas celulares. Un ejemplo se da en la Figura 3, en la que se muestran los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión de SspI en mitocondrias WT y mitocondrias mutantes (MUT). En el caso de las nuevas líneas celulares transmitocondriales, los fragmentos de restricción fueron idénticos a los obtenidos en sus respectivos donantes mitocondriales y diferentes a los generados con los núcleos de los amplicones celulares donantes. Por lo tanto, este ensayo confirma que el intercambio mitocondrial se realizó como se esperaba. Cabe destacar que una muestra de células receptoras que no fue sometida al procedimiento de digestión se incluyó en este análisis como control negativo.
En cuanto al genotipado nuclear de ADN, en la Figura 4 se muestra un perfil típico obtenido del análisis de 16 loci nucleares para una de las líneas celulares utilizadas en este protocolo. Al igual que en la RFLP, al comparar los picos obtenidos para cada locus, los resultados obtenidos de la línea celular del receptor de mitocondrias (donante nuclear) deben coincidir con el cíbrida generado.
Es importante tener en cuenta que los resultados obtenidos pueden variar según diferentes factores. Como indicamos en el protocolo, no todas las líneas celulares son susceptibles a la misma cantidad de rodamina 6G para eliminar la totalidad de las mitocondrias funcionales.
Figura 1: Representación esquemática de la generación cíbrida, resumiendo los pasos 1 a 3 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática que muestra el diseño de la placa de cultivo celular después del protocolo de cibridización. Una nueva línea celular cíbrida y controles (mitocondrias aisladas y células receptoras tratadas con rodamina 6G) se siembran por separado en una placa de 6 pocillos. Después de unos días de cultivo, las células cíbridas comienzan a crecer, mientras que no quedan células sobrevivientes en los pozos de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización molecular de cíbridas. (A) Análisis RFLP de la mutación m.4206C>T en líneas celulares donantes mitocondriales (WT y MUT, carriles 3 y 4, respectivamente) y sus respectivas líneas celulares transmitocondriales (MUT WT → carril 5, yWT MUT → carril 6). MW: marcador de peso molecular (carril 1); sin cortar: producto de PCR no digerido (carril 2). (B) Mapas de restricción de SspI del producto de PCR para las mitocondrias WT y MUT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos del análisis de fondo del ADN nuclear. Ejemplo de la huella de ADN nuclear obtenida tras amplificación por PCR de 16 loci y separación por electroforesis capilar. La figura muestra el patrón de pico característico para cada loci amplificado de una línea celular. Este patrón debe ser diferente para las dos líneas celulares utilizadas en el protocolo de cibridización para confirmar la pureza del ADN nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio | Composición | ||
| Medio de cultivo completo | DMEM glucosa alta con L-Gln y piruvato + FBS (10%) + Penicilina-Estreptomicina (1x) | ||
| Tampón hipotónico | 10 mM MOPS, 83 mM sacarosa, pH 7.2 | ||
| Tampón hipertónico | 30 mM MOPS, 250 mM sacarosa, pH 7.2 | ||
| Búfer A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sacarosa, pH 7.4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM de ácido bórico; 1 mM EDTA | ||
| Solución de tinción en gel | 0,75 μg/ml de bromuro de etidio en 1x TBE | ||
Tabla 1: Buffers y composición de medios.
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Discussion
Desde que Otto Warburg informó que las células cancerosas cambian su metabolismo y potencian la "glucólisis aeróbica"3,4 mientras reducen la respiración mitocondrial, el interés en el papel de las mitocondrias en la transformación y progresión del cáncer ha crecido exponencialmente. En los últimos años, las mutaciones en el ADNmt y la disfunción mitocondrial han sido postuladas como características de muchos tipos de cáncer25. Hasta la fecha, numerosos estudios han analizado la variación del ADNmt de tumores específicos 6,26,27,28,29,30,31,32, y la carga total de mutaciones adquiridas de ADNmt ha sido considerada un biomarcador de tumorigenicidad 30 en cánceres como el cáncer de próstata 33. En línea con esto, mientras que las mutaciones del ADNmt se consideran iniciadores tumorales en algunos casos, como en los cánceres de mama 34,35 o pancreático 36, las neoplasias malignas ginecológicas 37,38, las metástasis de adenocarcinoma de pulmón 15,39 o la leucemia mieloide aguda 40,41, parecen ser menos relevantes en los glioblastomas 42.
Aunque muchos cánceres albergan mutaciones graves del ADNmt que no se encuentran en tejidos sanos43 y podrían contribuir al inicio del cáncer30, otros presentan variantes polimórficas de ADNmt que son comunes en varias poblaciones humanas. Estas variantes promueven cambios más leves que pueden ser importantes para la adaptación de las células cancerosas una vez que se ha iniciado el proceso de transformación30. En cualquier caso, las mutaciones del ADNmt y las alteraciones del metabolismo mitocondrial están implicadas en la progresión tumoral, modificando diferentes aspectos de la homeostasis celular como la producción reactiva de especies de oxígeno o el estado redox44,45,46. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las mutaciones y variantes del ADNmt pueden favorecer la tumorigénesis aún no se comprenden completamente. Además, las mutaciones del ADNmt en las células cancerosas pueden coexistir con alteraciones en los genes nucleares 8,33, lo que dificulta determinar cuál es la mutación conductora. En otros casos, los requerimientos bioenergéticos de las células tumorales se logran modulando la copia número47 del ADNmt. Por otro lado, en algunos casos, las mutaciones del ADNmt podrían hacer que las células tumorales sean más susceptibles a fármacos antitumorales específicos48.
Para comprender completamente el papel de las mutaciones del ADNmt en la fisiopatología del cáncer, es necesario desarrollar metodologías en las que las mitocondrias mutadas puedan analizarse en un entorno nuclear controlado. Esto puede ayudar a evitar los efectos compensatorios de los genes nucleares que podrían desencadenar la adaptación celular. Para este propósito, los cíbridos transmitocondriales representan un modelo apropiado. Los métodos tradicionales de cibridización implican una línea celular agotada de ADNmt (células ρ0) que actúan como donante de núcleos (y, por lo tanto, receptor de mitocondrias) y un donante de mitocondrias, generalmente una línea celular enucleada o plaquetas19, portadoras de las variantes o mutaciones de ADNmt de interés. El primer desafío a resolver cuando se trata de generar cíbridas es la disponibilidad de ρ0 células que albergan el fondo nuclear de elección. La obtención de estas células implica un tratamiento a largo plazo con bromuro de etidio, un compuesto químico que inhibe la replicación del ADNmt. Sin embargo, también puede inducir la generación de mutaciones dentro del genoma nuclear que podrían enmascarar los efectos de las alteraciones mitocondriales a estudiar. Por lo tanto, en este trabajo, proponemos la eliminación de mitocondrias enteras en líneas celulares donantes de núcleos mediante tratamiento con rodamina 6G, un fármaco que daña irreversiblemente las mitocondrias y mataría las células a menos que se introduzcan mitocondrias frescas en su citoplasma21,22,49.
Otro desafío en los métodos tradicionales de generación cíbrida está relacionado con el proceso de enucleación de las células donantes mitocondriales. Para este propósito, las células adherentes se centrifugan en presencia de citocalasina B, lo que permite el aislamiento de citoplastos enucleados18 al promover la desorganización del citoesqueleto. Si las células crecen en suspensión (como las líneas hematológicas) o han perdido la adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular (lo que puede suceder a aquellas con un mayor potencial metastásico50,51,52), este protocolo de enucleación se vería comprometido, ya que los citoplastos se desprenderían de la placa durante la centrifugación para eliminar los núcleos, reduciendo en gran medida su pool para el posterior procedimiento de fusión. Para eludir ambos desafíos, proponemos aquí un protocolo en el que las mitocondrias aisladas se fusionan con células pretratadas con rodamina 6G en presencia de PEG, que ha demostrado ser eficiente y que ahorra tiempo 21,22,49.
Una vez que se generan las líneas celulares transmitocondriales, es crucial evaluar la pureza de los genomas mitocondriales y nucleares. Por lo tanto, es fundamental seleccionar líneas celulares de donantes con diferencias de secuencia dentro de su ADN mitocondrial y con características distinguibles, como resistencia a antibióticos o microsatélites diferenciales. Como se describió anteriormente, se ha informado que algunos cánceres modulan su copia de ADNmt número47, lo que demuestra la importancia de analizar la carga de ADNmt en líneas celulares originales y transmitocondriales y estudiar su rendimiento de OXPHOS en condiciones similares.
Los principales escollos ocultos en este procedimiento están relacionados con el proceso de eliminación de mitocondrias con rodamina 6G. Cada experimento de cibridización debe ir precedido de ensayos para establecer las condiciones óptimas de concentración del fármaco y el tiempo de tratamiento para la línea celular donante del núcleo seleccionado. Si la concentración de rodamina 6G o el tiempo de exposición no son suficientes, la nueva línea celular tendrá la contribución de dos ADNmt diferentes, lo que agregará más complejidad al análisis fenotípico. Además, si el tiempo o la dosis exceden los óptimos, las células no sobrevivirán incluso después de la repoblación de las mitocondrias. Finalmente, es esencial tener cuidado durante el proceso de aislamiento de las mitocondrias para evitar la contaminación con células intactas, lo que podría alterar la caracterización fenotípica.
A pesar de las dificultades técnicas, la generación de cíbridos transmitocondriales es una herramienta potente para desentrañar la contribución mitocondrial al cáncer y los procesos de metástasis y generar modelos celulares donde se puedan probar posibles tratamientos contra el cáncer utilizando mitocondrias como diana terapéutica.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el número de subvención PID2019-105128RB-I00 a RSA, JMB y AA, y PGC2018-095795-B-I00 a PFS y RML, ambas financiadas por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y números de subvención B31_20R (RSA, JMA y AA) y E35_17R (PFS y RML) y financiadas por el Gobierno de Aragón. El trabajo de RSA fue apoyado por una subvención de la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Los autores desean agradecer el uso del Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
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