Summary
Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.
Abstract
Son yıllarda, mitokondri ve kanser arasındaki bağlantıyı tespit etmeye adanmış çalışmaların sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, mitokondri ve tümörigenezdeki değişiklikleri içeren bağlantıyı tam olarak anlamak ve tümörle ilişkili mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Örneğin, mitokondrinin tümörigenez ve metastaz süreçlerine katkısını değerlendirmek için, mitokondrinin farklı nükleer ortamlardaki tümör hücrelerinden etkisini anlamak önemlidir. Bu amaçla, olası bir yaklaşım, sözde cybrid hücrelerini elde etmek için mitokondrinin farklı bir nükleer arka plana aktarılmasından oluşur. Geleneksel sibridizasyon tekniklerinde, mtDNA'dan (ρ0, nükleer donör hücre) yoksun bir hücre hattı, enüklee hücrelerden veya trombositlerden türetilen mitokondri ile yeniden doldurulur. Bununla birlikte, enükleasyon işlemi, invaziv hücrelerde birçok durumda kısmen veya tamamen kaybolan bir özellik olan kültür plakasına iyi hücre yapışmasını gerektirir. Ek olarak, geleneksel yöntemlerde bulunan bir diğer zorluk, saf nükleer ve mitokondriyal DNA arka planları elde etmek için endojen mtDNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hattından tamamen çıkarılmasını sağlamak ve üretilen sibritte iki farklı mtDNA türünün varlığından kaçınmaktır. Bu çalışmada, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan süspansiyon büyüyen kanser hücrelerine uygulanan bir mitokondriyal değişim protokolü sunuyoruz. Bu metodoloji, geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve böylece kanser ilerlemesi ve metastazındaki mitokondriyal rolün anlaşılmasını genişletmek için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Enerji metabolizmasının yeniden programlanması, 1930'larda Otto Warburg tarafından ilk kez gözlemlenen kanser1'in ayırt edici bir özelliğidir2. Aerobik koşullar altında, normal hücreler glikozu piruvat'a dönüştürür, bu da asetil-coA üretir, mitokondriyal makineyi besler ve hücresel solunumu teşvik eder. Bununla birlikte, Warburg, normoksik koşullar altında bile, çoğu kanser hücresinin glikoliz işleminden elde edilen piruvatı laktata dönüştürdüğünü ve enerji elde etme yollarını değiştirdiğini göstermiştir. Bu metabolik ayarlama "Warburg etkisi" olarak bilinir ve bazı kanser hücrelerinin, ATP'yi aerobik süreçten daha az verimli bir şekilde üretmesine rağmen, hızlı büyüme ve bölünme için enerjik taleplerini karşılamalarını sağlar 3,4,5. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, kanser progresyonunda metabolizmanın yeniden programlanmasının anlamını desteklemiştir. Bu nedenle, tümör enerjileri kansere karşı ilginç bir hedef olarak kabul edilir1. Enerjik metabolizmada ve temel öncüllerin tedarikinde merkezi bir merkez olarak, mitokondri, bugüne kadar sadece kısmen anladığımız bu hücre adaptasyonlarında kilit bir rol oynamaktadır.
Yukarıdakilere paralel olarak, mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonları, bu metabolik yeniden programlamanın olası nedenlerinden biri olarak önerilmiştir; bu, bozulmuş bir elektron taşıma zinciri (ETC) performansına yol açabilir 6 ve bazı kanser hücrelerinin hayatta kalmak için neden glikolitik metabolizmalarını geliştirdiğini açıklayacaktır. Gerçekten de, mtDNA'nın kanser hücrelerinde mutasyonlar biriktirdiği, tümörlerin en az% 50'sinde mevcut olduğu bildirilmiştir7. Örneğin, Yuan ve ark. tarafından yürütülen yeni bir çalışma, böbrek, kolorektal ve tiroid kanserlerinde hipermutasyona uğramış ve kesilmiş mtDNA moleküllerinin varlığını bildirmiştir8. Dahası, birçok çalışma, bazı mtDNA mutasyonlarının daha agresif bir tümör fenotipi ve kanser hücrelerinin metastatik potansiyelindeki bir artışla ilişkili olduğunu göstermiştir 9,10,11,12,13,14,15,16.
Mitokondriyal genomun kanser progresyonundaki belirgin ilgisine rağmen, bu mutasyonların incelenmesi ve hastalığa katkıları, şu anda mevcut olan deneysel modellerdeki ve teknolojilerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmuştur17. Bu nedenle, mitokondri DNA'sının kanser hastalığının gelişimi ve ilerlemesindeki gerçek etkisini anlamak için yeni tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, geleneksel sibridizasyon yöntemlerinin ana zorluklarının üstesinden gelen, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden transmitokondriyal sibrid üretimi için bir protokol sunuyoruz18,19. Bu metodoloji, karşılık gelen ρ0 hücre hattının mevcudiyetine bakılmaksızın herhangi bir çekirdek donörünün kullanılmasına ve geleneksel teknikleri izleyerek enükleasyonu zor olan hücrelerden mitokondri transferine (yani, yapışkan olmayan hücre hatları) izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm kültür ortamları ve tampon bileşimleri Tablo 1'de belirtilmiştir. Sibrid üretiminden önce, hücre hatları arasındaki her iki genomda genetik farklılıkların varlığını doğrulamak için donör ve alıcı hücrelerden hem mitokondriyal hem de nükleer DNA profilleri yazılmalıdır. Bu çalışmada, ticari olarak temin edilebilen bir L929 hücre hattı ve laboratuvarımızda kendiliğinden oluşan türetilmiş hücre hattı L929dt kullanılmıştır (daha fazla bilgi içinbkz. 13 ). Bu hücre hatları, mt-Nd2 genlerinin dizisinde, sibridizasyon işlemi tamamlandıktan sonra mtDNA'nın saflığını doğrulamak için kullanılabilecek iki farklılık gösterir13. Bu durumda, nükleer arka planın saflığı antibiyotik duyarlılığı ile doğrulandı, çünkü L929dt hücrelerinin aksine, L929 genetisine dirençliydi.
1. Rodamin 6G tedavisi ile mitokondriyal tükenme (alıcı hücreler)
NOT: Başarılı cybrid üretimi için ilk adım, alıcı hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonları tamamen ve geri dönüşümsüz olarak ortadan kaldırmaktır. Bu amaçla, her hücre hattı için rodamin 6G ile uygun konsantrasyon ve tedavi süresinin önceden belirlenmesi gerekmektedir. Bu yeterli konsantrasyon, ilaca bağlı hücre ölümünün hemen altında olmalıdır (tedavi sırasında hücreleri öldürmeyen en yüksek seviye). En uygun koşullar tanımlandıktan sonra aşağıdakileri gerçekleştirin.
- Tohum 10 6 hücreyi6 delikli bir plakada tam kültür ortamı kullanarak (ayrıntılar için Tablo 1'e bakın) ve hücre hattına bağlı olarak 3-10 gün boyunca 3-10 gün boyunca optimum rodamin 6G konsantrasyonu ile günlük olarak muamele edin. Geleneksel konsantrasyonlar 3-10 gün boyunca 2 ila 5 μg / mL arasında değişir20,21. Bu çalışmada, L929 türevi hücreler için, 7 gün boyunca 2.5 μg / mL rhodamine 6G, seçilen tedavi13,22 idi.
- Hücreleri canlı tutmak için, hücre kültürü ortamını 50 μg / mL idrar ve 100 μg / mL piruvat ile destekleyin ve her 24 saatte bir yenileyin.
- Tedaviden sonra ve füzyondan önce, rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin ortamını, rhodamine 6G olmadan hücre kültürü ortamını tamamlamak için değiştirin ve bunları% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde 3-4 saat boyunca bu ortamda bırakın.
NOT: Rodamin 6G toksik etkisi geri dönüşümsüzdür ve fonksiyonel olmayan mitokondrili hücreler20'yi geri kazanmamalıdır. Bu nedenle, tedaviden sonra, fonksiyonel mitokondri almayan hücreler, idrar takviyeli kültür ortamında bile ölmelidir. Bu nedenle, nükleer seleksiyon gerekli olmamalıdır. Bununla birlikte, mitokondri olmadan rodamin 6G ile tedavi edilen hücrelerin kontrol füzyonu önerilir.
2. Genleşme ve mitokondriyal izolasyon (donör hücreler)
- Yaklaşık 25 x 106 hücre elde etmek için rodamin 6G tedavisinin zaman atlaması sırasında mitokondri donör hücrelerini genişletin.
- 7. günde, 50 mL'lik bir tüpte katlanarak büyüyen hücreleri hasat edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın. Hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme ile çökeltin. Şu andan itibaren, soğuk reaktifler kullanarak ve tüpleri buz üzerinde hücreler veya mitokondri ile tutarak mitokondriyal ekstraksiyonun tüm adımlarını 4 ° C'de gerçekleştirin.
- Üçüncü santrifüjlemeden sonra, bir vakum pompasına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspirasyon yoluyla atın ve paketlenmiş hücreleri, hücre pelet hacminin 7 katına eşit bir hipotonik tampon hacminde yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu bir homojenizatör tüpüne aktarın ve hücrelerin 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek şişmesine izin verin.
- 600 rpm'de dönen motor tahrikli bir havaneyle bağlı homojenizatörde 8 ila 10 strok gerçekleştirerek hücre zarlarını kırın.
NOT: Hücre zarı bozulmasının adımı hücre tipleri arasında değişebilir; Bu nedenle, her hücre tipi için optimize edilmelidir. - İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna aynı hacimde hipertonik tampon ekleyin (hücre pelet hacminin 7 katı).
- Homojenatı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de sabit bir rotorda santrifüj edin. Daha sonra, çekirdeklerle veya sağlam hücrelerle kontaminasyonu önlemek için peletten büyük bir marj bırakarak süpernatantın sadece 3 / 4'ünü toplayın ve başka bir tüpe aktarın. Aynı işlemi iki kez tekrarlayın. Süpernatantın tutulması ve peletin atılması gerektiğini unutmayın.
- Mitokondriyal fraksiyonu (süpernatan) kaydedin. 1,5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca maksimum hızda (18.000 x g) santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti tampon A ile yıkayın, iki tüpün içeriğini bir araya getirin ve adım 2.7'de tarif edildiği gibi aynı koşullarda santrifüj yapın. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
- 300 μL tampon A ile ek bir yıkama yapın ve Bradford tahlili23'ü kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Her bir sibridizasyon testi için, transfer prosedürü için en uygun mitokondri miktarı belirlenmelidir (bizim durumumuzda, 106 hücre başına 10-40 μg mitokondriyal protein arasında bir konsantrasyon).
- Aynı zamanda, rhodamine 6G ile önceden işlenmiş hücreleri, 15 mL'lik bir tüpte toplayarak ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yaparak füzyon için hazırlayın.
- Hem reseptör hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ortadan kaldırılmasının hem de donörlerden organel saflaştırmasının uygun şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için, az sayıda rodamin 6G ile muamele edilmiş hücreleri ve izole edilmiş mitokondrileri, 6 kuyucuklu bir plakada tam kültür ortamını kullanarak tohumlayın ve kuyucukların hiçbirinde hayatta kalan hücrelerin kalmadığını kontrol etmek için bir ay boyunca kültürleyin (Şekil 2).
- Buna paralel olarak, mitokondriyal fraksiyondaki çekirdek kirleticilerinin yokluğunu, nükleer proteinlerin (yani, lamin beta, histon H3, vb.) immünotespiti veya bir nükleer genin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) amplifikasyonu (yani, SDH, 18S rRNA, vb.)
NOT: Kontaminasyonları önlemek için, laminer akış davlumbaz altında çalışan aseptik koşullarda tüm adımların gerçekleştirilmesi önerilir.
3. Füzyon ve cybrid üretimi
- Füzyona devam etmek için, izole mitokondri pelletine (10-40 μg mitokondriyal protein) rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin 106'sını dikkatlice ekleyin ve hücrelerin mitokondri ile karışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yapın.
- 100 μL polietilen glikol (PEG,% 50) ekleyin ve peleti 30 s boyunca hafifçe askıya alın. Ardından, 30 saniye daha el değmeden dinlenmeye bırakın.
- Son olarak, karışımı taze tam hücre kültürü ortamına sahip 6 delikli bir plakaya aktarın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin. Birkaç gün sonra (genellikle 1 hafta), transmitokondriyal sibritler büyümeye başlamalıdır (Şekil 2), bu da analizlerinden önce ayrı ayrı seçilebilen veya bir havuzda karıştırılabilen klonlara yol açmalıdır.
4. Hem mitokondriyal hem de nükleer arka planın doğrulanması
NOT: Yeni hücre hattı kurulduktan ve hücreler katlanarak büyümeye başladıktan sonra, mitokondriyal ve nükleer DNA'larının saflığı doğrulanmalıdır. Bu nedenle, orijinal hücre hatları, tanınabilir hale getirmek için genomlarında farklı mutasyonlar veya polimorfizmler barındırmalıdır.
- Toplam DNA izolasyonu
- Ticari bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya fenol-kloroform-izoamil alkol ekstraksiyonu ve alkol çökeltme24 kullanarak standart bir protokol uygulayarak cybrid üretimi için kullanılan tüm hücre hatlarının genomik DNA'sını izole edin.
- mtDNA değerlendirmesi (Şekil 3)
NOT: mtDNA'nın saflığını analiz etmek için dizileme, kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) analizi veya alele özgü qPCR gibi çeşitli teknikler gerçekleştirilebilir. RFLP tarafından mtDNA dizi varyasyonlarının varlığını doğrulamak için, sonraki protokol adımlarını izleyin.- PCR ile nükleotid değişimini içeren bir mtDNA fragmanını güçlendirin.
- Burada, L929dt hücreleri, L929 hücrelerinde bulunmayan bir mt-Nd2 geni (m.4206C>T) içinde, 4206 pozisyonunda bir mtDNA mutasyonu sunar. İletimkokondriyal sibritlerde bu ikamenin varlığını doğrulamak için, standart bir protokol ve aşağıdaki primerleri kullanarak PCR ile 397 bp'lik bir parçayı yükseltin: 1) 5'-AAGCTATCGGG
CCCATACCCCG-3' (3862-3884 pozisyonları) ve 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGGCG -3' (4236-4258 pozisyonları).
- Burada, L929dt hücreleri, L929 hücrelerinde bulunmayan bir mt-Nd2 geni (m.4206C>T) içinde, 4206 pozisyonunda bir mtDNA mutasyonu sunar. İletimkokondriyal sibritlerde bu ikamenin varlığını doğrulamak için, standart bir protokol ve aşağıdaki primerleri kullanarak PCR ile 397 bp'lik bir parçayı yükseltin: 1) 5'-AAGCTATCGGG
- İstenilen nükleotid ikamesinin RFLP ile varlığını, dizi değişimini tanıyan ve her iki hücre çizgisi için farklı bir kesim paterni oluşturan spesifik bir endonükleaz kullanarak analiz edin.
NOT: L929dt mtDNA varyantı mevcut olduğunda (4206T), adım 4.2.1'de elde edilen amplikon, 306 bp, 52 bp ve 39 bp'lik üç DNA parçası üreten SspI için iki kısıtlama bölgesi içerir (bkz. 52 ve 39 bantlarını oluşturan kısıtlama sitesi, vahşi tip (WT) sürüm C4206 mevcut olduğunda ve 91 bp'lik yeni bir bant göründüğünde bozulur. Bu nedenle, SspI için tam sindirim için bir iç kontrol analize dahil edilmiştir. Sindirim reaksiyonu, üreticinin talimatlarını izleyerek 37 ° C'de gerçekleştirilir. - Kısıtlama parçalarını elektroforez ile ayırın ve bant desenini karşılaştırın.
- Sindirim yapıldıktan sonra, elde edilen kısıtlama parçalarını% 10 poliakrilamid-Tris-borat-EDTA (TBE) jellerinde elektroforez ile analiz edin (1x TBE bileşimi için Tablo 1'e bakınız). RT'de 15 dakika boyunca 1x TBE'de bir ethidyum bromür çözeltisinde jel boyamadan sonra DNA fragmanlarını görselleştirin (jel boyama çözeltisi bileşimi için Tablo 1'e bakınız).
- PCR ile nükleotid değişimini içeren bir mtDNA fragmanını güçlendirin.
- Nükleer DNA genotiplemesi
NOT: Nükleer DNA genotiplemesi, RFLP analizi için kullanılan önceki DNA ekstraksiyon örneği kullanılarak yapılmalıdır.- Ticariye özgü oligonükleotidlerden oluşan bir havuz kullanarak 16 lokusu (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ve AMEL) güçlendirin (bkz.
- Daha önce elde edilen parçaları ayırmak için genetik bir analizör kullanarak elektroforez yapın.
NOT: Güçlendirildikten sonra, farklı lokuslar kapiler bir sistem kullanılarak elektroforez ile analiz edilir (bakınız Malzeme Tablosu). Parçalar, ticari bir polimerle doldurulmuş 50 cm uzunluğunda bir kapiler içinde ayrılır. Katot ve anot tamponları, Malzeme Tablosunda gösterildiği gibi ticari olarak da temin edilebilir. Elektroforez 19.5 kV'de 60 °C'de 20 dakika süreyle uygulanır. - Her bir güçlendirilmiş lokusa karşılık gelen alelleri belirlemek için biyoinformatik araçlar kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Nükleer DNA profilinin mitokondri reseptör hücre hattı profili ile eşleşip eşleşmediğini kontrol etmek için adım 4.3.3'te elde edilen verileri nükleer DNA profili veritabanı (Tablo 1) ile karşılaştırın (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda sunulan protokolü izledikten sonra, korunmuş bir nükleer arka plana sahip, ancak yeni bir mitokondri genotipine sahip bir homoplazmik cybrid hücre hattı, Şekil 1 ve Şekil 2'deki şemalarda gösterildiği gibi elde edilmelidir. Sibritlerde bulunan mitokondriyal ve nükleer DNA'nın saflığı, Şekil 3'te gösterildiği gibi RFLP ve Şekil 4'te gösterildiği gibi nükleer DNA genotipleme analizi ile doğrulanabilir.
Mitokondriyal transfer başarılı bir şekilde yapılmışsa, cybrid hücre hattı için RFLP analizi ile elde edilen sonuçlar, alıcı hücre hattına kıyasla farklı sindirim bandı paternleri göstermeli ve mitokondri donör hücre hattıyla aynı olmalıdır. Bu amaçla, restriksiyon enzimi dikkatlice seçilmeli ve sindirimden elde edilen bant paternlerinin her iki hücre hattında da farklı olduğundan emin olunmalıdır. WT mitokondri ve mutant mitokondride (MUT) SspI sindiriminden sonra elde edilen kısıtlama fragmanlarının gösterildiği bir örnek Şekil 3'te verilmiştir. Yeni transmitokondriyal hücre hatları söz konusu olduğunda, kısıtlama fragmanları kendi mitokondriyal donörlerinde elde edilenlerle aynıydı ve çekirdek donör hücre amplikonlarıyla üretilenlerden farklıydı. Böylece, bu tahlil mitokondriyal değişimin beklendiği gibi yapıldığını doğrulamaktadır. Not olarak, sindirim prosedürüne tabi tutulmayan alıcı hücrelerden alınan bir örnek, bu analize negatif bir kontrol olarak dahil edilmiştir.
DNA nükleer genotiplemesi ile ilgili olarak, bu protokolde kullanılan hücre hatlarından biri için 16 nükleer lokusun analizinden elde edilen tipik bir profil Şekil 4'te gösterilmiştir. RFLP'ye benzer şekilde, her lokus için elde edilen pikleri karşılaştırarak, mitokondri reseptör hücre hattından (nükleer donör) elde edilen sonuçlar, üretilen sibrit ile eşleşmelidir.
Elde edilen sonuçların farklı faktörlere göre değişebileceğini belirtmek önemlidir. Protokolde belirttiğimiz gibi, tüm hücre hatları, fonksiyonel mitokondrinin bütünlüğünü ortadan kaldırmak için aynı miktarda rodamin 6G'ye duyarlı değildir.
Şekil 1: Protokolün 1 ila 3. adımlarını özetleyen cybrid üretiminin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cybridization protokolünden sonra hücre kültürü plakasının tasarımını gösteren şematik gösterim. Yeni bir cybrid hücre hattı ve kontrolleri (izole mitokondri ve rodamin 6G ile muamele edilen alıcı hücreler) 6 delikli bir plakada ayrı ayrı ekilir. Birkaç günlük kültürden sonra, cybrid hücreleri büyümeye başlar, oysa kontrol kuyularında hayatta kalan hiçbir hücre kalmaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sibritlerin moleküler karakterizasyonu. (A) Mitokondriyal donör hücre hatlarındaki (WT ve MUT, sırasıyla şerit 3 ve 4) ve bunların ilgili iletim>ondriyal hücre hatlarındaki (MUT WT→ şerit 5 ve WTMUT → şerit 6) m.4206CT mutasyonunun RFLP analizi. MW: moleküler ağırlık belirteci (şerit 1); kesilmemiş: sindirilmemiş PCR ürünü (şerit 2). (B) WT ve MUT mitokondri için PCR ürününün SspI kısıtlama haritaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nükleer DNA arka plan analizinin temsili sonuçları. 16 lokusun PCR amplifikasyonu ve kapiler elektroforez ile ayrılmasından sonra elde edilen nükleer DNA parmak izi örneği. Şekil, bir hücre hattının her yükseltilmiş lokusu için karakteristik tepe desenini göstermektedir. Bu model, nükleer DNA saflığını doğrulamak için sibridizasyon protokolünde kullanılan iki hücre çizgisi için farklı olmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Orta | Kompozisyon | ||
| Komple kültür ortamı | L-Gln ve piruvat içeren DMEM yüksek glikoz + FBS (% 10) + Penisilin-Streptomisin (1x) | ||
| Hipotonik tampon | 10 mM MOPS, 83 mM sakaroz, pH 7,2 | ||
| Hipertonik tampon | 30 mM MOPS, 250 mM sakaroz, pH 7,2 | ||
| Arabellek A | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sakaroz, pH 7,4 | ||
| TBE (1x) | 50 mM Tris, 50 mM Borik asit; 1 mM EDTA | ||
| Jel boyama çözeltisi | 1x TBE'de 0.75 μg/mL Ethidyum bromür | ||
Tablo 1: Arabellekler ve ortam bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Otto Warburg, kanser hücrelerinin metabolizmalarını değiştirdiğini ve mitokondriyal solunumu azaltırken "aerobik glikoliz"i3,4 güçlendirdiğini bildirdiğinden, mitokondrinin kanser dönüşümü ve ilerlemesindeki rolüne olan ilgi katlanarak artmıştır. Son yıllarda, mtDNA'daki mutasyonlar ve mitokondriyal disfonksiyon, birçok kanser tipi25'in ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, çok sayıda çalışma, spesifik tümörlerin mtDNA varyasyonunu analiz etmiştir 6,26,27,28,29,30,31,32 ve edinilmiş mtDNA mutasyonlarının toplam yükü, prostat kanseri gibi kanserlerde tümörojenitenin biyobelirteci olarak kabul edilmiştir 30 33. Buna paralel olarak, mtDNA mutasyonları meme 34,35 veya pankreas36 kanseri, jinekolojik maligniteler 37,38, akciğer adenokarsinomu metastazları 15,39 veya akut miyeloid lösemi 40,41 gibi bazı durumlarda tümör başlatıcıları olarak kabul edilirken, glioblastomlarda 42 daha az ilgili görünmektedir.
Birçok kanser, sağlıklı dokularda bulunmayan ciddi mtDNA mutasyonlarını barındırmasına rağmen,43 ve kanser başlangıcına katkıda bulunabilecek30, diğerleri ise çeşitli insan popülasyonlarında yaygın olan polimorfik mtDNA varyantları sunmaktadır. Bu varyantlar, dönüşüm süreci başlatıldıktan sonra kanser hücresi adaptasyonu için önemli olabilecek daha hafif değişiklikleri teşvik eder30. Her durumda, mtDNA mutasyonları ve mitokondriyal metabolizma değişiklikleri, reaktif oksijen türlerinin üretimi veya redoks durumu44,45,46 gibi hücre homeostazının farklı yönlerini değiştiren tümör progresyonunda rol oynar. Bununla birlikte, mtDNA mutasyonlarının ve varyantlarının tümörigenezi destekleyebileceği mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, kanser hücrelerindeki mtDNA mutasyonları, nükleer genlerdekideğişikliklerle birlikte bulunabilir 8,33, bu da hangisinin sürücü mutasyon olduğunu belirlemeyi zorlaştırır. Diğer durumlarda, tümör hücrelerinin biyoenerjetik gereksinimleri,mtDNA kopya numarası 47'yi modüle ederek elde edilir. Öte yandan, bazı durumlarda, mtDNA mutasyonları tümör hücrelerini spesifik anti-tümör ilaçlarına karşı daha duyarlı hale getirebilir48.
MtDNA mutasyonlarının kanser patofizyolojisindeki rolünü tam olarak anlamak için, mutasyona uğramış mitokondrilerin kontrollü bir nükleer ortamda analiz edilebileceği metodolojiler geliştirmek gerekir. Bu, hücresel adaptasyonu tetikleyebilecek nükleer genlerin telafi edici etkilerinden kaçınmaya yardımcı olabilir. Bu amaçla, transmitokondriyal sibritler uygun bir modeli temsil eder. Geleneksel sibridizasyon yöntemleri, bir çekirdek donörü (ve dolayısıyla mitokondri reseptörü) ve bir mitokondri donörü, genellikle enüklee edilmiş bir hücre hattı veya trombositler19 olarak işlev gören bir mtDNA tükenmiş hücre hattını (ρ0 hücreleri) içerir. mtDNA varyantlarını veya ilgilenilen mutasyonları taşır. Cybrids üretmeye çalışırken çözülmesi gereken ilk zorluk, tercih edilen nükleer arka planı barındıran ρ0 hücrelerinin mevcudiyetidir. Bu hücrelerin obtensiyonu, mtDNA replikasyonunu inhibe eden kimyasal bir bileşik olan ethidium bromür ile uzun süreli tedaviyi içerir. Bununla birlikte, nükleer genom içinde, incelenecek mitokondriyal değişikliklerin etkilerini maskeleyebilecek mutasyonların oluşumunu da indükleyebilir. Bu nedenle, bu çalışmada, mitokondriye geri dönüşümsüz olarak zarar veren ve sitoplazmalarına taze mitokondri sokulmadıkça hücreleri öldürecek bir ilaç olan rodamin 6G ile muamele edilerek çekirdek donör hücre hatlarındaki tüm mitokondrinin ortadan kaldırılmasını öneriyoruz21,22,49.
Geleneksel cybrid üretim yöntemlerindeki bir diğer zorluk, mitokondriyal donör hücrelerin enükleasyon süreci ile ilgilidir. Bu amaçla, yapışkan hücreler, sitoiskeletin dağınıklığını teşvik ederek enükleasyonlu sitoplastların18'in izolasyonuna izin veren sitokalasin B varlığında santrifüj edilir. Hücreler süspansiyonda büyürse (hematolojik çizgiler gibi) veya hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matriks yapışmasını kaybetmişse (ki bu daha yüksek metastatik potansiyele sahip olanlara 50,51,52 olabilir), bu enükleasyon protokolü tehlikeye girer, çünkü sitoplastlar çekirdekleri çıkarmak için santrifüjleme sırasında plakadan ayrılır ve sonraki füzyon prosedürü için havuzlarını büyük ölçüde azaltır. Her iki zorluğun üstesinden gelmek için, burada izole mitokondrilerin PEG varlığında rodamin 6G önceden işlenmiş hücrelerle kaynaştırıldığı, zaman kazandıran ve verimli olduğu kanıtlanmış bir protokol öneriyoruz21,22,49.
İletimkokondriyal hücre hatları oluşturulduktan sonra, hem mitokondriyal hem de nükleer genomların saflığını değerlendirmek çok önemlidir. Bu nedenle, mitokondriyal DNA'larında sekans farklılıkları olan ve antibiyotik direnci veya diferansiyel mikrosattelitler gibi ayırt edilebilir özelliklere sahip donör hücre hatlarını seçmek çok önemlidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, bazı kanserlerin mtDNA kopya numarası47'yi modüle ettiği bildirilmiştir, bu da mtDNA yükünü hem orijinal hem de transmitokondriyal hücre hatlarında analiz etmenin ve benzer koşullar altında OXPHOS performanslarını incelemenin önemini kanıtlamaktadır.
Bu prosedürde gizlenen ana tuzaklar, rodamin 6G ile mitokondri eliminasyonu süreciyle bağlantılıdır. Her sibridizasyon deneyinden önce, seçilen çekirdek donör hücre hattı için ilaç konsantrasyonunun ve tedavi süresinin optimal koşullarını belirlemek için testler yapılmalıdır. Rodamin 6G konsantrasyonu veya açığa çıkma süresi yeterli değilse, yeni hücre hattı, fenotipik analize daha fazla karmaşıklık katacak iki farklı mtDNA'nın katkısına sahip olacaktır. Dahası, zaman veya doz optimal olanları aşarsa, hücreler mitokondri repopulasyonundan sonra bile hayatta kalamazlar. Son olarak, fenotipik karakterizasyonu değiştirebilecek kırılmamış hücrelerle kontaminasyonu önlemek için mitokondri izolasyon işlemi sırasında dikkatli olmak önemlidir.
Teknik zorluklara rağmen, transmitokokondriyal sibritlerin üretimi, kanser ve metastaz süreçlerine mitokondriyal katkıyı çözmek ve mitokondrileri terapötik bir hedef olarak kullanan potansiyel antikanser tedavilerinin test edilebileceği hücre modelleri oluşturmak için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, RSA, JMB ve AA'ya PID2019-105128RB-I00 hibe numarası ve PFS ve RML'ye PGC2018-095795-B-I00 hibe numarası ile finanse edilmiş, her ikisi de MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ve hibe numaraları B31_20R (RSA, JMA ve AA) ve E35_17R (PFS ve RML) tarafından finanse edilmiş ve Gobierno de Aragón tarafından finanse edilmiştir. RSA'nın çalışmaları, Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE'den bir hibe ile desteklendi. Yazarlar, Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza'nın kullanımını kabul etmek ister.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D.
- Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O.
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C.
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T.
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A.
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S.
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C.
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V.
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
